根際硫酸鹽對擬南芥植株干旱生理的調(diào)節(jié)作用

李晉圓，郝麗宏，儀慧蘭

（山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

0 引言

干旱影響植物生長發(fā)育，是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵因素［1-2］。干旱脅迫引發(fā)植株體內(nèi)活性氧（ROS）積累，破壞細胞氧化還原平衡，高水平ROS可使生物大分子蛋白質(zhì)、核酸、膜脂等結(jié)構(gòu)損傷、功能異常，繼而影響植物生命活動［1］。作為固著生長的植物，遭遇干旱脅迫時，機體會迅速感知干旱信號，發(fā)生一系列生理性應(yīng)答，如調(diào)節(jié)氣孔開度減少水分散失，激活干旱響應(yīng)基因調(diào)整細胞生理代謝過程，引發(fā)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸等積累維持細胞膨壓，誘導(dǎo)細胞抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）等活性升高、非酶抗氧化物如谷胱甘肽、抗壞血酸（AsA）等合成增加，以維持植株干旱生理［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，植株體內(nèi)SO42-分布［5］、谷胱甘肽合成、GPX活性及硫還原過程對干旱生理有直接影響［6-8］。

硫作為植物必需的大量營養(yǎng)元素，在種子萌發(fā)、生長發(fā)育、逆境響應(yīng)等生命活動中發(fā)揮著重要作用［8-9］。植物生長發(fā)育需要的硫主要是根從土壤中攝取的硫酸鹽，由氣孔進入的SO2也可作為硫營養(yǎng)的補充。植物細胞中的無機硫化合物，經(jīng)硫同化途徑合成半胱氨酸（Cys）［10］。Cys是許多重要生物分子，如蛋氨酸、谷胱甘肽等的前體物質(zhì)。谷胱甘肽作為高效抗氧化劑或信號分子參與細胞氧化還原平衡，在維持細胞穩(wěn)態(tài)中具有不可替代的作用［8］。前期我們發(fā)現(xiàn)，SO2暴露可誘導(dǎo)擬南芥和谷子植株抗氧化能力提高、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累，對干旱的適應(yīng)性增強［11-12］，同期發(fā)生的硫同化增強提供了細胞高水平的Cys、谷胱甘肽，促進了GST和GPX的高活性，在植株逆境適應(yīng)中發(fā)揮了重要作用［13］。但是，植株根際硫含量是否影響植物干旱生理少有報道。

干旱是造成農(nóng)作物減產(chǎn)的主要因素，威脅著全球的糧食生產(chǎn)安全［1］。近年來全球各地耕地缺硫的國家和地區(qū)在逐年增加［14］，因此，植物可能會同時遭遇干旱與硫營養(yǎng)缺乏，在無力實現(xiàn)灌溉的情況下是否可以通過土壤硫素調(diào)節(jié)植株干旱生理缺少研究。本文以模式生物擬南芥（ArabidopsisthalianaL.）為材料，研究根際硫水平對擬南芥干旱生理的影響，探討利用外源硫?qū)χ参锔珊瞪磉M行調(diào)節(jié)的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備及實驗處理

平板培養(yǎng)擬南芥所用培養(yǎng)基1/2 MS中包括大量元素、微量元素、鐵鹽和有機物，其中的硫素主要由MgSO4提供。以1/2 MS培養(yǎng)基中的硫濃度（0.75 mmol·L-1）為 1S，設(shè) 4 個不同硫濃度組，即1/4S、1S、3S和9S組，4組培養(yǎng)基中的硫含量分別為1S的1/4、1倍、3倍和9倍。低硫組在Mg2+總量不變的情況下調(diào)整MgSO4和MgCl2的比例來控制硫的含量，高硫組在1/2 MS培養(yǎng)基中添加無水Na2SO4達到預(yù)定硫濃度。每個硫濃度組設(shè)對照組（表示為：CK-1/4S、CK-1S、CK-3S、CK-9S）和干旱組（表示為：T-1/4S、T-1S、T-3S、T-9S）。干旱處理采用 100 mmol·L-1甘露醇模擬［15］。

取擬南芥 Columbia（Col-0）生態(tài)型種子，用15%次氯酸鈉溶液浸泡15 min，ddH2O洗滌后點播于上述制備的不同培養(yǎng)基上，每皿40粒種子。平皿于4℃春化3 d后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱，光照強度≥3 000 Lx，光/暗周期為16 h/8 h，相對濕度約60%～70%，溫度（22±1）℃。進行根長測量的平皿垂直放置于培養(yǎng)箱內(nèi)，用于其他生化指標(biāo)檢測的平皿水平放置。每個實驗設(shè)3個重復(fù)。從平皿轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱內(nèi)開始計算培養(yǎng)天數(shù)。

1.2 根長測量與根端H2O2組織化學(xué)染色

在培養(yǎng)5 d、7 d、9 d和11 d時對各組擬南芥幼苗根部拍照并用ImageJ軟件測量主根根長。取生長11 d的擬南芥幼根，參照Hu的方法［16］，進行DAB染色，光學(xué)顯微鏡觀察拍照。

1.3 相對含水量（RWC）的測定

參照王敏瑞等方法［17］，取2周齡擬南芥地上部分，稱鮮重（FW）后于蒸餾水中浸泡，達到恒重時稱重，記為飽和鮮重（TW），再于105℃殺青1 h，85℃烘至恒重，記為干重（DW），相對含水量計算公式為：

RWC（%）＝（FW-DW）/（TW-DW）×100。

1.4 生理生化指標(biāo)測定

取2周齡擬南芥地上部分，H2O2含量采用試劑盒（南京建成）測定；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定，脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測定［18］；SOD活性的測定參考楊浩等的方法［19］；Cys含量采用Gaitonde的方法［20］；總谷胱甘肽（TGSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量采用試劑盒（碧云天）測定，還原型谷胱甘肽（GSH）含量由TGSH減去GSSG獲得；GST活性測定采用Habig等的CDNB比色法［21］；GPX活性測定采用Wendel的方法［22］。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 硫?qū)M南芥幼根生長和干旱生理的影響

擬南芥根長測量發(fā)現(xiàn)，CK-1S組幼苗的主根最長，在培養(yǎng)第5 d—11 d間，CK-1S組根長增幅顯著高于其他各組（P＜0.05），與預(yù)期一致（圖 1a），說明低硫或高硫?qū)M南芥根系生長發(fā)育產(chǎn)生了不利影響；干旱組（T）主根長度顯著短于非干旱對照組（CK），且干旱條件下T-3S組主根生長較好，在生長11 d時T-3S組主根最長，與其他三組有顯著差異（P＜0.05）（圖 1b）。

DAB染色的深淺可反映植物細胞中H2O2含量的高低。如圖1c所示，CK-1S組擬南芥根部顏色最淺，與預(yù)期一致；干旱組根部顏色明顯深于非干旱對照組，且T-1S和T-3S組顏色較淺，T-1/4S和T-9S組顏色較深，表明干旱脅迫時擬南芥根部H2O2水平升高，根際硫濃度改變會影響H2O2的積累，適當(dāng)提高根際硫水平可降低干旱引發(fā)的氧化脅迫。由于T-3S組擬南芥生長較好，我們選擇1S和3S兩個硫濃度進行后續(xù)研究。

（a）非干旱；（b）干旱；（c）培養(yǎng)11 d時幼根DAB染色；CK：對照，T：干旱圖1 硫含量對擬南芥幼苗主根長度及根端H2O2積累的影響（a）Non-drought；（b）Drought；（c）DAB staining of root tips after 11-days culture.CK：Control.T：DroughtFig.1 Effect of sulfate level on root length and H2O2accumulation in root tips of Arabidopsis seedlings

2.2 硫?qū)M南芥地上部分RWC和脯氨酸含量的影響

RWC是衡量植株持水狀態(tài)的指標(biāo)，非干旱條件下擬南芥CK-1S組和CK-3S組的RWC無顯著差異（P＞0.05），干旱條件下T-1S組和T-3S組RWC顯著低于非干旱對照組（P＜0.05），且T-3S組RWC比T-1S組提高約17.4%（圖 2a），表明在本研究設(shè)計的干旱處理中擬南芥植株嚴(yán)重失水，而3S處理提高了植株的保水能力。

圖2 硫含量對擬南芥幼苗地上部分相對含水量及脯氨酸含量的影響Fig.2 Effect of sulfate level on RWC and proline contents in the shoots of Arabidopsis seedlings

干旱脅迫時植株能迅速積累脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以提高抗旱能力和抗逆性。非干旱條件下CK-1S組和CK-3S組擬南芥地上部分脯氨酸含量接近；干旱組擬南芥脯氨酸含量顯著高于非干旱對照組（P＜0.05），且T-3S組脯氨酸含量顯著高于T-1S組（P＜0.05）（圖 2b）。結(jié)果表明，根際3S能使植株在干旱條件下積累更多脯氨酸，從而有利于植株保持較高的水勢，維持較高的RWC。

2.3 硫?qū)M南芥地上部分H2O2、MDA含量和SOD活性的影響

擬南芥CK-1S與CK-3S組地上部分H2O2（圖3a）和MDA（圖 3b）含量無顯著差異（P＞0.05），說明非干旱條件下根部高硫未對植株造成氧化損傷；干旱脅迫時，擬南芥H2O2和MDA含量，以及SOD活性均顯著高于非干旱對照組（P＜0.05），但T-3S組與T-1S組相比，H2O2和MDA含量分別降低15.4%和18.6%，SOD活性顯著升高（P＜0.05）（圖3c）。以上結(jié)果表明，采用干旱脅迫誘發(fā)了擬南芥植株的氧化脅迫和氧化損傷，根際較高的硫含量（3S）有益于維持植株的氧化還原平衡，抑制干旱引起的氧化損傷，從而增強擬南芥植株對干旱的適應(yīng)性。

圖3 硫含量對擬南芥幼苗地上部分H2O2（a）、MDA含量（b）和SOD活性的影響（c）Fig.3 Effect of sulfate level on H2O2（a），MDA contents（b）and SOD activity（c）in the shoots of Arabidopsis seedlings

2.4 硫?qū)M南芥地上部分Cys和GSH含量的影響

非干旱組擬南芥CK-1S與CK-3S組地上組織中Cys、總谷胱甘肽（T-GSH）、GSH和GSSG含量無顯著差異（P＞0.05），說明植物對硫的吸收與利用有嚴(yán)格的調(diào)控，在一定限度內(nèi)，根際硫酸鹽濃度改變對硫同化過程沒有明顯影響。干旱時T-1S與T-3S組的Cys、T-GSH、GSH和GSSG含量顯著高于非干旱對照組（P＜0.05），說明干旱時擬南芥硫同化產(chǎn)物Cys和GSH合成增加。與T-1S組相比，T-3S組的Cys、T-GSH、GSH及GSSG含量不同程度升高（圖4）。結(jié)果說明，干旱會影響擬南芥植株對硫的吸收和轉(zhuǎn)化，適當(dāng)提高根際硫水平可使干旱期間植株維持更高水平的Cys和GSH。

圖4 硫含量對擬南芥幼苗地上部分Cys和GSH含量的影響Fig.4 Effect of sulfate level on Cys and GSH contents in the shoots of Arabidopsis seedlings

2.5 硫?qū)M南芥地上部分GST和GPX活性影響

擬南芥地上部分GST和GPX活性在非干旱組CK-1S與CK-3S組間無顯著差異（P＞0.05），在干旱脅迫后顯著升高，且T-3S組GST活性顯著高于T-1S組（P＜0.05）（圖 5）。結(jié)果表明，干旱可誘導(dǎo)擬南芥GST和GPX活性升高，適當(dāng)提高根際硫含量能使擬南芥植株在干旱期間擁有高活性的GST，從而具有較強的解毒能力。

圖5 硫含量對擬南芥幼苗地上部分GST和GPX活性的影響Fig.5 Effect of sulfate level on GST and GPX activities in the shoots of Arabidopsis seedlings

3 討論

干旱是影響糧食生產(chǎn)的主要因素，我國旱災(zāi)發(fā)生頻繁，干旱半干旱范圍和面積不斷增大，受旱區(qū)域由北向南逐漸擴增，嚴(yán)重影響著我國經(jīng)濟社會的發(fā)展［2］。如何改善農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境提高糧食產(chǎn)量是政府部門和科研人員關(guān)注的焦點，對那些不能實施灌溉的地域如何及時解旱是困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一大難題。本研究提供了根際硫水平影響擬南芥植株干旱生理的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，表明根際較高的硫供給對增強植株干旱耐受性有益。

本研究設(shè)定的低硫或高硫培養(yǎng)基及干旱處理對擬南芥種子萌發(fā)有延遲效應(yīng)，但72 h后各組萌發(fā)率均達到100%，改變硫水平對擬南芥幼苗干旱生理的影響更為明顯。非干旱條件下根際低硫或高硫不利于根系生長發(fā)育，干旱脅迫抑制擬南芥主根生長和根部形態(tài)建成，T-3S組抑制程度低于T-1S組。

硫營養(yǎng)狀況會影響植物生長發(fā)育及對干旱的適應(yīng)性。由植株根部吸收的硫酸鹽在植物細胞中經(jīng)硫還原途徑產(chǎn)生細胞生理必須的有機硫化合物，這些含硫化合物能通過多種途徑和方式參與植物的逆境生理過程［8］。硫還原產(chǎn)生的Cys及下游含巰基肽和蛋白質(zhì)是維持細胞氧化還原平衡的主要成分，次生代謝產(chǎn)物硫酸膽堿是良好的滲透調(diào)節(jié)劑［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，根際硫酸鹽含量達標(biāo)準(zhǔn)硫濃度3倍時，可使干旱條件下擬南芥植株的抗氧化能力增強，降低干旱引發(fā)的氧化脅迫，促進滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸積累，提高植株對干旱的適應(yīng)，該結(jié)果與我們實驗室前期報道的SO2預(yù)暴露后擬南芥植株干旱適應(yīng)性提高的結(jié)果［11］相似，這說明擬南芥植株吸收外源硫促進硫同化有益于提高其抗氧化活性、增強保水能力，從而使植株干旱適應(yīng)性提高。

植物硫營養(yǎng)代謝的調(diào)控十分嚴(yán)格，其中非常重要的調(diào)控現(xiàn)象就是需求驅(qū)動的硫營養(yǎng)吸收轉(zhuǎn)運及同化代謝［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫時擬南芥地上組織Cys含量顯著提高（P＜0.05），說明干旱促進了硫同化代謝，T-3S組比T-1S組有更高的Cys含量，并促進T-3S組合成更多的GSH，說明根際較高水平的硫素可以進一步增強硫同化代謝過程，而T-3S組和T-1S組Cys含量無顯著差異（P＞0.05），可能與T-3S組合成GSH消耗了更多的Cys有關(guān)。細胞內(nèi)谷胱甘肽有GSH和GSSG兩種形式，其中GSH是植物細胞內(nèi)含量最為豐富的非蛋白巰基化合物，可通過GSH-GSSG循環(huán)清除細胞內(nèi)的ROS［23-24］；當(dāng)T-GSH增加，GSH穩(wěn)定維持在較高水平時，系統(tǒng)清除活性氧的能力得到提升［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，T-3S組GSH占T-GSH含量的90%以上，說明干旱脅迫條件下，增加根際硫供給到標(biāo)準(zhǔn)硫濃度3倍可促使GSH維持在較高水平，加速GSHGSSG循環(huán)，進而促進ROS的清除，降低MDA水平。GST是植物細胞內(nèi)重要的解毒酶，可催化GSH與胞內(nèi)親電子有毒物質(zhì)結(jié)合從而脫毒，還能促進有毒物排出細胞［25］，在干旱脅迫后擬南芥組織中GST活性顯著提高，根際3S可誘導(dǎo)其活性進一步增強，說明根際硫素對GST解毒能力具有調(diào)節(jié)作用。

植株硫代謝參與逆境生理中組織的氧化還原平衡、細胞滲透調(diào)節(jié)、化學(xué)防御等過程［26］，硫同化增強及GSH含量提高有益于植物對逆境的適應(yīng)［8，27］。本研究中根際硫酸鹽對擬南芥植株干旱生理期間硫同化的促進作用與我們前期SO2暴露促進干旱條件下擬南芥植株硫同化增強的結(jié)果［11，13］相似，說明植株體內(nèi)存在調(diào)控硫同化的信號系統(tǒng)，能夠識別干旱脅迫并激活硫同化，而根際高硫或SO2暴露提供了植株細胞內(nèi)足量的硫同化底物，促進了硫同化相關(guān)過程，能合成更多抗氧化劑、滲透調(diào)節(jié)物和防御分子維持機體較高的防護能力，增強擬南芥植株的干旱適應(yīng)性。

脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物，SO2及其衍生物預(yù)暴露后擬南芥、谷子組織中的脯氨酸含量顯著增高，葉片相對含水量增加，植株對干旱的耐受性提高［11-12，17］。本研究中干旱組擬南芥脯氨酸含量提高，且T-3S組高于T-1S組，組織相對含水量變化趨勢與脯氨酸含量變化趨勢一致，說明根際高硫能促進植物細胞合成和積累更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，提高干旱條件下細胞的滲透調(diào)節(jié)能力，減少干旱期間植株的水分散失。此外，脯氨酸還可提高抗氧化酶活性，清除體內(nèi)的ROS［28］，表明根際高硫誘導(dǎo)的脯氨酸含量升高也能在機體抗氧化應(yīng)答中發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

植株根際SO42-水平對干旱條件下擬南芥植株生長發(fā)育和生理代謝有顯著影響，適當(dāng)提高根際硫供給能促進植株滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，減少水分散失，增強硫同化代謝，提高植株抗氧化能力，進而維持植株干旱生理狀態(tài)、增強植物干旱適應(yīng)能力。