夏枯草多糖和黃酮含量與主要環(huán)境因子的相關(guān)性及優(yōu)質(zhì)種源篩選

周新華，李軍紹，文昌午，吳喜昌，陽(yáng) 武，曾平生，武曉玉

(1中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，江西分宜336600；2分宜縣林業(yè)局，江西分宜336600)

夏枯草Prunella vulgarisL.為唇形科Lamiaceae 夏枯草屬Prunella植物，又名鐵線夏枯、麥夏枯和麥穗夏枯草等，是我國(guó)常用中藥材，全株可入藥，具有清肝明目、消腫散結(jié)等功效[1-2]。夏枯草的主要生物活性成分為三萜、皂苷、酚酸、黃酮及多糖類(lèi)，具有降壓、降糖、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理活性[3-7]。夏枯草為藥食兩用大宗中藥材，在中成藥生產(chǎn)、臨床配方、保健食品和涼茶生產(chǎn)中作原料使用。近年來(lái)，由于市場(chǎng)需求量劇增，大量野生夏枯草資源遭到挖掘，致使野生資源保有量下降，市場(chǎng)價(jià)格上漲，但人工栽培夏枯草遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，野生資源仍是目前夏枯草藥材原料的重要來(lái)源。夏枯草廣泛分布于我國(guó)陜西、甘肅、新疆、河南、湖北、湖南、江西、浙江、福建、臺(tái)灣、廣東、廣西、貴州、四川及云南等省份，生長(zhǎng)于荒坡、草地、溪邊及路旁的濕潤(rùn)土地，分布海拔可達(dá)3000 m[2]。目前，對(duì)夏枯草的研究主要集中在藥用活性物質(zhì)提取[8-9]、藥理作用[10-11]、人工栽培種植[12-13]和種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[14]等方面，系統(tǒng)評(píng)價(jià)不同種源藥材質(zhì)量及影響質(zhì)量的環(huán)境因子構(gòu)成方面的研究較少。本研究收集了10個(gè)野生夏枯草種源，分析其藥用成分含量，利用方差分析、相關(guān)性分析、聚類(lèi)分析和隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)法，篩選出主要有效成分影響因子和高品質(zhì)地理種源，為夏枯草種源篩選、品種選育和人工規(guī)?；N植提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與數(shù)據(jù)收集

通過(guò)文獻(xiàn)檢索和實(shí)地調(diào)查，本研究于2018—2019年的5—6月間收集野生夏枯草植株，10個(gè)地理種源采樣點(diǎn)的基本情況見(jiàn)表1，表1中的氣候資源數(shù)據(jù)來(lái)源于中國(guó)自然資源數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.data.ac.cn/zy/show/shi3.asp)，經(jīng)緯度和海拔數(shù)據(jù)在調(diào)查時(shí)實(shí)地記錄。收集時(shí)要求植株長(zhǎng)勢(shì)正常，處于盛花期，無(wú)病蟲(chóng)害，無(wú)明顯缺陷，每個(gè)地理種源收集15株以上。每個(gè)地理種源設(shè)置3個(gè)采集點(diǎn)，各采集點(diǎn)間隔10 m，每個(gè)采集點(diǎn)采集5株。采集的夏枯草樣品在60℃條件下烘干粉碎，過(guò)60目孔篩，然后各采集點(diǎn)稱(chēng)取10 g 樣品，將相同地理種源的樣品均勻混合，干燥保存，供藥用有效成分?多糖和黃酮含量測(cè)試。

1.2 儀器與試劑

UV-2 450紫外?可見(jiàn)光分光光度計(jì)(日本島津公司)，M17035數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)，JA10003N 數(shù)顯電子分析天平(上海精其儀器有限公司)，F(xiàn)Q-1042變頻超聲波清洗器(杭州法蘭特超聲波科技有限公司)，LC-100PHP型高效液相色譜儀(上海伍豐科學(xué)儀器有限公司)，1810-B型石英自動(dòng)雙重純水整流器(常州萬(wàn)合儀器制造有限公司)。葡萄糖、蘆丁、苯酚、乙醇、濃硫酸、亞硝酸鈉、甲醇、氯化鋁、氫氧化鈉等均為分析純，試驗(yàn)用水為超純水。

表1 夏枯草10個(gè)野生種源采樣點(diǎn)地理位置及主要?dú)夂蛞蜃覶able1 Geographical location and main climatic factorsof ten wild population sampling pointsof Prunella vulgaris

1.3 測(cè)定方法

夏枯草多糖含量的測(cè)定參照席與斌等[15]的硫酸?苯酚比色法，黃酮含量的測(cè)定參照鄧斌等[16]的亞硝酸鈉?硝酸鋁比色法。在測(cè)定夏枯草多糖和黃酮的含量時(shí)，每個(gè)地理種源稱(chēng)取1 g 樣品測(cè)定多糖和黃酮的含量，每種成分含量的每次測(cè)定值取3個(gè)樣品的平均值，重復(fù)5次，取各次測(cè)得的平均值作為多糖和黃酮的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)分析方法能夠避免單一指標(biāo)評(píng)價(jià)的片面性問(wèn)題，更加全面客觀地評(píng)定結(jié)果，為此本文采用隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)法對(duì)夏枯草主要藥用活性成分含量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。隸屬函數(shù)值[] 按公式 計(jì)算，其中， 為指標(biāo)測(cè)定值， 和 分別為該指標(biāo)的最大值和最小值。使用Microsoft Office Excel 2016整理數(shù)據(jù)和制作相關(guān)圖表，使用SPSS19.0社會(huì)統(tǒng)計(jì)分析軟件中的One-way ANOVA 模塊進(jìn)行方差分析，比較不同種源夏枯草多糖和黃酮含量的差異，并進(jìn)行相關(guān)性分析和聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地理種源夏枯草主要藥用成分含量差異

不同地理種源夏枯草多糖和黃酮含量的方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，多糖和黃酮含量在不同地理種源之間存在顯著差異(P＜0.05)，不同地理種源夏枯草多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70.45～120.39 mg·g?1，黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為34.40～59.04 mg·g?1。在夏枯草多糖含量方面，湖北宜昌種源的含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為120.39 mg·g?1，顯著高于其他地理種源；江西分宜種源的多糖含量次之，江蘇宜興種源的多糖含量位列第3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為116.33 和113.00 mg·g?1；浙江麗水種源的多糖含量最少，質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為70.45 mg·g?1，顯著低于其他地理種源。在夏枯草黃酮含量方面，廣西桂林種源的含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為59.04 mg·g?1，顯著高于其他地理種源；浙江麗水種源的黃酮含量次之，湖南衡陽(yáng)種源的黃酮含量位列第3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為56.03和55.90 mg·g?1；廣東清遠(yuǎn)種源的黃酮含量最低，質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為34.40 mg·g?1，顯著低于其他地理種源。

表 2不同地理種源夏枯草多糖和黃酮含量1)Table2 Polysaccharide and flavonoid contents in Prunella vulgaris from different geographical provenances w/(mg·g?1)

相關(guān)性分析結(jié)果表明，夏枯草多糖含量和黃酮含量呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)(r=?0.212，P=0.009)，說(shuō)明不同地理種源夏枯草多糖和黃酮這2種次生代謝物的積累不可同時(shí)兼得，多糖和黃酮的代謝機(jī)制存在相互抑制的可能。因此，在篩選夏枯草高品質(zhì)種源時(shí)應(yīng)該綜合考慮這2個(gè)指標(biāo)，而在臨床使用或藥物栽培生產(chǎn)方面可根據(jù)需要選擇目標(biāo)地理種源。

2.2 夏枯草主要藥用成分含量與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

夏枯草2個(gè)主要藥用成分含量與各地理種源環(huán)境因子的相關(guān)性分析見(jiàn)表3，相關(guān)性順序?yàn)槟杲邓?r=0.793)＞經(jīng)度(r=0.673)＞年日照時(shí)長(zhǎng)(r=0.666)＞海拔(r=0.660)＞年平均氣溫(r=0.327)＞緯度(r=0.321)。其中，經(jīng)度與夏枯草多糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=?0.427，P＜0.01)，與黃酮含量呈極顯著正相關(guān)(r=0.246，P＜0.01)；年日照時(shí)長(zhǎng)與夏枯草黃酮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=?0.557，P＜0.01)，與多糖含量相關(guān)性不顯著；年降水量和年平均氣溫與夏枯草黃酮含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(r=0.674、0.239，P＜0.01)，與多糖含量相關(guān)性不顯著；緯度與夏枯草多糖含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(r=0.247，P＜0.01)，與黃酮含量相關(guān)性不顯著；海拔與夏枯草多糖含量和黃酮含量均呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)(r= ?0.295、?0.365，P＜0.01)。

2.3 不同種源夏枯草主要藥用成分含量的綜合評(píng)價(jià)

依據(jù)多糖和黃酮含量測(cè)定結(jié)果，運(yùn)用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對(duì)各地理種源夏枯草品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。多糖和黃酮均賦予一樣的權(quán)重，根據(jù)隸屬函數(shù)計(jì)算公式確定各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，然后依據(jù)平均隸屬函數(shù)值大小對(duì)各地理種源進(jìn)行排序，進(jìn)而綜合評(píng)價(jià)各地理種源夏枯草品質(zhì)優(yōu)劣。各種源綜合評(píng)價(jià)從優(yōu)到劣的排序?yàn)閺V西桂林、江蘇宜興、湖南衡陽(yáng)、江西分宜、安徽黃山、湖北宜昌、福建三明、浙江麗水、福建寧化和廣東清遠(yuǎn)(表4)。廣西桂林種源的綜合評(píng)價(jià)排名最高(平均隸屬函數(shù)值為0.850 6)，其黃酮含量為所有種源中最優(yōu)，多糖含量亦在平均值(101.69 mg·g?1)以上；廣東清遠(yuǎn)種源綜合評(píng)價(jià)結(jié)果最差(平均隸屬函數(shù)值為0.283 3)，其黃酮含量為所有種源中最低，多糖含量亦在平均值(101.69 mg·g?1)以下。

2.4 不同地理種源夏枯草聚類(lèi)分析

對(duì)10個(gè)夏枯草地理種源進(jìn)行聚類(lèi)分析(圖1)，基于多糖和黃酮含量將10個(gè)種源劃分為3大類(lèi)：第1大類(lèi)僅包括浙江麗水種源，其多糖含量最低；第2大類(lèi)包括安徽黃山、福建三明、福建寧化和廣東清遠(yuǎn)種源，其多糖含量和黃酮含量較接近平均值；第3大類(lèi)包括湖南衡陽(yáng)、廣西桂林、江蘇宜興、湖北宜昌和江西分宜種源，其多糖和黃酮含量較高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，地理位置較為接近的聚為一類(lèi)，說(shuō)明環(huán)境因子對(duì)夏枯草多糖和黃酮的代謝積累有較大影響。同時(shí)，聚類(lèi)的結(jié)果與綜合評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致，說(shuō)明種源和產(chǎn)地對(duì)夏枯草品質(zhì)的影響較為明顯。

表3 夏枯草多糖和黃酮含量與環(huán)境因子的相關(guān)性1)Table 3 Correlation of the contentsof Prunella vulgaris polysaccharide and flavonoid with environmental factors

表4 不同種源夏枯草品質(zhì)的隸屬函數(shù)評(píng)價(jià)Table 4 Evaluation of membership functions of Prunella vulgaris from different provenances

圖1 10個(gè)地理種源聚類(lèi)結(jié)果Fig.1 Clustering results of ten geographical provenances

3 討論與結(jié)論

3.1 不同地理種源夏枯草的品質(zhì)差異

夏枯草廣泛分布在我國(guó)各地，集中分布于淮河流域及長(zhǎng)江中下游地區(qū)[2]。通過(guò)對(duì)分布區(qū)域內(nèi)10個(gè)夏枯草野生地理種源的主要藥用成分含量進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)夏枯草多糖和黃酮含量在不同地理種源之間存在顯著差異，這與劉光敏等[17]對(duì)不同產(chǎn)地夏枯草屬、皮勝玲等[18]和郭巧英等[19]對(duì)不同產(chǎn)地夏枯草野生品種有效成分含量的研究結(jié)果相吻合。藥用成分含量是藥材品質(zhì)的客觀反映，本研究發(fā)現(xiàn)，夏枯草多糖含量最高的種源是湖北宜昌(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為120.39 mg·g?1)，比所有地理種源含量的平均值(101.69 mg·g?1)高18.39%；夏枯草黃酮含量最高的種源是廣西桂林(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為59.04 mg·g?1)，比所有地理種源含量的平均值(48.37 mg·g?1)高22.06%。隸屬函數(shù)評(píng)價(jià)中，綜合品質(zhì)最好的種源是廣西桂林，其平均隸屬函數(shù)值為0.850 6，綜合品質(zhì)排名2、3、4位的種源依次為江蘇宜興、湖南衡陽(yáng)和江西分宜，其平均隸屬函數(shù)值均在0.7以上，明顯好于其他地理種源。因此，依據(jù)本文研究結(jié)果，在夏枯草產(chǎn)業(yè)化種植中，若是以夏枯草多糖含量為品質(zhì)衡定指標(biāo)，建議選用湖北宜昌種源；若是以夏枯草黃酮含量為品質(zhì)衡定指標(biāo)，建議選用廣西桂林種源；若是兼顧考慮多糖和黃酮含量，建議選用研究結(jié)果中推薦的排名前4的地理種源。

3.2 不同地理種源夏枯草藥用成分含量與環(huán)境因子的相關(guān)性

10個(gè)研究種源均分布在我國(guó)熱帶和亞熱帶地區(qū)，氣候濕潤(rùn)，光照充足，經(jīng)度范圍在E110°35′28″～E119°48′37″，緯度范圍在N25°10′10″～N31°20′48″，海拔范圍為18～759 m，這些環(huán)境因子的差異是導(dǎo)致夏枯草多糖和黃酮含量差異的外在原因。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)度、緯度和海拔對(duì)夏枯草多糖含量有極顯著影響，經(jīng)度、海拔、年平均氣溫、年日照時(shí)長(zhǎng)和年降水量對(duì)夏枯草黃酮含量有極顯著影響。經(jīng)度和海拔與夏枯草多糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與黃酮含量分別呈極顯著正相關(guān)和極顯著負(fù)相關(guān)。隨著經(jīng)度的增加，夏枯草中多糖含量降低，黃酮含量急劇增加；隨著海拔的不斷升高，夏枯草中多糖和黃酮含量均下降；隨著緯度的增加，夏枯草多糖含量不斷增加，黃酮含量變化不明顯；隨著年平均氣溫和年降水量不斷增加，夏枯草黃酮含量顯著增加，多糖含量變化不明顯；隨著年日照時(shí)長(zhǎng)增加，夏枯草黃酮含量顯著降低，多糖含量變化不明顯。

通過(guò)聚類(lèi)分析，10個(gè)地理種源可分為3大類(lèi)：第1大類(lèi)為浙江麗水種源，第2大類(lèi)為安徽黃山、福建三明、福建寧化和廣東清遠(yuǎn)種源，第3大類(lèi)包括湖南衡陽(yáng)、廣西桂林、江蘇宜興、湖北宜昌和江西分宜種源。聚類(lèi)結(jié)果基本依據(jù)地理距離的遠(yuǎn)近，說(shuō)明環(huán)境因子對(duì)夏枯草黃酮和多糖的次生代謝合成影響較大。

3.3 夏枯草地理種源選擇及利用

本研究發(fā)現(xiàn)，夏枯草多糖和黃酮含量呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=?0.212，P＜0.01)。在初生代謝比較旺盛的條件下，多糖大量積累，皂苷、黃酮類(lèi)、生物堿等次生代謝合成受到抑制的現(xiàn)象在多花黃精、黃芪和金線蓮等多種中藥材中也有出現(xiàn)[20-24]。經(jīng)緯度和海拔是影響夏枯草多糖含量的主要環(huán)境因子，經(jīng)度、海拔、年平均氣溫、年日照時(shí)長(zhǎng)和年降水量是影響夏枯草黃酮含量的主要環(huán)境因子，這些環(huán)境因子在影響多糖和黃酮合成方面的趨勢(shì)表現(xiàn)不一。因此，在選擇夏枯草產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)域時(shí)，應(yīng)綜合考慮各環(huán)境因子對(duì)次生代謝的影響，才能確保生產(chǎn)高品質(zhì)藥材。就高品質(zhì)藥材種源選擇而言，本文在綜合考慮2個(gè)主要藥用成分含量的基礎(chǔ)上，使用隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)法，對(duì)10個(gè)地理種源的綜合品質(zhì)進(jìn)行排名，篩選出品質(zhì)最優(yōu)的地理種源為廣西桂林種源，本研究結(jié)果可為夏枯草引種栽培和遺傳改良提供選擇依據(jù)和參考。