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      秦皮苷對脂多糖誘導的軟骨細胞氧化應激和炎癥因子的影響*

      2021-03-03 10:57:52詹彥婷覃再嫩
      廣西醫(yī)科大學學報 2021年1期
      關鍵詞:皮苷秦皮胞外基質

      詹彥婷,覃再嫩,鄭 立△

      (廣西醫(yī)科大學 1.廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心 廣西-東盟重大疾病預防協(xié)同創(chuàng)新中心;2.廣西組織器官修復醫(yī)用生物材料工程技術研究中心,南寧 530021)

      骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)作為一種致殘率極高的疾病,給患者精神和經濟都帶來了沉重的負擔[1]。OA 涉及整個關節(jié)的變化,包括透明軟骨進行性丟失,軟骨下骨發(fā)育不良、骨贅和骨包膜的厚度增加[2-3]。促進OA 發(fā)展的主要原因包括炎癥介質過表達、降解酶的產生過多以及氧化應激等。其中,活性氧(ROS)引起的氧化應激能促進分解代謝,從而使軟骨穩(wěn)態(tài)遭到氧化及破壞,是軟骨細胞損傷的主要原因[4]。目前,非甾體類抗炎藥(NSAIDs)和阿片類的鎮(zhèn)痛藥已被應用于OA 的治療,然而這些藥物大部分情況下只能緩解OA 患者的癥狀,并且長期使用此類藥物對人體會產生較大的副作用[5]。因此,在OA 的治療策略上,可以采用抑制炎癥、降低氧化應激和維持軟骨代謝平衡的方法,有助于延緩OA的進展。

      秦皮苷作為秦皮的有效成分,具有抑制炎癥反應、減少氧化應激、降低肺血管通透性、護肝、護腎的作用[6]。研究發(fā)現(xiàn),秦皮苷可以通過抑制核因子κB(NF-κB)和激活核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)信號通路,保護小鼠免于內毒素休克[7]。在脂多糖(LPS)誘導的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)小鼠模型中,秦皮苷能下調炎癥基因白介素(IL)-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-1β 的表達,清除ROS,增加超氧化物歧化酶活性,從而避免氧化應激損傷[8]。在氧嗪誘導的高尿酸血癥模型中,秦皮苷可以抑制腎臟中的相關轉運體(如腎葡萄糖轉運蛋白9 和尿酸轉運蛋白1),從而使尿酸鹽的排泄增加,達到抗高尿酸血癥的目的[9]。然而,秦皮苷對LPS 誘導的OA 軟骨細胞的作用和機制目前尚未見報道。本研究旨在探討秦皮苷對炎癥環(huán)境下軟骨細胞的抗炎、抗氧化及軟骨保護作用,以期為OA的治療提供新思路。

      1 材料與方法

      1.1 藥物和主要試劑 秦皮苷(純度≥95%)(麥克林,中國);逆轉錄試劑盒(Fermentas Company,美國);LPS、青/鏈霉素、MTT 試劑、總RNA 提取試劑盒、蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒、番紅O 染色試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒(Solarbio,中國);二型膠原酶(Sigma,美國);鈣黃綠素/乙錠均二聚物(Calcein-AM/EthD-I)染色試劑(百奧萊博,中國);ROS檢測試劑盒(碧云天,中國);基質金屬蛋白酶(MMP)-13 一抗、FITC 免疫熒光抗體(博士德,美國);胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基(Gibco,美國);引物(金開瑞,中國)。

      1.2 實驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠,3~5 日齡,體重10~12 g,購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心,許可證號:SYXK 桂2020-0004。本研究涉及的動物實驗由廣西醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準,批準號:202010001。

      1.3 T-AOC 檢測 使用T-AOC 檢測試劑盒評估秦皮苷的總抗氧化水平。在酸性狀態(tài)下,秦皮苷能將Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)還原,生成藍色的Fe2+-TPTZ。秦皮苷按照對倍稀釋的方法配置成不同濃度(0 μg/mL、0.3125 μg/mL、0.625 μg/mL、1.25μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL)的溶液,取秦皮苷溶液30 μL,工作液900 μL 和雙蒸餾水90 μL,充分混合,室溫條件下孵育10 min,加入100 μL 的混合液于96 孔板,并用酶標儀檢測593 nm 處的吸光度(OD)值。

      1.4 軟骨細胞的提取、培養(yǎng)及鑒定 麻醉處死大鼠,備皮,用75%酒精消毒背部及四肢皮膚,無菌操作下取下雙側股骨頭及膝關節(jié)(保留周圍肌肉,軟骨不能暴露),置于含1%的青/鏈霉素的PBS 中,去除軟骨周圍組織,將軟骨剪為1 mm×1 mm×1 mm 的小塊,胰蛋白酶消化30 min,含2 mg/mL的Ⅱ型膠原酶37 ℃下消化4 h,1 000 r/min 離心5 min,收集并重懸細胞于DMEM 培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每兩天換1次液,待細胞密度約為90%時,對細胞進行傳代,使用第3 代細胞進行后續(xù)實驗。通過HE染色和番紅O染色法進行軟骨細胞鑒定。

      1.5 MTT法檢測軟骨細胞增殖率 通過MTT法檢測軟骨細胞增殖率,以評價秦皮苷對軟骨細胞的毒性作用,具體步驟:將軟骨細胞接種于96孔板,待細胞充分貼壁后,加入100 μL 濃度分別為0 μg/mL、0.312 5 μg/mL、0.625 μg/mL、1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80μg/mL 的秦皮苷溶液,培養(yǎng)24 h,棄去培養(yǎng)基,PBS清洗,換新培養(yǎng)基,加入MTT 試劑10 μL,置于37oC 培養(yǎng)箱中,4 h 后將培養(yǎng)基棄去,加入DMSO 100μL,37oC 避光孵育15 min,用酶標儀檢測490nm 處各孔的OD 值。細胞增殖率=[(實驗組OD-空白調零孔OD)/(對照組OD-空白調零孔OD)]×100%。實驗重復3次。

      1.6 細胞分組和干預 將細胞分為對照組、模型組和處理組。對照組只加入完全培養(yǎng)基,模型組加入含10 μg/mL LPS 的完全培養(yǎng)基,處理組先提前1 h加入含10μg/mL LPS 的培養(yǎng)基誘導軟骨細胞損傷,隨后加入5μg/mL 秦皮苷的完全培養(yǎng)基。將細胞種植于6孔板中,待24 h細胞貼壁后,經過相應的藥物處理24 h 后,收集細胞。通過HE 染色和番紅O 染色法評價秦皮苷對LPS誘導OA軟骨細胞的作用。

      1.7 Calcein-AM/EthD-I 染色檢測細胞活性 將細胞爬片置于6 孔板中,調整細胞密度為2×105個/孔,待細胞密度達到80%~90%時,藥物處理24 h,PBS清洗3次,加入0.05%Calcein-AM 和0.2%EthD-I染色試劑在暗室中37oC 孵育5 min,PBS 清洗掉熒光試劑,在熒光顯微鏡下觀察細胞的生存情況并拍照,用Image J 軟件統(tǒng)計活細胞和死細胞數(shù)目,計算細胞增殖率。

      1.8 二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)熒光探針檢測軟骨細胞內ROS 按照1∶1 000 的比例用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA熒光探針,使終濃度為10μmol/L。棄去細胞培養(yǎng)基,加入0.5 mL DCFH-DA 熒光探針稀釋液,在37oC的CO2培養(yǎng)箱中避光孵育20 min,每3~5 min混勻1次,用無血清培養(yǎng)基將爬片洗滌3遍,在熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光強度,用Image J 軟件分析熒光強度的平均值,熒光強度越強,細胞內的ROS水平越高。

      1.9 免疫熒光染色檢測軟骨細胞MMP-13 的分泌情況 用PBS 洗滌細胞爬片3 次后,將細胞爬片置于3% H2O2中孵育15 min,PBS 洗滌3 次,與山羊血清溫育15 min,棄去血清;滴加一抗(MMP-13,1∶100)37oC孵育4 h,PBS洗滌3次;二抗(FITC-抗兔IgG,1∶100)37 ℃避光孵育1 h,PBS清洗3次,吸去水分,熒光顯微鏡下觀察熒光圖像并拍照,用Image J軟件分析熒光強度的平均值,綠色熒光強度越強,MMP-13的水平越高。

      1.10 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測相關基因的表達 提取細胞RNA,逆轉錄為cDNA,使用LightCycler?96 實時熒光定量PCR 儀(Roche,瑞士)進行qPCR反應,用GADPH作為內參,檢測炎癥基因IL-6、MMP-3、MMP-13 和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)以及軟骨特異性基因Col2al 的表達情況。引物序列見表1。實驗重復3次,采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

      表1 PCR引物序列

      1.11 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用SKN-q檢驗,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

      2 結果

      2.1 秦皮苷的T-AOC 在秦皮苷濃度為1.25 μg/mL時,總抗氧化水平較高(P<0.05),并且隨著秦皮苷濃度的增加,總抗氧化水平也相應升高(圖1),表明秦皮苷具有良好的抗氧化的能力。

      圖1 秦皮苷的T-AOC

      2.2 軟骨細胞的鑒定結果 HE 染色顯示:細胞形態(tài)呈多邊形或橢圓形(圖2A),符合軟骨細胞形態(tài)特征。番紅O 染色中,堿性染料與細胞蛋白多糖結合,使細胞變?yōu)榧t色(圖2B),細胞具有分泌蛋白多糖的功能,表明提取的細胞為軟骨細胞。

      圖2 SD大鼠軟骨細胞的鑒定

      2.3 秦皮苷對軟骨細胞的毒性作用 秦皮苷濃度低于5μg/mL 時,對軟骨細胞無明顯毒性(P>0.05)(圖3)。因此,選擇5 μg/mL 作為秦皮苷的工作濃度。

      2.4 秦皮苷對LPS 誘導OA 軟骨細胞的作用 HE染色結果顯示:對照組軟骨細胞形態(tài)正常,模型組軟骨細胞數(shù)量較對照組明顯減少,細胞呈長梭型,與成纖維細胞形態(tài)類似;與模型組相比,秦皮苷處理后軟骨細胞形態(tài)改善,細胞數(shù)量顯著增加,形態(tài)接近于正常軟骨細胞(圖4),表明秦皮苷可以維持軟骨細胞的正常形態(tài)。

      番紅O 染色顯示:對照組有大量蛋白多糖分泌,經LPS 處理后,模型組顏色變淺,蛋白多糖的分泌量(紅色細胞數(shù))顯著減少,且經秦皮苷處理后,蛋白多糖分泌量(紅色細胞數(shù))明顯高于模型組(圖5),說明秦皮苷可以促進蛋白多糖的分泌。

      圖3 MTT檢測秦皮苷對軟骨細胞的毒性作用

      2.6 3 組軟骨細胞活力比較 與對照組比較,模型組存活細胞數(shù)量顯著減少,細胞增殖率下降(P<0.001);經秦皮苷處理后,與模型組相比,處理組存活細胞數(shù)量增加,細胞增殖率升高(P<0.001)(圖6),表明秦皮苷能促進軟骨細胞的增殖。

      2.7 3 組細胞內ROS 水平比較 與對照組比較,模型組熒光強度明顯提高(P<0.001),說明細胞內的ROS 水平顯著升高;與模型組相比,處理組熒光強度明顯降低(P<0.001),說明細胞內的ROS 水平明顯降低,見圖7。

      2.8 3組軟骨細胞MMP-13表達比較 與對照組相比,模型組MMP-13 的表達升高(P<0.001);與模型組相比,處理組MMP-13 表達明顯降低(P<0.001),見圖8。

      2.9 3組軟骨細胞特異性基因及炎癥相關基因表達比較 模型組IL-6、MMP-3、MMP-13 和iNOS 基因的表達均高于對照組(P<0.001),軟骨特異性基因Col2al 的表達降低(P<0.001)。與模型組相比,處理組炎癥基因IL-6、iNOS、MMP-3 和MMP-13 的表達明顯降低(P<0.05),軟骨特異性基因Col2al的表達升高(P<0.05)(圖9)。提示秦皮苷可以逆轉炎癥相關基因及軟骨特異基因的表達。

      圖4 細胞HE染色圖(×100)

      圖5 細胞番紅O染色圖(×100)

      圖6 Calcein-AM/EthD-I染色檢測細胞的活性

      圖7 熒光探針檢測細胞內的ROS

      圖8 免疫熒光染色顯示MMP-13的表達情況

      圖9 特異性軟骨基因和炎癥相關基因的表達

      3 討論

      OA 作為一種慢性退行性病變,多涉及關節(jié)軟骨,軟骨下骨和滑膜等部位[10]。軟骨變性的最關鍵特征是基質降解酶(包括MMP 和蛋白聚糖)的上調。研究表明,由炎癥介質過度表達引起的氧化應激可導致分解代謝酶增加,細胞外基質降解,OA 癥和軟骨細胞凋亡,從而促進了OA 的整體進展[11]。秦皮是臨床常用的中藥,具有清熱解毒、消炎、抗氧化、抗菌、抗高尿酸血癥和平喘止咳等功能[12-14]。秦皮苷是秦皮的有效活性成分,在LPS 誘導的ARDS小鼠模型中,具有明顯的抗炎及抗氧化的作用。但目前尚未有研究報道秦皮苷對OA 的作用,本研究探討了秦皮苷對LPS 誘導的體外OA 模型的影響。結果發(fā)現(xiàn),在一定濃度范圍內,秦皮苷具有抑制軟骨細胞外基質降解、減少炎癥介質和抗氧化作用,在一定程度上延緩了OA的進展。

      關節(jié)軟骨周圍有大量的細胞外基質,而基質僅由軟骨細胞產生,一旦受損,關節(jié)軟骨內源性修復困難[15]。細胞外基質的主要成分是膠原和蛋白多糖,細胞外基質合成與降解的不平衡是導致OA 的主要因素[16]。因此,維持細胞外基質分解代謝的平衡,對于OA 的治療具有至關重要的作用。MTT 結果顯示,5 μg/mL 的秦皮苷對軟骨細胞無毒性,Cal‐cein-AM/EthD-I染色結果表明,秦皮苷在該濃度下,能促進軟骨細胞的增殖,抑制細胞的凋亡。蛋白多糖作為軟骨細胞外基質的重要組成部分,其分泌的減少不利于軟骨的生長,而蛋白多糖的分泌的增加則有助于調節(jié)細胞外基質穩(wěn)態(tài)[17]。HE 和番紅O 染色結果顯示,秦皮苷能維持軟骨細胞的正常形態(tài),增加蛋白多糖的分泌,對軟骨起保護作用。MMPs參與膠原降解,MMP-13是軟骨分解代謝的關鍵酶,其過表達會導致細胞外基質降解[18-19]。MMP-13 在軟骨細胞的分解代謝活動中起著重要的作用,抑制MMP-13 的表達有助于保護軟骨[20]。本研究結果顯示,秦皮苷能抑制MMP-3和MMP-13的表達(均P<0.05),有利于維持軟骨分解代謝的平衡,避免細胞外基質的降解。此外,秦皮苷可上調軟骨特異性基因Col2al的表達(P<0.001),提示秦皮苷能促進Ⅱ型膠原的合成,間接促進軟骨細胞外基質的形成。

      過量ROS 引起的氧化應激是引起軟骨降解和OA 的主要原因,清除ROS 可以抑制氧化應激,對OA 的治療起著重要的作用[21]。T-AOC 結果表明,秦皮苷具有良好的抗氧化性能,并且隨著秦皮苷濃度的增加,其抗氧化能力也增加。DCFH-DA 熒光探針的結果也表明了秦皮苷具有清除軟骨細胞內ROS、抑制氧化應激的作用。研究表明,炎癥對OA的發(fā)展起著重要的作用,炎癥因子的過度表達往往導致骨與軟骨的破壞[22]。因此,抑制炎癥因子的過表達有助于延緩OA 的進展。據(jù)文獻報道,秦皮苷能通過降低炎性介質IL-1β 和IL-6 的表達,抑制JAK/STAT 和激活NF-κB 信號通路,以達到緩解肺炎克雷伯菌所致重癥肺炎癥狀的目的[23]。本研究qPCR 結果顯示,秦皮苷能抑制LPS 誘導IL-6、iNOS的過度表達(均P<0.05),表明秦皮苷能抑制LPS誘導的炎癥,以發(fā)揮對軟骨的保護作用。

      綜上所述,秦皮苷可以抑制炎癥因子和分解代謝基因的過表達,促進軟骨特異性基因的上調,清除ROS,對軟骨細胞具有良好的抗炎、抗氧化和保護作用。因此,秦皮苷在LPS 誘導的體外OA 模型中具有抗氧化、抗炎的作用,其有望應用于OA 的治療,作用機制有待進一步研究。

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