水保措施對(duì)柑橘果園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

吳波波， 王 鵬*， 肖勝生， 余小芳， 舒 旺， 張 華， 丁明軍

1.江西師范大學(xué)地理與環(huán)境學(xué)院， 江西 南昌 330022 2.江西師范大學(xué)， 鄱陽湖濕地與流域研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江西 南昌 330022 3.江西省水土保持科學(xué)研究院， 江西 南昌 330029

土壤細(xì)菌豐度高、種類多、代謝活性豐富，能迅速對(duì)環(huán)境擾動(dòng)做出反應(yīng)，是土壤生態(tài)系統(tǒng)重要的活性部分[1]，其群落在調(diào)節(jié)養(yǎng)分循環(huán)、影響植物生產(chǎn)力和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性方面起著重要作用[2]. 已有研究證實(shí)，影響土壤條件的農(nóng)業(yè)實(shí)踐會(huì)改變土壤微生物群落，尤其是細(xì)菌群落[3]. 不同學(xué)者在許多研究中也已探索了水保措施對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，大多數(shù)研究表明，與輪作和凈耕相比，作物覆蓋增加了土壤有機(jī)質(zhì)含量和細(xì)菌多樣性，是改善土壤微環(huán)境的有效策略[4-6]；輪作增加了土壤細(xì)菌的數(shù)量，但并沒有影響細(xì)菌的豐富度或多樣性[7]；凈耕容易導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)含量銳減、細(xì)菌多樣性降低、樹體早衰、果實(shí)品質(zhì)下降[8]. 也有研究得出相反結(jié)論，例如，Sanaullah等[9]研究了農(nóng)業(yè)管理系統(tǒng)對(duì)陸地生態(tài)系統(tǒng)功能的影響，發(fā)現(xiàn)豆科植物輪作降低了病蟲害壓力，增加了土壤中的氮含量，從而導(dǎo)致土壤微生物活性增強(qiáng)，細(xì)菌多樣性提高；DONG等[10]認(rèn)為，凈耕可以增加土壤碳儲(chǔ)量和養(yǎng)分含量，穩(wěn)定土壤結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)土壤微生物活性. 可見，不同水保措施對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響較為復(fù)雜，它們之間的相互作用及其作用機(jī)理尚未明確，水保措施對(duì)土壤特性及細(xì)菌群落影響的爭論仍然存在. 此外，盡管已有學(xué)者開展了水保措施對(duì)土壤菌群群落結(jié)構(gòu)的影響研究[6]，但對(duì)亞熱帶環(huán)境下不同水保措施導(dǎo)致的柑橘果園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)響應(yīng)尚不明確，特別是細(xì)菌群落交互作用的網(wǎng)絡(luò)對(duì)亞熱帶柑橘果園土壤環(huán)境變化的響應(yīng)還鮮有報(bào)道.

柑橘是中國乃至世界上最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的果樹之一[11]. 隨著人口快速增長及農(nóng)戶追求經(jīng)濟(jì)利益最大化等因素的影響，中國南方越來越多的坡地次生林轉(zhuǎn)變?yōu)楣麍@[12]，柑橘果園也因其高經(jīng)濟(jì)收益在該地區(qū)廣泛分布[13]. 規(guī)模機(jī)械化開挖對(duì)果園土壤的強(qiáng)烈干擾易導(dǎo)致土壤養(yǎng)分循環(huán)失衡及農(nóng)作物生產(chǎn)力下降[14]，探索新的水保措施已成為該區(qū)域柑橘產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑. 在土壤中，細(xì)菌數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)質(zhì)量變化(如多樣性指數(shù))是土壤健康重要且敏感的指標(biāo)[15]，對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的深入認(rèn)知，將有助于制定合理有效的水保措施. 此外，土壤細(xì)菌群落的分布模式和驅(qū)動(dòng)因素可能在不同水保措施間有所不同，而不同水保措施下的土壤細(xì)菌群落在土壤養(yǎng)分利用效率之間的差異會(huì)嚴(yán)重影響植物的生長，因此，了解土壤細(xì)菌的多樣性、群落組成及其交互作用對(duì)于通過調(diào)控細(xì)菌群落以實(shí)現(xiàn)作物的可持續(xù)生產(chǎn)至關(guān)重要.

鑒于此，為研究不同水保措施對(duì)柑橘果園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，該研究選取了江西省德安縣柑橘果園的4種水土保持試驗(yàn)小區(qū)作為研究對(duì)象，通過Shannon-Wiener指數(shù)和Chao1指數(shù)探究了不同水保措施下柑橘果園土壤細(xì)菌的多樣性，利用高通量測序技術(shù)分析了不同水保措施下柑橘果園土壤細(xì)菌的群落組成，并通過構(gòu)建其分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，探索了不同水保措施對(duì)柑橘果園土壤細(xì)菌群落交互作用的影響，以期為柑橘果園土壤生態(tài)系統(tǒng)研究提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 樣地概況

試驗(yàn)地位于江西省德安縣燕溝小流域內(nèi)的江西水土保持生態(tài)科技園(115°42′38″E～115°43′06″E、29°16′37″N～29°17′40″N). 該區(qū)屬于亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，平均海拔30～90 m，多年平均降水量為 1 537 mm，多年平均氣溫為16.7 ℃，年日照時(shí)數(shù)為 1 700～2 100 h. 地貌類型主要為淺丘崗地，植被類型屬于亞熱帶常綠闊葉林，植被類型主要有針葉林、山地針葉林、常綠闊葉林等，土壤主要為第四紀(jì)紅黏土發(fā)育的紅壤，土壤厚度為0.5～1.5 m. 該區(qū)位于中國紅壤分布的中心區(qū)域，屬全國土壤侵蝕二級(jí)類型區(qū)，在江西省和南方紅壤丘陵區(qū)具有典型代表性.

1.2 樣地設(shè)置及采樣方法

試驗(yàn)地為柑橘果園水土保持試驗(yàn)區(qū)，柑橘果園按照 1 335株hm2的初始密度于2001年栽植. 試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)水保措施(從2001年持續(xù)至2019年)，分別為狗牙根條帶覆蓋(TD)、狗牙根全園覆蓋(QY)、經(jīng)濟(jì)作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)和凈耕果園(JG)，每個(gè)水保措施設(shè)置1個(gè)小區(qū)，共4個(gè)試驗(yàn)小區(qū). 試驗(yàn)小區(qū)坡度均為10°，面積均為20 m2(寬2 m、長10 m)，各小區(qū)其他管理措施一致.

2019年5月進(jìn)行采樣. 在每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)進(jìn)行3次重復(fù)采樣，每次采樣為5個(gè)采樣點(diǎn)的混合，按照S型選取5個(gè)采樣點(diǎn). 每個(gè)采樣點(diǎn)去除表面凋落物后，用土鉆按照表層(0～10 cm)、中層(10～20 cm)和底層(20～40 cm)進(jìn)行土壤分層取樣，去除石頭、植物殘留物、動(dòng)物和其他雜物后分成2份，冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室. 其中，一份放在-80 ℃冰箱保存，用于高通量測序，另一份風(fēng)干后用于測定土壤基本理化指標(biāo). 因測序成本較高，用于高通量測序的樣品是3次重復(fù)采樣樣品充分混合而成的.

1.3 試驗(yàn)分析

全磷(TP)含量采用HJ 632—2011《堿熔-鉬銻抗分光光度法》測定；對(duì)于全氮(TN)含量，將土壤經(jīng)過濃硫酸-高氯酸消解后，采用HJ 634—2012《氯化鉀溶液提取-分光光度法》測定；對(duì)于pH，樣品加水后(水土比為1∶2.5)采用便攜式水質(zhì)分析儀(HI9828，HANNA，Italy)測定；土壤有機(jī)碳(SOC)含量采用碳氮元素分析儀(Elemantar vario MAX，Germany)測定；土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)含量采用重鉻酸鉀-硫酸外加熱法測定(總共36個(gè)樣品，即每個(gè)土層設(shè)置3個(gè)重復(fù)).

細(xì)菌16S rRNA基因測序采用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)提取土壤樣品基因組DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的DNA. 對(duì)16S rRNA基因的V3～V4高變區(qū)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為338F(5′-ACTCCTA CGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′). 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min，接著進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，包括95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；循環(huán)結(jié)束后72 ℃最終延伸5 min(PCR儀，ABI GeneAmp? 9700型，USA). 總共12個(gè)樣品(每個(gè)土層不設(shè)置重復(fù))，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN,USA)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測. 參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega,USA)進(jìn)行檢測定量. 16SrRNA基因測序在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的Illumina Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行. 原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫中(序列號(hào)為SUB7239364).

細(xì)菌的絕對(duì)豐度采用Real-time熒光定量 PCR法獲得，在博日LineGene9600plus平臺(tái)上進(jìn)行. 反應(yīng)體系(20 μL)：ChamQSYBR ColorqPCRMasterMix(2X)10 μL，5 μmolL正、反向引物各 0.5 μL，樣品模板 DNA 2 μL，ddH2O 4.5 μL. 細(xì)菌熒光定量PCR的擴(kuò)增引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′). 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，72 ℃修復(fù)延伸，共40個(gè)循環(huán). 最后按照博日LineGene9600plus實(shí)時(shí)熒光定量檢測系統(tǒng)默認(rèn)程序制備熔解曲線并檢測是否存在非特異性擴(kuò)增. 每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行，并利用不含DNA的去離子水作為陰性對(duì)照. 利用含有細(xì)菌16S rRNA基因全長的質(zhì)粒構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，稀釋梯度為原濃度的10-3～10-8. 所有 PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率均在 90%以上，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于99%.

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Mothur(V.1.36.1)對(duì)原始DNA序列進(jìn)行過濾處理，去除嵌合體，得到優(yōu)化序列；按照97%相似性將優(yōu)化序列劃分可操作分類單元(Operational Taxonomic Units, OTU)；基于OTU進(jìn)行稀釋性曲線分析，計(jì)算Chao1指數(shù)和Shannon-Wiener指數(shù). 采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)照Silva數(shù)據(jù)庫以70%置信度對(duì)OTU代表序列進(jìn)行物種分類，并在各分類水平上統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成(為避免各樣品微生物量的差異，按最小樣本序列數(shù)進(jìn)行樣本序列抽平，得到標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析). 采用單因素方差分析進(jìn)行不同土層和不同水保措施下土壤樣品間細(xì)菌16S rRNA的基因拷貝數(shù)和土壤理化指標(biāo)的顯著性檢驗(yàn)(顯著性水平P≤0.05視為差異顯著)；多重比較分析采用LSD法；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法. Veen圖用于反映不同水保措施下共有和獨(dú)有OTU的數(shù)量. 基于Bray-Curtis距離做PLS-DA分析以反映細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的整體差異，通過冗余分析來研究土壤理化指標(biāo)與細(xì)菌群落的關(guān)系.

注： 同一列標(biāo)有不同小寫字母的表示不同處理間差異顯著(P<0.05)；標(biāo)有不同大寫字母的表示同一處理不同土層之間差異顯著(P<0.05).圖1 不同水保措施下土壤理化性質(zhì)Fig.1 Soil physicochemical properties under different soil and water conservation measures

為確定細(xì)菌群落成員之間的聯(lián)系(正相關(guān)和負(fù)相關(guān))，使用Cytoscape 3.4.0進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化和模塊化分析[16]. 網(wǎng)絡(luò)分析采用CONET插件(http:psbweb05.psb.ugent.beconet)[17]，每個(gè)OTU的分類標(biāo)識(shí)在門類級(jí)別分配，將獲得的原始OTU數(shù)據(jù)(具有分類學(xué)豐度的表格)用作輸入矩陣，根據(jù)CONET網(wǎng)站(http:psbweb05.psb.ugent.beconettutorial4.php)上提供的指南進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建. 參數(shù)設(shè)置如下：每個(gè)OTU至少進(jìn)行30個(gè)序列的預(yù)處理和過濾，4個(gè)相似性度量(Spearman，Pearson，Kullbackleibler和Bray-Curtis)，自動(dòng)設(shè)置閾值并將錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)校正設(shè)置為0.05，導(dǎo)出鄰接矩陣，用鄰接矩陣來編碼每對(duì)節(jié)點(diǎn)之間的連接關(guān)系，對(duì)每一條邊進(jìn)行100次的Permutation和 Bootstrap顯著性檢驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)和細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)

在各土層中，TD、QY和LZ土壤中的TN、SOC和SOM含量均高于JG，特別是QY，其3層土壤中的平均TN、SOC和SOM含量與JG相比分別提高了近50%、40.33%和40.26%. 與JG相比，QY表層土壤和LZ中層土壤細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)分別提高了近1.51倍和0.64倍(見圖1). TD土壤細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)沿剖面深度無顯著變化. 值得注意的是：4種水保措施下土壤中的TN、SOC和SOM含量均沿剖面深度呈下降趨勢，而QY表層土壤中的TN、SOC和SOM含量在4種水保措施下均顯著最高，且這3個(gè)指標(biāo)均與細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)呈顯著正相關(guān)(見表1). 此外，與TD、QY和LZ相比，JG僅底層土壤中的TP含量與土壤細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)較大，且二者呈顯著正相關(guān)(見表1).

2.2 土壤細(xì)菌群落多樣性

將柑橘果園不同水保措施下12個(gè)土壤樣品中的質(zhì)控后序列按97%相似性進(jìn)行聚類，得到的細(xì)菌優(yōu)化序列總數(shù)為 623 653，有效序列范圍為 42 776～61 081. 各樣品文庫的覆蓋率(Coverage)均近99%，說明此次研究樣品的基因序列檢出率較高，測序結(jié)果能夠真實(shí)反映柑橘果園不同水保措施土壤細(xì)菌群落的真實(shí)情況.

表1 不同水保措施及不同土層土壤細(xì)菌16S rRNA豐度和土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性

圖2 不同水保措施下特有和共有OTU分布的Venn圖Fig.2 Venn diagram showing the unique and shared operational taxonomic units (OTU) of bacteria detected in soil samples under different soil and water conservation measures

與JG相比，QY和TD對(duì)柑橘果園土壤細(xì)菌均勻性、多樣性和豐富度均產(chǎn)生了更積極的影響. 圖2顯示了4種水保措施下土壤樣品中獨(dú)有的和共有的OTU數(shù)量. 與JG相比，TD、QY和LZ土壤中獨(dú)有的細(xì)菌OTU數(shù)量分別為920、973和812個(gè). 盡管QY對(duì)底層土壤細(xì)菌多樣性沒有明顯影響，但與其他水保措施相比，QY表層土壤細(xì)菌Shannon-Wiener指數(shù)和中層土壤細(xì)菌Chao1指數(shù)均分別為最高，而TD中底層土壤細(xì)菌Shannon-Wiener指數(shù)和表層土壤細(xì)菌Chao1指數(shù)分別為最高(見表2). 此外，與TD、QY和LZ相比，JG各層土壤細(xì)菌Shannon-Wiener指數(shù)均為最低(見表2). 相關(guān)性分析表明，TN含量、pH、SOC含量、SOM含量均與Shannon-Wiener指數(shù)呈顯著正相關(guān)，而與Chao1指數(shù)無顯著相關(guān)性(見圖3). 在不同水保措施下，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)可通過基于Bray-Curtis距離的PLS-DA分析明顯區(qū)分，并聚成4個(gè)類群(見圖4).

表2 不同水土保持措施下土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener)和物種豐富度指數(shù)(Chao1)

注：TD-1、TD-2、TD-3分別表示TD措施下表層、中層、底層土壤，其他以此類推.圖4 不同水保措施下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異(PLS-DA分析)Fig.4 Difference of bacterial community structures under different soil and water conservation measures (Partial Least Squares Discriminant Analysis)

2.3 土壤細(xì)菌群落組成

高通量測序得到的3 531條OTUs分屬于34門、93綱、230目、368科、616屬和1 241種. 圖5為門水平上的細(xì)菌分類，結(jié)果顯示，4種水保措施的優(yōu)勢菌門包括綠彎菌(Chloroflexi，占比為28.39%～45.32%)、酸桿菌(Acidobacteria，占比為13.20%～23.31%)、變形菌(Proteobacteria，占比為14.65%～22.95%)和放線菌(Actinobacteria，占比為7.20%～11.26%)，占細(xì)菌序列的80%以上. 在不同水保措施和土層之間，單個(gè)細(xì)菌類群的相對(duì)豐度差異明顯. 與TD、QY和LZ相比，JG土壤中Chloroflexi的相對(duì)豐度較高，而Acidobacteria和Proteobacteria的相對(duì)豐度較低. 在表層土壤中，QY與JG土壤中Proteobacteria以及QY與LZ土壤中Acidobacteria的相對(duì)豐度均較高. 除Chloroflexi相對(duì)豐度增加外，不同水保措施下土壤中Proteobacteria、Acidobacteria(TD除外)和Actinobacteria的相對(duì)豐度均沿剖面深度呈減少趨勢.

圖6為環(huán)境因子對(duì)主要門分類種群(平均相對(duì)豐度大于1%)的冗余分析結(jié)果. 由圖6可見，第一主軸解釋了門分類群落59.30%的方差變化，第一主軸和第二主軸共解釋了61.69%的方差變化. 其中，TN含量對(duì)門分類種群影響的顯著性最高(P=0.002)，其次為SOC和SOM含量(P=0.005). pH和TP含量的影響均不顯著(P分別為0.086和0.445). 所以TN、SOC和SOM含量(尤其是TN含量)是影響不同水保措施下柑橘果園土壤細(xì)菌群落組成的主要環(huán)境因子. TN、SOC、SOM含量均與Chloroflexi的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，與Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria的相對(duì)豐度均呈顯著正相關(guān).

2.4 土壤細(xì)菌群落交互作用

注： 平均相對(duì)豐度低于1%以下的部分合并，并用others表示.圖5 不同水保措施下土壤細(xì)菌群落門水平分類Fig.5 Phylum-level taxonomic composition of the bacterial community under different soil and water conservation measures

圖6 不同水保措施下細(xì)菌門分類群落與環(huán)境因子的冗余分析結(jié)果Fig.6 Redundancy analysis of bacterial phyla and environmental parameters under different soil and water conservation measures

為了探索不同水保措施對(duì)土壤細(xì)菌群落交互作用的影響，筆者使用網(wǎng)絡(luò)分析法分析了4種水保措施下土壤細(xì)菌的共生模式. 結(jié)果(見圖7)顯示，在不同水保措施下，土壤細(xì)菌群落交互作用網(wǎng)絡(luò)共檢測到21個(gè)細(xì)菌菌門，其中Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria和Chloroflexi為主要節(jié)點(diǎn). 根據(jù)Layeghifard等[18]的研究，連通性最高的細(xì)菌門通常被認(rèn)為是網(wǎng)絡(luò)中的核心菌群. 筆者發(fā)現(xiàn)不同水保措施下土壤細(xì)菌交互作用的核心菌群均為Proteobacteria(見圖7). 與JG相比，TD、QY和LZ土

壤細(xì)菌群落交互作用網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)數(shù)和負(fù)正相關(guān)連線數(shù)比較高，其中QY的節(jié)點(diǎn)數(shù)比JG多約47.6%(見表3)，表明TD、QY和LZ對(duì)土壤細(xì)菌群落交互作用網(wǎng)絡(luò)的影響均強(qiáng)于JG，尤其是QY. 特別重要的是，與TD和LZ相比，QY土壤細(xì)菌群落交互作用網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)數(shù)(186個(gè))和連線數(shù)(283條)均較高(見表3)，表明QY的網(wǎng)絡(luò)更大、更復(fù)雜，且更高的平均聚類系數(shù)(0.348)和模塊數(shù)(15個(gè))使得節(jié)點(diǎn)之間的聯(lián)系更加緊密，網(wǎng)絡(luò)更加模塊化. 而與QY相比，TD的平均聚類系數(shù)較低，僅為0.121，且LZ的平均路徑長(2.08)和平均連通度(2.91)均較小(見表3). 此外，與TD、QY和LZ相比，JG土壤細(xì)菌群落交互作用網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)數(shù)最少，連線數(shù)卻最高(見表3)，特別是Proteobacteria、Acidobacteria和Actinobacteria之間的聯(lián)系更緊密(見圖7)，表明JG可以促進(jìn)細(xì)菌菌群之間的交互作用，尤其是合作.

表3 不同水保措施下土壤細(xì)菌群落的交互作用網(wǎng)絡(luò)參數(shù)

注： 紅線和綠線分別表示顯著正相關(guān)(Spearman相關(guān)，P<0.05，R>0.8)和顯著負(fù)相關(guān)(Spearman相關(guān)，P<0.05，R<-0.8)；點(diǎn)的大小代表細(xì)菌相對(duì)豐度的多少.圖7 不同水保措施下土壤細(xì)菌群落的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Molecular ecological networks of bacterial communities under different soil and water conservation measures

3 討論

3.1 水保措施對(duì)土壤細(xì)菌豐度和多樣性的影響

該研究發(fā)現(xiàn)，與其他水保措施相比，狗牙根全園覆蓋(QY)增加了表層土壤細(xì)菌數(shù)量，豐富了中表層土壤細(xì)菌種類，而狗牙根條帶覆蓋(TD)下中底層土壤細(xì)菌種類最多，二者是增加柑橘果園土壤細(xì)菌多樣性的有效水保措施. 由于土壤微生物群落對(duì)生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)具有重要作用[2]，因而在土壤微生物群落中16S rRNA基因拷貝數(shù)較高是有益的. 與凈耕果園(JG)相比，狗牙根全園覆蓋(QY)顯著提高了表層土壤中的TN、SOC和SOM含量，且土壤細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)提高了近1.51倍(見圖1). 狗牙根草通過固定大氣中的氮，增加了土壤TN含量，這一結(jié)果與Reckling等[19]的報(bào)道相似. 植物殘?jiān)偷蚵湮飼?huì)作為新鮮有機(jī)質(zhì)被摻入土壤中，促進(jìn)SOC和SOM含量增加并改善土壤質(zhì)量. 草根和根系分泌物在SOC和SOM的積累中也起著十分重要的作用[20]. 相關(guān)性指數(shù)分析(見表1)顯示，TN、SOC和SOM含量是表層土壤細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)的驅(qū)動(dòng)因素，因此狗牙根全園覆蓋(QY)下表層土壤中具有更高的TN、SOC和SOM含量可以解釋細(xì)菌生存和繁殖所需的營養(yǎng)來源.

雖然與其他水保措施相比，狗牙根全園覆蓋(QY)下底層土壤細(xì)菌的Chao1指數(shù)最小，但其對(duì)底層土壤細(xì)菌多樣性沒有明顯影響，這與ZHONG等[21]的結(jié)論存在差異. 而狗牙根全園覆蓋(QY)中表層土壤細(xì)菌Shannon-Wiener指數(shù)更高，相關(guān)性分析(見圖3)表明研究區(qū)的TN、SOC、SOM含量均與Shannon-Wiener指數(shù)呈顯著正相關(guān)，這表明與其他水保措施相比，狗牙根全園覆蓋(QY)增加了土壤中的TN、SOC和SOM含量，從而適度干擾了細(xì)菌群落，降低了種群之間競爭性生態(tài)位的排除和選擇機(jī)制，增加了多種物種在不直接爭奪資源的情況下緊密共存的可能性，碳源利用和代謝活性的改善最終促進(jìn)了其中表層土壤細(xì)菌多樣性以及物種豐富度的增加. ZHONG等[21]也認(rèn)定全園覆蓋是有益的. 與其他水保措施相比，狗牙根全園覆蓋(QY)下土壤細(xì)菌群落在土壤剖面深度上的差異性最大(見圖4). 這可能是由于在根際之外，土壤細(xì)菌的活性相對(duì)較小，草根分泌物有利于改善細(xì)菌多樣性[22]. 狗牙根全園覆蓋(QY)的草根根系密度較大，富含碳的狗牙根根系分泌物可能激活了土壤細(xì)菌的活性，因此具有更高的細(xì)菌多樣性. 與其他水保措施相比，狗牙根條帶覆蓋(TD)下土壤細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)雖較小，但其中底層土壤細(xì)菌Shannon-Wiener指數(shù)最高. 魏?；鄣萚23]亦表示條帶覆蓋的中底層土壤蘊(yùn)藏著豐富的物種. 因此，筆者認(rèn)為，狗牙根條帶覆(TD)蓋能改善中底層土壤細(xì)菌多樣性，其較少的土壤擾動(dòng)也意味著能更好地保護(hù)土壤結(jié)構(gòu)，促進(jìn)SOC固存和團(tuán)聚體穩(wěn)定. 而與狗牙根全園覆蓋(QY)相比，經(jīng)濟(jì)作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)表層細(xì)菌數(shù)量和多樣性均較少，這可能是由于其土壤的頻繁擾動(dòng)增加了土壤中凋落物數(shù)量和根系分泌物，提高有機(jī)質(zhì)輸入量并降低了碳氮比，從而刺激表層土壤細(xì)菌群落的特定功能并降低了細(xì)菌多樣性.

此外，相關(guān)性指數(shù)分析(見表1)表明，TP含量是底層土壤細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)的驅(qū)動(dòng)因素，因而與狗牙根條帶覆蓋(TD)、狗牙根全園覆蓋(QY)和經(jīng)濟(jì)作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)相比，底層土壤TP含量更高的凈耕果園(JG)其底層細(xì)菌16S rRNA 基因拷貝數(shù)顯著更大. 但與DONG等[10]研究結(jié)果不同的是，與狗牙根條帶覆蓋(TD)、狗牙根全園覆蓋(QY)和經(jīng)濟(jì)作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)相比，凈耕果園(JG)各層土壤細(xì)菌的Shannon-Wiener指數(shù)均最低，這表明其對(duì)各層土壤干擾較大，土壤細(xì)菌均質(zhì)化嚴(yán)重.

3.2 水保措施對(duì)土壤細(xì)菌群落組成的影響

該研究發(fā)現(xiàn)，不同水保措施改變了柑橘果園土壤細(xì)菌群落在土壤剖面上的組成，土壤細(xì)菌群落差異顯著，TN、SOC和SOM含量(尤其是TN含量)是主要影響因素. 高通量測序結(jié)果(見圖5)表明，4種水保措施下土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌門中相對(duì)豐度最高的是Chloroflexi，其次為Acidobacteria、Proteobacteria和Actinobacteria，這與已有研究結(jié)果[24-26]一致. TN含量是4種水保措施下土壤細(xì)菌群落最主要的影響因素，因而Chloroflexi最高的相對(duì)豐度可以通過它對(duì)TN含量的高需求性來解釋[27]. 值得注意的是，與狗牙根條帶覆蓋(TD)、狗牙根全園覆蓋(QY)和經(jīng)濟(jì)作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)相比，凈耕果園(JG)土壤中Chloroflexi的相對(duì)豐度較大，冗余分析結(jié)果(見圖6)表明，Chloroflexi的相對(duì)豐度與TN、SOC和SOM含量均呈顯著負(fù)相關(guān)；與凈耕果園(JG)相比，狗牙根條帶覆蓋(TD)、狗牙根全園覆蓋(QY)和經(jīng)濟(jì)作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)土壤中Acidobacteria和Proteobacteria的相對(duì)豐度較大，冗余分析結(jié)果(見圖6)顯示，上述細(xì)菌的相對(duì)豐度與TN、SOC和SOM含量均呈顯著正相關(guān). 以上分析表明，水保措施可以通過影響某些土壤特性來改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，TN、SOC和SOM含量(尤其是TN含量)的差異是造成柑橘果園土壤細(xì)菌群落差異的主要原因. 這與DONG等[10]的研究結(jié)果相似，TN含量是影響不同種植系統(tǒng)中土壤群落差異的最重要因素之一. SOC和SOM在其他塑造細(xì)菌群落中的重要性也已有報(bào)道[28]. 此外，Chloroflexi是嗜熱菌，在高溫下生長良好，在有機(jī)物的分解中具有重要作用[29]. 柑橘果園土壤容易暴露在陽光下，因此Chloroflexi的相對(duì)豐度最高，尤其是凈耕果園(JG). Chloroflex是多糖的主要降解菌，主要生長在低氧土壤中[30]，在果園缺氧區(qū)多糖降解中起著重要作用. 凈耕果園(JG)致密的表層土壤易將植物根部的生長限制在表層[31]，從而導(dǎo)致土壤微生物的氧氣供給不暢.

除Chloroflexi的相對(duì)豐度增加外，不同水保措施下Proteobacteria、Acidobacteria〔狗牙根條帶覆蓋(TD)除外〕和Actinobacteria的相對(duì)豐度均沿剖面深度呈減少趨勢. Proteobacteria主要分布在植物凋落物和根系分泌物中，與高碳利用率有關(guān)，在碳循環(huán)中起關(guān)鍵作用，富營養(yǎng)特性明顯[32-33]. 成長快速的富營養(yǎng)菌群豐度在富營養(yǎng)條件下更容易增加[34]，因而Proteobacteria在營養(yǎng)狀況較好的狗牙根全園覆蓋(QY)表層土壤中更為豐富. 隨著土壤深度增加，筆者發(fā)現(xiàn)中底層土壤逐漸轉(zhuǎn)為貧營養(yǎng)的Chloroflexi，其在增加的同時(shí)也抑制了其他富營養(yǎng)菌的生長. 如果說碳是細(xì)菌的能量來源，那么氮?jiǎng)t是養(yǎng)分循環(huán)的關(guān)鍵部分. Chloroflexi對(duì)土壤氮的需求很高，但無法固定氮[27]. 因此能礦化氮的Chloroflexi的相對(duì)豐度與土壤TN含量呈顯著負(fù)相關(guān)(見圖6)，其可能與作物在爭奪氮資源. Acidobacteria屬貧營養(yǎng)細(xì)菌，是全球碳循環(huán)的重要參與者，不但具有降解復(fù)雜和難降解的碳化合物的能力，還能夠利用NO3--N作為氮源[35-36]. 狗牙根條帶覆蓋(TD)中底層土壤TN含量較高，因而Acidobacteria的相對(duì)豐度沿剖面深度呈增加趨勢. LIU等[37]發(fā)現(xiàn)TN、SOC和SOM含量均與Actinobacteria的相對(duì)豐度存在正相關(guān)關(guān)系，這與筆者所得研究相似. 但Sul等[38]觀察到Actinobacteria在較低的SOC位點(diǎn)更為豐富，原因可能在于不同研究區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)或SOC含量范圍有所不同.

3.3 水保措施對(duì)土壤細(xì)菌群落交互作用的影響

該研究發(fā)現(xiàn)，Proteobacteria是4種水保措施下土壤細(xì)菌交互作用的核心細(xì)菌，狗牙根全園覆蓋(QY)的土壤細(xì)菌群落交互作用網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性優(yōu)于其他水保措施. 與其他優(yōu)勢菌門相比，作為擁有富營養(yǎng)優(yōu)勢的Proteobacteria可能具有更寬的生態(tài)位寬度和更高的抗干擾能力，在土壤細(xì)菌群落交互作用網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性維持中起著主導(dǎo)作用. 而其他非優(yōu)勢菌門可以作為多樣化的庫來增強(qiáng)細(xì)菌的抗逆性和抵抗環(huán)境干擾的能力[39]. 因此，水保措施可能會(huì)重塑土壤中復(fù)雜的細(xì)菌群落交互作網(wǎng)絡(luò). 模塊數(shù)量增多，表明生態(tài)位越多，網(wǎng)絡(luò)模塊化可以增強(qiáng)網(wǎng)絡(luò)在環(huán)境擾動(dòng)下的穩(wěn)定性[40]. 當(dāng)4種水保措施中模塊數(shù)量最多的狗牙根全園覆蓋(QY)受到外界環(huán)境干擾時(shí)，細(xì)菌菌群更容易通過相互合作應(yīng)對(duì)環(huán)境干擾. TIAN等[41]認(rèn)為更大的網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性可以穩(wěn)定混合交互的細(xì)菌群落，提高資源的轉(zhuǎn)移效率. 與經(jīng)濟(jì)作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)和狗牙根條帶覆蓋(TD)相比，狗牙根全園覆蓋(QY)的土壤細(xì)菌群落交互作用網(wǎng)絡(luò)具有更大的網(wǎng)絡(luò)直徑、更長的平均路徑和更大更復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)(較多的節(jié)點(diǎn)數(shù)和連線數(shù))，這種變化增加了生態(tài)位寬度，增強(qiáng)了土壤微食物網(wǎng)中不同細(xì)菌之間的相互聯(lián)系，有助于其更有效地利用土壤養(yǎng)分. 由于生態(tài)位重疊，土壤碳輸入的選擇效應(yīng)可能加劇共存種群之間的養(yǎng)分競爭，而營養(yǎng)競爭是代謝能力相似的物種間拮抗互作的主要驅(qū)動(dòng)因素之一[42]，最大碳輸入使狗牙根全園覆蓋(QY)土壤潛在競爭對(duì)手之間的養(yǎng)分競爭加劇，土壤細(xì)菌群落交互作用的穩(wěn)定性最好. 而與狗牙根全園覆蓋(QY)相比，經(jīng)濟(jì)作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)土壤細(xì)菌群落交互作用網(wǎng)絡(luò)的平均連通度更小，狗牙根條帶覆蓋(TD)土壤細(xì)菌群落交互作用網(wǎng)絡(luò)的平均聚類系數(shù)更低，這表明二者土壤細(xì)菌群落的交互作用網(wǎng)絡(luò)易受外界環(huán)境的干擾，細(xì)菌群落內(nèi)部的資源競爭在土壤中較弱，土壤細(xì)菌群落交互作用的穩(wěn)定性較差.

此外，與狗牙根條帶覆蓋(TD)、狗牙根全園覆蓋(QY)和經(jīng)濟(jì)作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)相比，當(dāng)負(fù)正相關(guān)連線數(shù)比較低的凈耕果園(JG)環(huán)境發(fā)生擾動(dòng)時(shí)，其土壤細(xì)菌群落的交互作用網(wǎng)絡(luò)會(huì)在很短的時(shí)間內(nèi)將環(huán)境擾動(dòng)傳遞到整個(gè)網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定. 同時(shí)這種不穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)可能導(dǎo)致參與土壤碳氮等養(yǎng)分循環(huán)的細(xì)菌物種群落發(fā)生顯著改變[43]，進(jìn)而影響植被生長. 因而土壤底部養(yǎng)分較差的凈耕果園細(xì)菌群落只能通過減少競爭和加強(qiáng)合作來應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力，特別是Proteobacteria、Acidobacteria和Actinobacteria. 與其他3種水保措施相比，凈耕果園(JG)雖然增加了網(wǎng)絡(luò)的正負(fù)相關(guān)連線數(shù)量，但各層土壤細(xì)菌Shannon-Wiener指數(shù)均最低. 筆者推測，細(xì)菌多樣性的減少可能會(huì)促進(jìn)柑橘果園土壤中部分細(xì)菌(主要節(jié)點(diǎn))之間相互作用的頻率和幅度，但土壤細(xì)菌群落交互作用網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性隨之變差. 凈耕果園(JG)復(fù)雜的土壤細(xì)菌群落交互作用多集中在部分細(xì)菌(Proteobacteria、Acidobacteria和Actinobacteria)之間，而大多細(xì)菌物種被排除在交互作用之外，這可能導(dǎo)致了細(xì)菌多樣性的喪失. 同時(shí)，這些較強(qiáng)的交互作用降低了細(xì)菌群落交互作用網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性，也為細(xì)菌群落間的交互作用、多樣性和穩(wěn)定性之間提供了一種機(jī)制聯(lián)系[44].

4 結(jié)論

a) 與凈耕果園(JG)相比，狗牙根條帶覆蓋(TD)、狗牙根全園覆蓋(QY)和經(jīng)濟(jì)作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)各土層土壤中的TN、SOC和SOM含量均呈增加趨勢，狗牙根全園覆蓋(QY)對(duì)土壤養(yǎng)分的貢獻(xiàn)最大. 與經(jīng)濟(jì)作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)和凈耕果園(JG)相比，狗牙根全園覆蓋(QY)增加了表層土壤細(xì)菌數(shù)量，豐富了中表層土壤細(xì)菌種類，狗牙根條帶覆蓋(TD)提高了中底層土壤細(xì)菌多樣性，二者是增加柑橘果園土壤細(xì)菌多樣性的有效水保措施.

b) 不同水保措施改變了柑橘果園土壤細(xì)菌群落在土壤剖面上的組成. 除Chloroflexi的相對(duì)豐度增加外，不同水保措施下Proteobacteria、Acidobacteria〔狗牙根條帶覆蓋(AD)除外〕和Actinobacteria的相對(duì)豐度均沿剖面深度呈減少趨勢. 凈耕果園(JG)導(dǎo)致厭氧細(xì)菌(Chloroflexi)的含量增加，后者可能與作物在爭奪氮資源. 狗牙根條帶覆蓋(TD)、狗牙根全園覆蓋(QY)和經(jīng)濟(jì)作物蘿卜-大豆輪作條帶覆蓋(LZ)均提高了參與碳循環(huán)細(xì)菌的相對(duì)豐度，其中包括Acidobacteria和Proteobacteria. 不同水保措施下土壤細(xì)菌群落差異顯著，TN、SOC和SOM含量(尤其是TN含量)是主要影響因素.

c) Proteobacteria是4種水保措施下土壤細(xì)菌交互作用的核心細(xì)菌，狗牙根全園覆蓋(QY)的土壤細(xì)菌群落交互作用網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性優(yōu)于其他水保措施.

d) 狗牙根全園覆蓋(QY)提高了土壤中的TN、SOC和SOM含量，增加了土壤細(xì)菌多樣性，增強(qiáng)了土壤細(xì)菌群落交互作用的穩(wěn)定性. 因此，筆者鼓勵(lì)采取狗牙根全園覆蓋(QY)，這一結(jié)果將進(jìn)一步為土壤生態(tài)系統(tǒng)研究提供參考. 但狗牙根全園覆蓋(QY)對(duì)土壤的細(xì)菌多樣性和細(xì)菌群落交互作用等影響非常復(fù)雜，在不同的土壤類型和氣候條件下是否具有普遍有效性有待于進(jìn)一步研究.