啤酒花浸膏對(duì)殼聚糖/聚乙烯雙層膜的性能影響及釋放行為

陳鳳霞，曹 軍，劉玉梅

（新疆大學(xué)化學(xué)學(xué)院，煤炭清潔轉(zhuǎn)化與化工過程自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830046）

活性包裝是一種創(chuàng)新型包裝，由于其與包裝材料、食品和環(huán)境的相互作用，可有效延長(zhǎng)食品的貨架壽命，更好地保護(hù)口味，在降低防腐劑等食品添加劑用量的同時(shí)，又能保持產(chǎn)品的品質(zhì)，因而備受人們的關(guān)注[1]。這種延長(zhǎng)保質(zhì)期的方法是通過在包裝材料的內(nèi)部或表面添加抗菌劑或抗氧化劑等活性物質(zhì)，進(jìn)而通過材料持續(xù)擴(kuò)散釋放到食品表面以抑制微生物生長(zhǎng)，減緩微生物生長(zhǎng)速度或者減少其成活數(shù)量，同時(shí)阻隔外部環(huán)境對(duì)食品的不良作用，從而起到保持產(chǎn)品品質(zhì)和延長(zhǎng)保質(zhì)期的作用[2]。

添加到包裝材料內(nèi)的抗菌成分主要為合成抗菌劑（包括無(wú)機(jī)抗菌劑、有機(jī)化學(xué)抗菌劑）和天然生物抗菌劑[3]。由于合成抗菌劑的毒性和潛在的致癌作用，在食品包裝中添加天然抗菌劑已成為一種趨勢(shì)[4-7]。啤酒花浸膏是啤酒花通過二氧化碳經(jīng)超臨界萃取得到的天然活性物質(zhì)，主要包含啤酒花苦味樹脂和精油等化學(xué)成分，通常用于啤酒釀造，提供啤酒所需的苦味以及防腐作用[8]。作為食品添加劑和食品包裝材料時(shí)同樣具有良好的抗氧化及抑菌效果[9]。

聚乙烯（polyethylene，PE）薄膜由于無(wú)毒、無(wú)味、無(wú)臭、符合食品包裝衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)且價(jià)格低廉，常用作食品保鮮。作為食品包裝材料，PE具有機(jī)械性能良好、低潤(rùn)濕性和高防潮性等優(yōu)勢(shì)[10]，但是缺乏活性功能。研究者們常直接將精油、迷迭香、兒茶素、沒食子酸等天然活性物質(zhì)加入PE中制備活性包裝[11-12]。然而活性物質(zhì)釋放不理想，因?yàn)樵谔幚鞵E時(shí)通常處于高溫條件，會(huì)導(dǎo)致活性物質(zhì)的降解。此外，如將活性物質(zhì)接枝于PE表面，由于它們之間強(qiáng)烈的化學(xué)鍵合會(huì)導(dǎo)致活性物質(zhì)難以釋放到食品表面[13]。因此，可將這些化合物依附另一個(gè)載體，然后進(jìn)一步層壓在PE表面上產(chǎn)生雙層膜。殼聚糖是一種從甲殼素中提取的生物高分子材料，以其獨(dú)特的高分子結(jié)構(gòu)、生物相容性、生物降解性等內(nèi)在功能特性引起了科學(xué)界和工業(yè)界的廣泛關(guān)注。殼聚糖及其衍生物常用于食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)、制藥、醫(yī)藥、美容、紡織和造紙工業(yè)以及化學(xué)等領(lǐng)域[14-16]。在食品包裝方面，因其價(jià)格低廉、安全無(wú)毒、良好的成模性和較強(qiáng)的抗菌防腐能力，常與各種天然抗氧化劑和抑菌劑結(jié)合用于延長(zhǎng)食品貨架期[17-19]，但殼聚糖具有較高的水蒸氣透過性，易導(dǎo)致食品失水。因而有學(xué)者將殼聚糖與PE膜結(jié)合添加活性成分制備雙層膜用于食品的保鮮研究[20]，但對(duì)膜的基本理化性能及活性物質(zhì)的釋放行為研究較少。

本研究將殼聚糖作為載體添加啤酒花浸膏鋪覆于PE表面，目的是開發(fā)一種基于啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的活性包裝。并通過研究薄膜的微觀結(jié)構(gòu)、物理特性、抗菌性能以及啤酒花浸膏在抑菌膜中的釋放規(guī)律，為食品包裝的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

大腸桿菌、肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌均保存于新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所。

LB培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；殼聚糖（脫乙酰度＞90%） 上海藍(lán)極科技發(fā)展有限公司；超臨界CO2萃取的啤酒花浸膏（α-酸50.82%、β-酸12.87%） 新疆三寶樂農(nóng)業(yè)科技有限公司；PE膜浙江清清美家居用品有限公司；甘油（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、乙酸、無(wú)水乙醇 天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；其他常用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS210S型電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；DF-II集熱式磁力加熱攪拌 金壇市醫(yī)療儀器廠；DPH-420型電熱恒培養(yǎng)箱 北京市永光明儀器有限公司；HP-200精密色差儀 東莞市國(guó)產(chǎn)精密色差儀廠；UV-5300PC型紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；SU8000場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron micrroscope，SEM） 日本Hitachi公司；自制成膜器（17 cm×7.5 cm）。

1.3 方法

1.3.1 殼聚糖/PE雙層抑菌膜的制備

參考前期研究[21]，取2 g殼聚糖溶于90 mL體積分?jǐn)?shù)2%乙酸溶液，70 ℃持續(xù)攪拌至完全溶解，冷卻至30 ℃，將1 g甘油溶于5 mL蒸餾水中，緩慢加入殼聚糖溶液，攪拌1 h，再分別加入0、0.1、0.2、0.3 g的啤酒花浸膏（5 mL無(wú)水乙醇溶解），使啤酒花浸膏終質(zhì)量濃度分別為0（對(duì)照）、0.1、0.2、0.3 g/100 mL，攪拌1 h，靜置脫氣約12 h，再超聲脫氣2 h，制得的成膜液用延流法鋪于貼有PE膜的自制成膜器中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中干燥20 h，制備得到殼聚糖/PE雙層抑菌膜。

1.3.2 膜厚度的測(cè)定

每個(gè)薄膜隨機(jī)選取10 個(gè)點(diǎn)用游標(biāo)卡尺測(cè)量，測(cè)量精度為±0.001 mm。

1.3.3 色澤、透光率和不透明度的測(cè)定

薄膜色澤的測(cè)定根據(jù)Dou Lixue等[22]的方法，將色差儀用標(biāo)準(zhǔn)的黑白板校準(zhǔn)后對(duì)每個(gè)薄膜樣品至少測(cè)定3 次，薄膜的色澤分別用L*值（亮度）、a*值（紅/綠）和b*值（黃/藍(lán)）表示。利用紫外-可見分光光度計(jì)記錄薄膜200～800 nm波長(zhǎng)處在空氣中的透光率。薄膜的不透明度按式（1）計(jì)算。

式中：d表示膜的厚度/mm。

1.3.4 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和溶解度的測(cè)定

將膜裁成1 cm×1 cm的膜片，用分析天平準(zhǔn)確稱質(zhì)量，記為m0/g，放置在表面皿中，在105 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，用分析天平準(zhǔn)確稱質(zhì)量，記為m1/g。將完全烘干后的膜片放入50 mL蒸餾水中，在室溫下浸泡24 h，再放置在烘箱中105 ℃烘干至恒質(zhì)量，用分析天平準(zhǔn)確稱質(zhì)量，記為m2/g。水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和溶解度分別按公式（2）、（3）計(jì)算。

1.3.5 微觀結(jié)構(gòu)的觀察

利用SEM觀察薄膜的表面微觀結(jié)構(gòu)。在觀察之前，按照儀器說(shuō)明對(duì)樣品進(jìn)行前處理并粘附于導(dǎo)電膠上噴金處理。

1.3.6 抑菌活性的測(cè)定

根據(jù)瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)法[2]評(píng)價(jià)雙層抑菌膜的抑菌活性，通過固體培養(yǎng)基上的抑菌區(qū)確定薄膜抗微生物的效果。測(cè)試菌包括單增生李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎桿菌。取上述5 種菌株加入到無(wú)菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，37 ℃下活化24 h，挑取活化后的菌落于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%生理鹽水中，調(diào)節(jié)濁度至0.50麥?zhǔn)蠞岫葐挝?，使菌的濃度?.5×108CFU/mL。取0.1 mL菌懸液于100 mL LB培養(yǎng)基中混勻，倒入直徑為9 cm無(wú)菌培養(yǎng)皿，將膜片裁成直徑為6 mm的圓片，貼附于培養(yǎng)基表面，37 ℃下培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.7 膜中啤酒花浸膏的釋放行為測(cè)定

依據(jù)歐盟委員會(huì)指令（EU 10/2011）[23]，定義食品模擬物如下：水，模擬物水性食品；3%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙酸，模擬酸性（pH值＜4.5）食品；10%乙醇，模擬酒精類食品；95%乙醇和異辛烷，模擬高脂肪食品；50%乙醇，模擬高脂肪食品含酒精的產(chǎn)品、牛奶和一些乳制品。本研究中因啤酒花浸膏具有疏水性，既選擇在10%、50%、95%的乙醇模擬體系下進(jìn)行釋放。

取膜片（3 cm×5 cm）置于100 mL具塞式錐形瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為10%、50%、95%的乙醇溶液50 mL，放入恒溫水浴鍋中，以4、25、35 ℃作為遷移溫度，釋放一定時(shí)間，取1 mL釋放液按一定比例稀釋，測(cè)定其在326 nm波長(zhǎng)處的吸光度，根據(jù)啤酒花浸膏的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算模擬液中啤酒花浸膏的質(zhì)量，即為膜片中的釋放量。按公式（4）、（5）分別計(jì)算膜片中啤酒花浸膏釋放量及釋放率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均至少平行測(cè)定3 次。使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，利用單因素方差分析中的鄧肯氏法進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，采用Origin 8.6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的物理特性

表1 含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的物理性能Table 1 Physical properties of chitosan-coated antibacterial PE bilayer films

薄膜的厚度是至關(guān)重要的參數(shù)，因其會(huì)影響食品包裝的其他性能，如水蒸氣和氣體的滲透性、活性化合物的擴(kuò)散，以及對(duì)昆蟲和微生物攻擊的防護(hù)。由表1可知，隨著啤酒花浸膏添加量在0～0.2 g/100 mL范圍內(nèi)的增加，膜的厚度變化不顯著；添加量增至0.3 g/100 mL后，厚度顯著增加，這主要是因?yàn)槠【苹ń嗵砑恿枯^大導(dǎo)致薄膜表面粗糙程度增加，從而使厚度增加。這與Atef等[24]的結(jié)果相似。

啤酒花浸膏的加入改變了殼聚糖/PE膜水親和能力，隨著啤酒花浸膏添加量的增加，溶解度和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸降低，與Wang Liyan等[25]將淡竹葉提取物添加到殼聚糖中的結(jié)果一致。水親和能力的改變是由于啤酒花浸膏中含有大量的α-酸和β-酸，它們的羥基與殼聚糖的氨基之間存在很強(qiáng)的相互作用，使水分子與殼聚糖鏈上的氨基鏈接受阻。

2.2 含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的色澤

薄膜的色澤影響包裝外觀和消費(fèi)者接受度。如表2所示，與對(duì)照組相比，添加啤酒花浸膏顯著降低了膜的L*值，同時(shí)顯著提高了a*值和b*值，與殼聚糖中添加蘋果多酚后色澤的變化趨勢(shì)[26]相同。然而酒花浸膏添加量從0.1 g/100 mL增加到0.2 g/100 mL時(shí)，L*、a*值沒有顯著改變（P＞0.05），但增加到0.3 g/100 mL時(shí)兩者均顯著降低。此現(xiàn)象是由于啤酒花浸膏含量較高時(shí)在膜液中發(fā)生聚集，導(dǎo)致明亮度急劇下降。根據(jù)所測(cè)的色澤及觀察結(jié)果可知，含啤酒花浸膏的膜的色澤比對(duì)照膜略深，且色澤略偏黃。

表2 含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的色澤Table 2 Color of chitosan-coated antibacterial PE bilayer films

圖1 含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的透光率Fig.1 Light transmittance of chitosan-coated antibacterial PE bilayer films

薄膜應(yīng)用于食品表面時(shí)，薄膜的透光性和透明度也是一個(gè)非常重要的考察標(biāo)準(zhǔn)。由圖1 可知，在200～800 nm范圍內(nèi)，隨著啤酒花浸膏添加量的增大，透光率呈下降趨勢(shì)。在200～380 nm范圍內(nèi)添加啤酒花浸膏的膜透光率基本為零，說(shuō)明該膜相較對(duì)照膜更有利于防止紫外線的透過。此外，啤酒花浸膏使殼聚糖/PE膜的不透明度顯著增加（P＜0.05）（表2），說(shuō)明加入啤酒花浸膏可以改善殼聚糖/PE膜的光阻隔性能，防止食品發(fā)生氧化變質(zhì)。因此，啤酒花浸膏殼聚糖/PE膜更適合用于紫外線敏感的食品包裝。

2.3 含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的微觀結(jié)構(gòu)

圖2 含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的SEM圖Fig.2 Scanning electron microscopic image of chitosan-coated antibacterial PE bilayer films

利用SEM可觀察到成膜基質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的相關(guān)信息，可有效解釋成膜基質(zhì)的厚度、力學(xué)性能、透氣性等宏觀性能的變化原因。由圖2可知，殼聚糖/PE膜表面可觀察到一些顆粒，這可能是由于成膜液黏度較高造成殼聚糖聚集形成晶粒。但薄膜的表面呈現(xiàn)均勻、光滑、連續(xù)的結(jié)構(gòu)，表明殼聚糖具有高度相容性和良好的成膜特性，此結(jié)果與de Moraes Crizel等[17]的結(jié)果相似。相較于對(duì)照膜，添加0.3 g/100 mL啤酒花浸膏的膜出現(xiàn)了相分離情況，使膜表面粗糙且凹凸不平，這種現(xiàn)象可能是由于啤酒花浸膏的結(jié)構(gòu)特性使其不溶于水，在有機(jī)溶劑中溶解性更好，從而不能輕易地進(jìn)入聚合物鏈。因此，可以觀察到因相分離而導(dǎo)致出現(xiàn)了膜表面粗糙、雜亂無(wú)章的現(xiàn)象，類似的結(jié)果在文獻(xiàn)[27]中也有報(bào)道。這也進(jìn)一步佐證了0.3 g/100 mL啤酒花浸膏的膜厚度相較其他膜偏大。

2.4 含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的抑菌活性

表3 含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of chitosan-coated PE bilayer films incorporated with hops extract

通過瓊脂擴(kuò)散法評(píng)價(jià)不同添加量啤酒花浸膏抑菌膜對(duì)革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、肺炎桿菌）和革蘭氏陽(yáng)性菌（蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌）的抑菌活性。由表3可知，殼聚糖/PE膜對(duì)5 株菌均沒有抑菌效果，這與殼聚糖的廣譜抑菌性相反，主要由于增塑劑使殼聚糖分子在膜內(nèi)的固定化影響了殼聚糖抑菌活性的釋放，導(dǎo)致其抑菌活性下降，此現(xiàn)象與Genskowsky等[28]的結(jié)果相似。而添加啤酒花浸膏的膜都顯示出了良好的抑菌活性，并隨著啤酒花浸膏的添加量增加，抑菌圈直徑也逐漸增加。這主要因?yàn)槠【苹ń嘀笑?酸、β-酸以及啤酒花精油都具有良好的抑菌活性，通過作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜發(fā)生不同程度的皺縮破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)核酸流出而抑制了細(xì)菌生長(zhǎng)[29]。此外，啤酒花浸膏對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌敏感程度強(qiáng)于革蘭氏陰性菌，可能是由于其親脂性較強(qiáng)，革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁脂多糖會(huì)阻止其中的活性成分從細(xì)胞質(zhì)膜滲透[30-31]。

2.5 食品模擬液中酒花浸膏的釋放行為

在目前的研究中，活性包裝膜的釋放取決于不同的因素，如液體向膜基質(zhì)的遷移、聚合物的溶解度、活性化合物通過膜基質(zhì)向食品模擬液體的擴(kuò)散以及由活性化合物與生物基質(zhì)之間的特定相互作用等不同因素作用[32]。本實(shí)驗(yàn)研究了啤酒花浸膏在3 種不同的食物模擬物（10%、50%、95%乙醇）體系中的釋放規(guī)律。圖3顯示了含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層膜在上述3 種食品模擬物中4、25、35 ℃環(huán)境下的啤酒花浸膏不同時(shí)刻的釋放量。為了更好地解釋不同添加量啤酒花浸膏的釋放行為，繼續(xù)研究了特定時(shí)間內(nèi)活性成分（啤酒花浸膏）釋放率的變化，具體結(jié)果見圖4。

圖3 殼聚糖/PE雙層抑菌膜中啤酒花浸膏在模擬體系中的釋放量Fig.3 Release amount of hops extract from chitosan-coated PE bilayer films in simulated food systems

由圖3可知，在所有的測(cè)試模擬體系中均觀察到相似的釋放曲線，釋放過程都是由快速釋放到緩慢釋放然后進(jìn)入釋放平衡階段，但是不同食品模擬體系達(dá)到最大釋放量和釋放率的時(shí)間有所不同。隨著溫度的升高，啤酒花釋放量逐漸增大，且到達(dá)平衡所需時(shí)間越短。因?yàn)殡S著溫度的升高，分子擴(kuò)散加劇，分子間排斥力增大，導(dǎo)致啤酒花浸膏和殼聚糖作用力降低，因此加速了啤酒花浸膏的釋放[33]。隨著模擬液中乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，模擬液中啤酒花浸膏的釋放量增加，由于95%乙醇與啤酒花浸膏具有相似的疏水性，因此它的快速、高釋放水平是可以預(yù)期的，這與陳婷等[34]在明膠/殼聚糖膜液中添加啤酒花浸膏的結(jié)果相同。

圖4 殼聚糖/PE雙層抑菌膜中啤酒花浸膏在模擬體系中的釋放率Fig.4 Release percentage of hops extract from chitosan-coated antibacterial PE bilayer films in simulated food systems

由圖4可知，隨著啤酒花浸膏添加量的增加，其在模擬體系中的釋放率增加，且釋放平衡所需時(shí)間縮短，由于不同添加量啤酒花浸膏在殼聚糖基體中的參與程度不同，導(dǎo)致在聚合物鏈中向模擬物的遷移速率不同，隨著啤酒花浸膏添加量的增加，在成膜液中會(huì)發(fā)生聚集形成較大的晶體，導(dǎo)致在膜液中分散不均勻，減少了與聚合物分子間的交聯(lián)；而添加量較低時(shí)分散更加均勻，更容易與殼聚糖發(fā)生相互作用[2]。此外，在不同溫度、不同模擬物中啤酒花浸膏的釋放率均小于100%，且0.1、0.2、0.3 g/100 mL啤酒花浸膏添加量薄膜在35 ℃ 95%乙醇體系下的釋放率最大，最大釋放率分別為72.94%、82.60%、94.32%，而在4 ℃ 95%乙醇體系中，該值則依次為65.65%、76.62%、83.71%。結(jié)果表明含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜更加適用于高脂類食品的包裝。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)成功制備了一種含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜。啤酒花浸膏的加入使薄膜表面更加粗糙，厚度增加，色澤加深、趨于黃色，同時(shí)對(duì)紫外-可見光具有優(yōu)異的屏障活性且綜合各項(xiàng)性能發(fā)現(xiàn)，含0.2 g/100 mL啤酒花浸膏的雙層膜性能最佳。在不同時(shí)刻、不同溫度下，不同添加量啤酒花浸膏在食品模擬物體系（10%、50%、95%乙醇）中的遷移規(guī)律表明，模擬液中乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，啤酒花浸膏釋放量越高，且隨著溫度升高，釋放量遞增，釋放平衡時(shí)間縮短；在不同添加量下，啤酒花浸膏含量越高，釋放量也越高；因此，含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜更適用于高脂體系食品的包裝。與傳統(tǒng)單層包裝膜（塑料包裝、可食性包裝）相比，殼聚糖/PE的雙層包裝既可避免塑料包裝直接接觸食品而可能產(chǎn)生的塑化劑及聚合物單體向食品遷移所引起的潛在風(fēng)險(xiǎn)，又可以彌補(bǔ)殼聚糖阻水能力差的性能，同時(shí)啤酒花浸膏高效安全的抑菌活性還使其具備了新的包裝性能。因此，殼聚糖/PE雙層抑菌膜的制備可為其開發(fā)提供理論參考。