狼瘡性腎炎病人腎臟巨噬細(xì)胞浸潤與血和尿TNF-α水平的關(guān)系

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科,山東 青島 266003)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)多見于青年女性，是一種自身免疫性疾病，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，主要特征是產(chǎn)生大量自身抗體以及多系統(tǒng)受累。腎臟為其最常見和嚴(yán)重的損害器官，腎活檢顯示SLE幾乎全部存在腎臟受累[1]，其中50%～80%有腎炎表現(xiàn)，即為狼瘡性腎炎(LN)。LN嚴(yán)重影響病人預(yù)后，因此及時(shí)有效地診斷及治療至關(guān)重要。免疫調(diào)節(jié)失衡與炎癥反應(yīng)是LN的主要特征，同時(shí)也是LN的重要發(fā)病機(jī)制[2]。而巨噬細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是炎癥反應(yīng)中最主要的調(diào)節(jié)細(xì)胞和免疫反應(yīng)中最重要的吞噬細(xì)胞，已證實(shí)活化的巨噬細(xì)胞在LN 的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵性作用。巨噬細(xì)胞可以直接損傷腎臟固有細(xì)胞，還可以分泌多種細(xì)胞因子導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤和廣泛的細(xì)胞增生。有研究結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞廣泛參與LN小鼠的增生性病變，若特異性地清除巨噬細(xì)胞則可明顯抑制LN的增生性病變[3]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及T淋巴細(xì)胞等分泌，在免疫細(xì)胞間起著相互聯(lián)系的介導(dǎo)作用[4]，決定免疫應(yīng)答的性質(zhì)，因此研究TNF-α在LN中的表達(dá)具有重要的臨床價(jià)值。目前，國內(nèi)有關(guān)LN病人腎組織中巨噬細(xì)胞浸潤與血清、尿液TNF-α水平關(guān)系的研究報(bào)道甚少。故本研究對二者的關(guān)系進(jìn)行了分析，旨在進(jìn)一步探討LN的發(fā)病機(jī)制，為LN病人提供活動性預(yù)測及藥物治療反應(yīng)性評估的無創(chuàng)性指標(biāo)。

1 對象和方法

1.1 研究對象

2017年12月—2019年6月，青島大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科及風(fēng)濕免疫科收治的有完整病情記錄的LN病人60例(年齡≥18歲)。60例LN病人均符合美國風(fēng)濕協(xié)會SLE的分類診斷標(biāo)準(zhǔn)且經(jīng)腎穿刺活檢術(shù)證實(shí)為LN[5]。所有病人均無類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、感染性疾病等，非妊娠及哺乳期婦女，均無腎臟原發(fā)性損害及糖尿病、高血壓等繼發(fā)的腎臟損害，近3個(gè)月內(nèi)無服用免疫抑制劑史或3個(gè)月內(nèi)使用潑尼松的劑量<30 mg/d。60例病人，男18例，女42例，平均年齡(32.30±9.41)歲。根據(jù)LN病理類型將病人分為Ⅲ型組12例，Ⅳ型組18例，Ⅴ型組16例，Ⅴ+Ⅳ型組14例。根據(jù)疾病活動性(SLEDAI≥9分定義為SLE疾病活動)將病人分為活動組34例和非活動組26例。另選擇10例腎組織正常的病人作為對照組(腎組織標(biāo)本為外傷手術(shù)標(biāo)本及腎移植供腎活檢標(biāo)本)，均無其他原發(fā)性及繼發(fā)性引起腎損害的情況。對照組10例病人，男3例，女7例，平均年齡(30.40±6.45)歲。LN組病人與對照組性別、年齡比較差異均無顯著性(P>0.05)。

1.2 血、尿及腎組織標(biāo)本采集

所有研究對象于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集上肢靜脈血3 mL，分離血清置于-80 ℃凍存待用；收集所有研究對象晨起中段尿10 mL，離心后置于-80 ℃凍存待用。LN病人均行腎組織活檢術(shù)采集腎組織標(biāo)本。在穿刺前告知腎組織活檢術(shù)必要性及相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，病人及家屬同意后簽訂知情同意書。病人俯臥于硬板床上，在B超下定位，標(biāo)記穿刺部位，常規(guī)皮膚消毒，鋪無菌洞巾，以10 g/L利多卡因局部麻醉，用穿刺針快速取得1 cm左右腎組織1～2條，用40 g/L甲醛固定，石蠟包埋后制成2 μm厚切片。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測腎組織巨噬細(xì)胞的浸潤

腎組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后，用枸櫞酸鈉修復(fù)液微波熱修復(fù)10 min，冷卻后洗片3次，每次7 min。用體積分?jǐn)?shù)0.03的過氧化氫溶液浸泡組織10 min，洗片后加入10 g/L的BSA 30 μL，37 ℃孵育1 h。洗片后加入CD68單克隆抗體(1∶50，Santa Cruz，美國)30 μL，37 ℃孵育1.5 h。洗片后加入山羊抗鼠HRP酶標(biāo)二抗(1∶500，abcam，英國)30 μL，37 ℃恒溫孵育20 min。洗片后加入DAB底物30 μL避光孵育5 min進(jìn)行顯色，顯色結(jié)束后用自來水輕洗5 min。用蘇木精染核30 s，自來水輕洗5 min。脫水、封片，光鏡下觀察，攝片保存，應(yīng)用圖像軟件進(jìn)行圖像半定量分析。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清、尿液TNF-α水平

應(yīng)用人TNF-α ELISA試劑盒(Elabscience Biotechnology Co., Ltd)，采用雙抗體夾心法測定血清、尿液中TNF-α表達(dá)水平，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)檢測

對照組腎組織中幾乎無巨噬細(xì)胞浸潤(圖1A)，LN病人與對照組腎臟比較有明顯的巨噬細(xì)胞浸潤(圖1B～E)，巨噬細(xì)胞主要分布于腎小球且呈散在或者簇狀分布，腎小管間質(zhì)中較少浸潤。對照組、LN活動組和LN非活動組CD68+細(xì)胞數(shù)分別為1.26±0.59、45.01±21.43和9.18±2.20。LN病人腎組織巨噬細(xì)胞浸潤程度較對照組明顯增高，且活動組明顯高于非活動組(F=56.085，P<0.01)。不同病理類型組間比較，Ⅳ型組LN 病人腎組織中有明顯巨噬細(xì)胞浸潤，且其浸潤程度與Ⅲ型、Ⅴ型及Ⅴ+Ⅳ型組LN病人比較差異均有顯著意義(F=67.977，P<0.01)，而Ⅲ型組和Ⅴ型組LN病人間差異不明顯(圖1F)。

A～E：免疫組化染色，400倍。A：對照組；B：Ⅲ型組；C：Ⅳ型組；D：Ⅴ型組；E：Ⅴ+Ⅳ型組。F：各組腎組織巨噬細(xì)胞浸潤情況比較。與對照組比較，*P<0.01；與Ⅳ型組比較，#P<0.01。

2.2 ELISA檢測

LN病人血清、尿液中TNF-α的表達(dá)水平較對照組明顯升高，且活動組明顯高于非活動組(F=50.234、52.982，P<0.01)。不同病理類型組間比較，Ⅳ型組病人血清、尿液中TNF-α水平較Ⅲ型、Ⅴ型及Ⅴ+Ⅳ型組明顯增高，Ⅴ+Ⅳ型組病人尿液中TNF-α水平較Ⅲ型組明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=53.103、68.381，P<0.01)。見表1、2。

表1 不同病理類型各組血清及尿液TNF-α水平比較

表2 不同疾病活動性各組血清及尿液TNF-α水平比較

2.3 腎組織巨噬細(xì)胞浸潤與血清、尿液TNF-α水平的相關(guān)性

Pearson直線相關(guān)分析顯示，LN病人腎組織巨噬細(xì)胞浸潤與血清、尿液TNF-α水平有顯著相關(guān)性(r=0.728、0.716，P<0.01)。

3 討 論

LN是SLE病人最常見的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響SLE病人的預(yù)后，因此探討其具體發(fā)病機(jī)制和尋求新的治療方法尤為重要。LN的臨床表現(xiàn)多樣，從單純性蛋白尿至腎炎綜合征、腎病綜合征、急進(jìn)型腎炎和腎衰竭等[6]，與腎臟病理的多樣性相平行。目前蛋白尿仍是LN病人疾病活動最主要的臨床表現(xiàn)，也是影響病人預(yù)后的重要指標(biāo)。尋找新的相關(guān)生物標(biāo)記物對LN活動性預(yù)測、疾病治療及預(yù)后評估有重要意義。近年來，腎臟疾病中巨噬細(xì)胞的浸潤受到越來越多的關(guān)注，在大多數(shù)腎臟病中巨噬細(xì)胞起著重要作用，巨噬細(xì)胞浸潤與腎組織受損(新月體形成、腎間質(zhì)纖維化等)、尿蛋白水平及腎功能減退等明顯相關(guān)。本課題組前期研究顯示，巨噬細(xì)胞是介導(dǎo)LN病人腎組織損傷的重要細(xì)胞，與LN病變嚴(yán)重程度有密切關(guān)系[7]，尤其在活動期病人中表現(xiàn)格外明顯，且干預(yù)巨噬細(xì)胞在腎組織的浸潤能夠改善這種腎臟損傷[8]。不同病理類型LN病人，特別是表現(xiàn)為彌漫增殖性病變的Ⅳ型LN病人和表現(xiàn)為膜性病變的Ⅴ型LN病人，其臨床特征和病理表現(xiàn)相差甚大，提示其免疫發(fā)病可能存在不同的機(jī)制。本課題組前期研究顯示，與對照組腎臟相比較，LN病人腎小球中巨噬細(xì)胞浸潤明顯增多，腎臟中巨噬細(xì)胞的大量浸潤是引起腎組織學(xué)病變的機(jī)制之一[9]。本文研究顯示，LN病人腎臟巨噬細(xì)胞浸潤較對照組明顯增加，且不同病理類型的LN巨噬細(xì)胞浸潤程度不同。Ⅳ型LN的活動性明顯高于其他類型LN，且病人腎組織巨噬細(xì)胞浸潤程度高于Ⅲ型、Ⅴ型及Ⅴ+Ⅳ型LN，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明不同病理類型LN的發(fā)病機(jī)制、疾病活動性及嚴(yán)重程度有很大差異。LN活動組與非活動組巨噬細(xì)胞浸潤亦有明顯差異，提示巨噬細(xì)胞浸潤參與LN發(fā)病且其浸潤程度可能與疾病的活動性有關(guān)[10]。

TNF-α能抑制急性自身反應(yīng)淋巴細(xì)胞的正常生理作用，致使機(jī)體內(nèi)淋巴細(xì)胞在發(fā)育過程中出現(xiàn)凋亡異常從而導(dǎo)致自身耐受平衡被破壞，然后通過自分泌途徑誘導(dǎo)多種免疫細(xì)胞因子，激活以及產(chǎn)生一系列自身抗體致使多臟器免疫損傷。國內(nèi)外新近研究證實(shí)，TNF-α在自身免疫反應(yīng)與炎癥反應(yīng)的調(diào)控中至關(guān)重要[11-12]，且在LN的異常免疫調(diào)節(jié)中亦起到了重要的作用，與LN的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有著密切聯(lián)系[13]，其可能成為早期預(yù)測LN發(fā)生的相關(guān)標(biāo)志。本文的研究結(jié)果顯示，LN病人血清和尿液的TNF-α表達(dá)水平明顯升高，且與腎組織巨噬細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)，活動期的LN與非活動期相比較，TNF-α表達(dá)亦明顯升高，表明腎組織TNF-α高表達(dá)在LN的發(fā)病過程中同樣發(fā)揮重要作用[14]，并與LN的疾病活動性密切相關(guān)，提示TNF-α可能通過促進(jìn)LN病人腎臟的巨噬細(xì)胞浸潤引起疾病發(fā)生及腎臟損傷。

綜上所述，LN病人發(fā)病與免疫調(diào)節(jié)失衡有密切聯(lián)系，其中包括巨噬細(xì)胞的腎臟浸潤，且浸潤程度與疾病活動性密切相關(guān)。LN病人巨噬細(xì)胞浸潤與血清、尿液的TNF-α水平呈正相關(guān)，提示血清、尿液TNF-α水平可能成為判斷病人疾病活動性及嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一。雖然巨噬細(xì)胞與LN的發(fā)病機(jī)制有密切聯(lián)系，其中包括腎臟足細(xì)胞的損傷，但是不同表型巨噬細(xì)胞的浸潤對腎臟損傷的影響在國內(nèi)外研究甚少，本課題組后續(xù)將進(jìn)一步研究腎臟不同表型巨噬細(xì)胞浸潤與LN病人足細(xì)胞損傷關(guān)系，為LN的活動性預(yù)測及疾病治療提供依據(jù)。