p-PDGFRα在小鼠黑質紋狀體損傷周邊的經(jīng)時表達和定位

裴丹，劉學

錦州醫(yī)科大學人體解剖學教研室，遼寧 錦州 121000

中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）損傷原因有缺血、出血、創(chuàng)傷等。CNS損傷后難以修復主要包括內、外兩方面原因。腦和脊髓內神經(jīng)細胞缺少再生能力是主要的內在原因。外在原因則是在損傷部位形成影響神經(jīng)再生的環(huán)境：（1）受損的神經(jīng)細胞髓鞘產(chǎn)生大量的抑制軸突生長的因子，如髓鞘相關蛋白（MAG）和少突膠質細胞髓鞘糖蛋白（OMfg）等[1]；（2）損傷部位缺乏神經(jīng)營養(yǎng)因子促進軸突的再生[2]；（3）損傷局部膠質細胞增生，由此引起的硫酸軟骨素蛋白糖（CSPGs）的堆積及瘢痕形成，也阻礙神經(jīng)纖維再生[3,4]；（4）由于組織的破損及壞死細胞的脫落而形成空洞[5]，中樞神經(jīng)損傷后，神經(jīng)軸索無法超越而再生；（5）由于損傷部位血腦屏障受到破壞從而導致成纖維細胞侵入損傷部位并增生而形成的瘢痕阻礙神經(jīng)纖維再生。瘢痕的產(chǎn)生被認為是阻礙神經(jīng)再生的主要因素，瘢痕的形成是由于細胞過度增生。血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）是屬于酪氨酸蛋白激酶家族成員，其與配體PDGF結合后，能促使肌動蛋白重排和發(fā)揮促進細胞的趨化、分裂與增殖作用。目前關于PDGFRα在腦損傷中的研究較少。本研究應用免疫組織化學染色和Western blot方法檢測磷酸化PDGFRα在損傷腦組織周圍的表達，免疫熒光染色檢測磷酸化的PDGFRα在損傷腦組織周邊的定位表達情況，為進一步探究PDGFRα對腦損傷后組織細胞的增殖及分子機制研究提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

8周齡BALB/c小鼠（中國醫(yī)科大學實驗動物部），體重25～35 g，共48只。兔抗phosph-PDGFRα（Santa Cruz Biotechnology），兔 抗PDGFRα（Santa Cruz Biotechnology），雞抗小鼠GFAP抗體（Abcam），羊抗小鼠IBA-1抗體（Abcam），羊抗小鼠NG2抗體（Abcam），大鼠抗小鼠CD45抗體（Abcam），驢抗兔熒光488二抗（Abcam），羊抗大鼠熒光546二抗（Abcam），驢抗雞熒光Cy3TM（Abcam），驢抗羊熒光Cy3?（Abcam）。主要儀器：小鼠腦立體定位儀（DW-2000，成都泰盟科技有限公司），純水機（MillizQ，美國），低溫離心機（CF16RXⅡ，日本HITACHI公司），顱骨鉆骨器（日本），顯微外科手術器械（日本），電泳儀（美國Bio-Rad公司），電子分析天平（ER182，日本），熒光顯微鏡（Eclipse 80i，日本Nikon公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備和分組 制備小鼠黑質紋狀體通路損傷模型[6]。小鼠予10%水合氯醛0.03 mL/g腹腔注射麻醉后固定在小鼠腦功能立體定位儀上。門齒欄設置低于耳屏線3 mm。頭頂部備皮消毒并在中央縱向切開，清除顱頂骨膜，在前囟點右后方1.5 mm處用牙鉆緩慢鉆出1 mm×2 mm的骨窗，暴露大腦。將寬度為1.5 mm的切刀固定在直線型立體框架內，在右側顱骨中線外側0.5 mm，前囟點后1.5 mm處，距離大腦表面深度5.5 mm插入切刀。然后緩慢拔出刀片，止血縫合。假手術組（6只）只暴露大腦表面不損傷腦組織。手術組依取材時間分為4個亞組，每個亞組6只。

1.2.2 取材及制片 在模型制備后1、4、7、14 d取材。10%水合氯醛麻醉，各組取一半數(shù)量予心灌流沖洗，以損傷側小鼠大腦半球的損傷部位為中心，取前后2 mm腦組織迅速放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。每組剩余一半數(shù)量模型予心灌流固定用于免疫組化染色和免疫熒光分析，4%多聚甲醛后固定過夜，逐級脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。5μm水平連續(xù)切片，貼到多聚賴氨酸處理過的玻片烘干備用。

1.2.3 免疫組化檢測損傷腦組織周邊p-PDGFRα表達 石蠟切片脫蠟水化，用0.01 M的檸檬酸鹽緩沖液微波沸騰修復，過氧化氫阻斷，非免疫動物血清封閉，一抗p-PDGFRα（1：100）TH（1：1000），4℃過夜，生物素標記的二抗（S-P試劑盒C溶液）孵育10 min。鏈霉菌抗生素-過氧化物酶溶液（S-P試劑盒D溶液）孵育10 min后DAB溶液顯色，顯微鏡下觀察。自來水沖洗，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察免疫陽性產(chǎn)物的位置、分布、染色的強弱及陽性細胞的數(shù)量，圖像用NIS-Elements F系統(tǒng)拍片后以TIF文件保存。并通過陽性產(chǎn)物的光密度值分析，檢測各指標的表達強度。

1.2.4 Western blot蛋白定量 用生理鹽水清洗剪碎的腦組織，添加組織重量4倍的含1%PMSF的RIPA裂解液之后，超聲粉碎機粉碎，4℃裂解30 min。4℃，12 000 rpm離心30 min，取上清液，紫外分光光度法測定蛋白濃度，配置上樣體系，上樣體積10μl，加入5×loading buffer 2μl，剩余體積用PBS補齊，100℃5 min蛋白變性后-80℃保存。配置分離膠8%和10%，微量注射器加樣，濃縮膠內電泳的電壓設為80 V，分離膠設置為120 V。轉膜后用含5%血清的TBST溶液37℃封閉1 h加入一抗稀釋液GAPDH（1：10 000），p-PDGFRα（1：200），PDGFRα（1：200），4℃冰箱內搖床上孵育過夜，洗膜后二抗工作液（1：5000）搖床孵育2 h。TBST漂洗后，ECL發(fā)光用BIO-RAD凝膠電泳圖像分析儀進行采圖。

1.2.5 免疫熒光雙重染色檢測p-PDGFRα的定位表達 石蠟切片脫蠟水化，用0.01 M的檸檬酸鹽緩沖液微波沸騰修復，過氧化氫阻斷，非免疫動物血清封閉，10%BSA稀釋一抗兔抗小鼠p-PDGFRα（1：50），雞抗小鼠GFAP（1：100)，羊抗小鼠IBA-1（1：50），羊抗小鼠NG2（1：100），大鼠抗小鼠CD45（1：50），不同顏色生物素熒光標記的二抗（驢抗兔熒光488，驢抗雞熒光Cy3TM，驢抗羊熒光Cy3?，羊抗大鼠熒光546），37℃孵育30 min?？篃晒獯銣鐒┓馄?。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 檢測成模效果

小鼠黑質紋狀體通路損傷模型見（圖1A），酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）免疫組織化學染色結果顯示，黑質紋狀體通路切斷后，TH染色被切斷，損傷上端幾乎沒有TH陽性表達（圖1B）。TH染色未被切斷且TH陽性表達均勻，則為未損傷或者建模不成功（圖1C）。

2.2 免疫組化檢測p-PDGFRα在腦損傷后不同時期的表達

免疫組化染色及灰度值分析顯示，傷后1 d，棕黃色陽性表達的p-PDGFRα圍繞在損傷的周圍，4 d時聚集在損傷中心并且表達最多，7 d時表達已減少，到14 d時表達更少（圖2）。假手術組沒有明顯的陽性表達（圖2B）。灰度值分析顯示，與假手術組比較均具有統(tǒng)計學意義P＜0.05。

圖1 腦損傷模型和分組依據(jù)A：腦損傷模式B：黑質紋狀體通路切斷后，TH染色被切斷（手術組）C：腦組織未損傷，TH染色未被切斷（假手術組）BI.腦損傷Normal.正常Fig.1 Modeling and detection of brain injuryA:Successful brain injury model；B:After the nigrostriatal pathway cut off,TH staining was cut off(operation group)；C:The sham operation group without injury,TH staining was not cut off；BI,brain injury

圖2 免疫組化測定不同時期p-PDGFRα表達A：灰度值分析結果 手術組p-PDGFRα呈陽性表達，4 d達高峰，隨后逐漸減少B：假手術組p-PDGFRα的表達為陰性C：損傷后1 d出現(xiàn)棕黃色p-PDGFRαD：損傷后4 d p-PDGFRα最多E：損傷后7 d p-PDGFRα減少F：損傷后14 d p-PDGFRα繼續(xù)減少 *為損傷部位 箭頭所指為p-PDGFRα陽性表達細胞#P＜0.05，##P＜0.01，與假手術組比較 標尺=200μm Fig.2 The expression of p-PDGFR alpha at different stages after brain injuryA:Results of gray value analysis,p-PDGFRα of the operation group was positive expression,and reached its peak level 4 days after injury and then decreased after that；B:The expression of p-PDGFRα in sham operation group was negative；C:Acid p-PDGFRα appeared on day after injury；D:The expression of p-PDGFRα was the most on 4 days after injury；E:The expression of p-PDGFRα decreased on 7 days after injury；F:The expression of p-PDGFRα continued decreasing on 14 days after injury；*was the site of injury,and the arrow indicated the positive expression of p-PDGFRα；Compared with the sham operation group,#P＜0.05,##P＜0.01,bar=200μm

圖3 Western blot檢測不同時期p-PDGFRα蛋白表達A：各組p-PDGFRα的表達B：總PDGFRα與內參GAPDH的比值C：p-PDGFRα與總PDGFRα的比值 #P＜0.05,##P＜0.01，與假手術組比較Fig.3 The expression of p-PDGFR alpha protein in damaged brain tissue at different time detected by Western blotA:The expression of p-PDGFR alpha at different groups；B:Ratio of total p-PDGFRalpha to internal reference GAPDH；C:Ratio of p-PDGFRalphato total PDGFRα Compared with sham operation group,#P＜0.05,##P＜0.01

2.3 Western blot檢測p-PDGFRα蛋白表達

Western blot結果顯示磷酸化的PDGFRα在未損傷腦組織表達很低。在手術組傷后1 d，p-PDGFRα（185 kD）表達逐漸增多，4 d達高峰（P＜0.01），7 d逐漸減少，到14 d時表達更少，與假手術組比較具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖3）。

2.4 p-PDGFRα蛋白的表達定位

根據(jù)免疫組化和Western blot結果，本研究選取表達至峰值的4 d標本篩選p-PDGFRα的定位表達。免疫熒光雙重染色顯示p-PDGFRα/β陽性表達的細胞均有部分與GFAP陽性的星形膠質細胞，IBA-1陽性的小膠質細胞，NG2陽性的少突膠質細胞祖細胞和CD45陽性的粒細胞重合，說明p-PDGFRα部分表達在這些細胞（圖4）。

3 討論

創(chuàng)傷性腦損傷是當今發(fā)生率高且無有效治療辦法的疾病。盡管部分患者生存下來，但形成的瘢痕會導致神經(jīng)行為缺失從而嚴重影響生活質量，甚至死亡[7]。本實驗通過Western blot分析和免疫組織化學染色方法觀察了磷酸化的PDGFRs在損傷腦組織周邊的表達和定位，發(fā)現(xiàn)與假手術組相比較p-PDGFRα在腦損傷后出現(xiàn)表達增多，損傷后第4 d出現(xiàn)表達高峰，隨后逐漸下降（圖2）。閱讀相關文獻可知PDGFs是一組具有廣泛生物學效應的多功能蛋白，其通過與受體結合發(fā)揮生物學作用。它們在多種動物的胚胎和器官發(fā)育過程中有重要的生物學功能，包括細胞的繁殖、分化，正常血管的形成和纖維化血管的形成，巨噬細胞、成纖維細胞、周細胞、血管內皮細胞等多種細胞可表達PDGFRs[8～12]。Deuel等[13]報道巨噬細胞來源的PDGFRs在炎癥和損傷修復時誘導單核細胞和成纖維細胞的趨化和增殖。對PDGFRs的最初認識是發(fā)現(xiàn)它具有促進細胞的增殖和分化作用[14]。

本研究首次探討了小鼠腦損傷后磷酸化PDGFRs的表達。結果顯示，損傷的腦組織周圍有p-PDGFRs表達，并主要表達在粒細胞，小膠質細胞，激活的星形膠質細胞和少突膠質細胞祖細胞（圖4）。這一結果提示激活的PDGFRs很可能與瘢痕形成病理過程的炎癥和纖維化密切相關。免疫熒光染色結果進一步揭示炎癥細胞包括淋巴細胞甚至膠質細胞聚集在損傷核心區(qū)和周邊。已知這些單核細胞在損傷修復和炎癥過程中通過產(chǎn)生各種生長因子和細胞因子發(fā)揮重要作用[15]。

據(jù)報道多種類型的細胞參與腦損傷后血管的發(fā)生和炎癥反應[16]，但是潛在的機制還沒有完全清楚，迫切需要知道不同類型的細胞，包括巨噬細胞，小膠質細胞，淋巴細胞和星形膠質細胞在特定的病理狀態(tài)下怎么增殖、產(chǎn)生細胞因子和生長因子的能力。Ungvari等[17]報道通過γ射線輻射大腦微血管內皮細胞可上調促炎因子和趨化因子從而獲得衰老相關的分泌表型（SASP）。從本結果得知，多種細胞存活在損傷周邊可能參與腦損傷的關鍵進程，其可作為減少損傷后結構和功能的繼發(fā)損傷，治療瘢痕形成的靶點。

本研究分析了小鼠腦損傷后p-PDGFRs在炎癥及瘢痕形成的病理過程中的作用下一步將建立應用PDGFRs中和抗體來抑制PDGF通路以減少瘢痕產(chǎn)生的模型，具體調節(jié)的分子機制有待進一步研究。

圖4 p-PDGFRα（綠色）與GFAP（A），IBA-1（B），NG2（C），CD45（D）（紅色）的熒光雙標染色，顯示p-PDGFRα表達與其關系*為損傷部位 箭頭所指為陽性表達細胞 標尺=200μmFig.4 Fluorescence double label staining of p-PDGFR alpha(green light)and GFAP(A),IBA-1(B),NG2(C)，CD45(D)(red light),showed the expression of p-PDGFR alpha and its relationship*the site of injury,the arrow indicated the positive expression cell，bar=200μm