分子對(duì)接和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究銀翹散治療COVID-19機(jī)制

陶 悅，聶承冬，溫 靜，楊 洋，馬其華，王 沖，閻新佳*

(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076；2. 黑龍江省預(yù)防與治療老年病藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076)

2019年12月末，一種新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染引起的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)出現(xiàn)在我國(guó)武漢，并迅速蔓延.此病毒具有傳染性強(qiáng)、潛伏期長(zhǎng)、發(fā)病嚴(yán)重者可致亡等特點(diǎn)[1-2].清代吳瑭所著的《溫病條辨》中銀翹散原方為連翹、金銀花、薄荷、淡竹葉、淡豆豉、桔梗、牛蒡子、荊芥穗、甘草組成，主要用于新型冠狀病毒引起的熱毒襲肺證[3-4].銀翹散被納入國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)辦公廳《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》(試行第三、四、六版)中不僅推薦中藥復(fù)方中有銀翹散，而且其他推薦的中藥配方，如金花清感等都以銀翹散方為基礎(chǔ)進(jìn)行加減配伍[5-7].

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶II (ACE2)與冠狀病毒入侵細(xì)胞密切相關(guān)[8]，SARS患者的主要死因之一是(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)急性呼吸窘迫綜合征，ACE2能有效控制小鼠ARDS的發(fā)生；SARS-CoV-2是冠狀病毒復(fù)制所必須的酶，可作為有效的抗病毒藥物靶點(diǎn)[9].鑒于以上，我們可以開(kāi)發(fā)以ACE2和SARS-CoV-2為基礎(chǔ)的藥物去治療新型冠狀病毒.

本文主要針對(duì)病毒感染過(guò)程的關(guān)鍵靶蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶II ACE2和SARS-CoV-2水解酶進(jìn)行分子對(duì)接研究，深入研究銀翹散方對(duì)新型冠狀病毒的治療機(jī)制.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一個(gè)對(duì)多成分，多靶點(diǎn)，多途徑進(jìn)行分析，綜合了基因組學(xué)，統(tǒng)計(jì)學(xué)等多學(xué)科和技術(shù)的新興領(lǐng)域，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)試圖通過(guò)構(gòu)建多個(gè)網(wǎng)絡(luò)模型來(lái)探索潛在的機(jī)制和關(guān)系[10].本文利用分子對(duì)接與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥復(fù)方銀翹散，希望能為中藥復(fù)方抗新型冠狀病毒研究做出貢獻(xiàn).

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

本研究所涉及的數(shù)據(jù)庫(kù)有PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、String (https://string-db.org/cgi/input.pl)、TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、SymMap(https://www.symmap.org/search/)和DAVID 6.7(https://david.ncifcrf.gov/)；涉及的軟件有ChemOffice 2018、GraphPad Prism 8.0.2、Cytoscape 3.7.2、AutoDockTools 1.5.6、PyRx 0.8和PyMO L2.1.1.

1.2 銀翹散中主要成分篩選

基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)和SymMap數(shù)據(jù)庫(kù)查詢其所含化合物，以“連翹、金銀花、薄荷、淡竹葉、淡豆豉、桔梗、牛蒡子、荊芥穗、甘草”為關(guān)鍵詞檢索得到銀翹散所含化學(xué)成分.

口服生物利用度(OB)描述口服給藥后，成分從胃腸道和肝臟吸收和分布到體循環(huán)的速率和程度[11].類(lèi)藥物參數(shù)(DL)評(píng)估化合物作為藥物的潛力[12]，篩選條件為“DL ≥ 0.18、OB > 30%”[13]，對(duì)銀翹散所含成分進(jìn)行篩選，得到銀翹散的主要成分.

1.3 分子對(duì)接模擬

通過(guò)RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載血管緊張素轉(zhuǎn)化酶II ACE2(PDB 1R42)和SARS-CoV-2水解酶(PDB 6LU7)的蛋白晶體結(jié)構(gòu)“PDB”格式文件.將“1.2”項(xiàng)下篩選出的主要成分通過(guò)PubChem下載其“SDF”格式，導(dǎo)入Chem3D 18.0進(jìn)行優(yōu)化，所為配體分子.配體分子導(dǎo)入PyRx軟件進(jìn)行能量最小化處理.蛋白導(dǎo)入Auto Dock Tools，移除配體、移除非蛋白分子、增加極性氫，原子類(lèi)型設(shè)為Assign AD4 type.將已進(jìn)行處理的配體分子導(dǎo)入PyRx軟件的Ligands選項(xiàng)；蛋白導(dǎo)入Macromolecules選項(xiàng)，設(shè)置Exhaustiveness: 150，進(jìn)行Run Vina等待計(jì)算結(jié)果.在輸出結(jié)果中，RMSD lower bound和RMSD upper bound越低，Predicted binding Affinity(結(jié)合自由能)的數(shù)值越負(fù)，表明預(yù)測(cè)的配體與大分子之間的結(jié)合越好，打分系統(tǒng)使用Predicted binding Affinity[14-16].以《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》中的推薦抗新冠病毒藥物為陽(yáng)性對(duì)照，取阿比多爾(Arbidol)、洛匹那韋(Lopinavir)、氯喹(Chloroquine)、達(dá)蘆那韋(darunavir)、羥氯喹(Hydroxychloroquine)、瑞德西韋(Remdesivir)、利巴韋林(Ribavirin)、利托那韋(Ritonavir)，共8種藥物.銀翹散成分與陽(yáng)性對(duì)照藥的分子對(duì)接進(jìn)行對(duì)照，篩選出主要的可能活性成分.

1.4 銀翹散靶點(diǎn)蛋白篩選

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)、SymMap數(shù)據(jù)庫(kù)和PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)銀翹散主要成分逐一配對(duì)靶點(diǎn)蛋白，并通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)蛋白的名稱進(jìn)行去重，校正，只保留“homo sapiens”的靶點(diǎn)，作為銀翹散主要成分靶點(diǎn)，下一步為富集分析做準(zhǔn)備.

1.5 核心靶點(diǎn)富集分析與可視化

將銀翹散的靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入string平臺(tái)，設(shè)置種屬為Homo sapiens，得到蛋白相互作用關(guān)系，下載為.TSV格式，導(dǎo)入Cytoscape，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，基于網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)拓?fù)浞治龊Y選出銀翹散核心靶點(diǎn).采用DAVID6.7數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)銀翹散核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因生物過(guò)程(GO)富集分析與信號(hào)通路(KEGG)富集分析[17]，并對(duì)通路進(jìn)行可視化分析.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 基于分子對(duì)接的活性成分篩選

以O(shè)B>30%和DL ≥0.18為篩選指標(biāo)，在數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出銀翹散方中各藥材金銀花15個(gè)、連翹20個(gè)、淡豆豉1個(gè)、桔梗4個(gè)、牛蒡子6個(gè)、荊芥穗7個(gè)、薄荷9個(gè)和甘草88個(gè)(淡竹葉由于無(wú)核心靶點(diǎn)，故篩去)，去重，共計(jì)130個(gè)主要成分.將已收集的130個(gè)主要成分和8個(gè)陽(yáng)性對(duì)照藥與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶II(ACE2)和SARS-CoV-2水解酶進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見(jiàn)表1、2.陽(yáng)性對(duì)照藥分子對(duì)接分?jǐn)?shù)中氯喹為最低，分別為-6.80、-5.50，共有121個(gè)銀翹散成分大于氯喹，說(shuō)明銀翹散各成分分子結(jié)合活性良好，并將這121個(gè)成分做為銀翹散活性成分；陽(yáng)性對(duì)照藥分子對(duì)接分?jǐn)?shù)中洛匹那韋為最高，分別為-9.30、-8.30，共有6個(gè)銀翹散成分大于洛匹那韋，分別為Xambioona、Linarin、Isoglycyrol、Shinflavanone、Gancaonin H和bicuculline.

表1 陽(yáng)性對(duì)照藥的分子對(duì)接結(jié)果

表2 銀翹散的分子對(duì)接結(jié)果

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶II(ACE2)與8個(gè)陽(yáng)性對(duì)照的結(jié)合區(qū)域主要有2個(gè)，見(jiàn)圖2 A和B區(qū)域；與銀翹散130個(gè)主要成分的結(jié)合區(qū)域主要有4個(gè)，見(jiàn)圖2 A、B、C和D區(qū)域.SARS-CoV-2水解酶與8個(gè)陽(yáng)性對(duì)照的結(jié)合區(qū)域主要有2個(gè)，見(jiàn)圖3 A和B區(qū)域；與銀翹散130個(gè)主要成分的結(jié)合區(qū)域主要有4個(gè)，見(jiàn)圖3 A、B、C和D區(qū)域.通過(guò)結(jié)合區(qū)域能說(shuō)明中藥復(fù)方通過(guò)多成分與多結(jié)合區(qū)域結(jié)合來(lái)發(fā)揮藥理作用.表3中結(jié)合區(qū)域可以給后續(xù)分子研究提供一定的幫助.

圖1 分子對(duì)接結(jié)果熱圖

圖2 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶II的結(jié)合區(qū)域分析

圖3 SARS-CoV-2水解酶的結(jié)合區(qū)域分析

表3 結(jié)合區(qū)域位點(diǎn)

2.2 核心靶點(diǎn)的富集分析與可視化

銀翹散共計(jì)130主要成分，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，去重一共520個(gè)靶點(diǎn)蛋白，將銀翹散方的靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入string平臺(tái)，通過(guò)蛋白相互作用獲得415個(gè)蛋白，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，以大于等于degree值2倍為篩選條件，篩選出銀翹散方核心靶點(diǎn)99個(gè).構(gòu)建的藥材-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)一共包括648個(gè)節(jié)點(diǎn)(8個(gè)藥材節(jié)點(diǎn)，121個(gè)成分節(jié)點(diǎn)，519個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))，2918條邊，為下一步富集分析做準(zhǔn)備.

采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)銀翹散方核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析，保留其中FDR<0.05和P<0.05的通路.KEGG通路富集分析得到信號(hào)通路86條，涉及Pathways in cancer通路(E2F1, HSP90AB1, ADCY2, ADCY5和ERBB2等共48個(gè)靶標(biāo))，Hepatitis B通路(E2F1, TNF, CXCL8, NFKBIA, NFKB1和TGFB1等共33個(gè)靶標(biāo))，PI3K-Akt signaling pathway通路(HSP90AB1, NFKB1, AKT1, RAC1和PIK3CA等共31個(gè)靶標(biāo))，HTLV-I infection通路(E2F1, TNF, ADCY2, ADCY5和NFKBIA等共27個(gè)靶標(biāo))，cAMP signaling pathway通路(PPARA, PTGER3, ADCY2, DRD2和ADCY5等共26個(gè)靶標(biāo))，等通路.利用Omicshare平臺(tái)中高級(jí)氣泡圖可視化，結(jié)果見(jiàn)圖4.GO功能富集分析得到生物過(guò)程條目99個(gè)、細(xì)胞組成條目12個(gè)、分子功能條目23個(gè)結(jié)果見(jiàn)圖5.

圖4 核心靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析的前20個(gè)通路圖

圖5 核心靶點(diǎn)的GO分析的前20個(gè)通路

3 討 論

銀翹散對(duì)于患有新冠肺炎流感輕型、普通型患病者具有較好療效，使用后，乏力干咳發(fā)熱等癥狀均減輕，減少了輕型患者轉(zhuǎn)重型、危重型的可能.對(duì)于輕型、普通型患病者，主要分為風(fēng)寒襲表證，熱毒襲肺證，其中熱毒襲肺證臨床主要表現(xiàn)為惡寒發(fā)熱，頭痛乏力，干咳少痰咽干痛，四肢肌肉酸痛等，可用銀翹散清熱解毒，宣肺透邪；對(duì)銀翹散進(jìn)行加減，配伍清瘟敗毒散用于疏風(fēng)解表，清熱解毒；銀翹散配伍麻杏石甘湯用于清瘟解毒，宣肺泄熱，等等；對(duì)于重型、危重型患者，銀翹散可以緩解部分癥狀，輔助其他藥物使用[5].從《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》可以明顯看出，中藥復(fù)方初期的臨床使用多以銀翹散為基礎(chǔ)進(jìn)行加減配伍使用.

分子對(duì)接分析中，分別對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶II(ACE2)和SARS-CoV-2水解酶進(jìn)行分子對(duì)接模擬.銀翹散的130個(gè)成分分子對(duì)接分?jǐn)?shù)中有121個(gè)大于陽(yáng)性對(duì)照藥的最低對(duì)接分?jǐn)?shù)，說(shuō)明銀翹散復(fù)方與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶II和SARS-CoV-2水解酶結(jié)合活性很好.本研究還通過(guò)比對(duì)銀翹散成分和陽(yáng)性對(duì)照藥二者的結(jié)合區(qū)域，發(fā)現(xiàn)銀翹散的結(jié)合區(qū)域比陽(yáng)性對(duì)照藥多，說(shuō)明中藥復(fù)方通過(guò)多成分與多結(jié)合區(qū)域結(jié)合來(lái)發(fā)揮藥理作用，且實(shí)際的結(jié)合活性可能比測(cè)出的結(jié)合數(shù)據(jù)更好.

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢獲得銀翹散520個(gè)靶點(diǎn)蛋白，再通過(guò)蛋白相互作用獲得415個(gè)蛋白，對(duì)蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，篩選出銀翹散方核心靶點(diǎn)99個(gè).對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行功能富集分析發(fā)現(xiàn)，它們多參與轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程，富集于與癌癥、轉(zhuǎn)錄、免疫、炎癥和病毒感染等相關(guān)的信號(hào)通路上，有眾多與病毒相關(guān)的通路，還有Rap1信號(hào)通路[19]等與肺損傷[20]相關(guān)通路，說(shuō)明銀翹散本身復(fù)方可能對(duì)新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)和它引起的肺部疾病具有一定的活性作用.SARS-CoV-2病毒感染會(huì)導(dǎo)致劇烈的免疫反應(yīng)和炎癥風(fēng)暴，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[21-22].銀翹散的多靶點(diǎn)可能通過(guò)調(diào)控免疫反應(yīng)(immune response)相關(guān)通路；調(diào)控炎癥反應(yīng)(inflammatory response)相關(guān)通路等，起到減緩過(guò)激免疫反應(yīng)、減少炎癥等作用.

綜上所述，本研究先使用分子對(duì)接方法，從分子水平闡明了銀翹散復(fù)方可能的分子作用區(qū)域，再使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)銀翹散的成分、靶點(diǎn)蛋白，生物學(xué)功能，通路進(jìn)行系統(tǒng)研究，為銀翹散復(fù)方治療新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)和新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)研發(fā)藥物和疫情防控等提供理論支持.