3種成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基對單層培養(yǎng)和微球培養(yǎng)的人脂肪干細(xì)胞成軟骨效果比較

于慶賀，曲戎梅，張國煒，李鑫，仇顯帥，歐陽鈞，戴景興，閔少雄

1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院脊柱外科，廣州 510280；2.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室暨廣東省醫(yī)學(xué)生物力學(xué)重點實驗，廣州510515

關(guān)節(jié)軟骨是組成活動關(guān)節(jié)面的一種有彈性的負(fù)重組織，主要功能是承受力學(xué)負(fù)荷和潤滑作用。軟骨損傷的修復(fù)是臨床難題，由于缺乏血供，軟骨的自身修復(fù)能力極為有限[1]。近年來國內(nèi)外學(xué)者針對軟骨再生進(jìn)行一系列研究，研發(fā)多種治療方式，如自體軟骨細(xì)胞移植，骨髓刺激，基質(zhì)誘導(dǎo)自體軟骨細(xì)胞移植等，但在并發(fā)癥、治療效果等方面存在缺陷[2～5]。體外構(gòu)建工程化軟骨屬于軟骨再生研究熱點，其誘導(dǎo)種子細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）分化為軟骨細(xì)胞，植入受損關(guān)節(jié)使患者癥狀緩解[6～8]。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）是細(xì)胞增殖，代謝和分化培養(yǎng)基中最重要的補充劑，但許多報道表明軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中使用其他種類血清如牛血清，或使用血清替代物如胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉溶液（ITS），抑或使用較低水平的FBS可以產(chǎn)生更高水平的軟骨細(xì)胞標(biāo)志物[9～12]。轉(zhuǎn)化生長因子3（TGF-β3）是最常見的用于軟骨誘導(dǎo)分化的生長因子，多數(shù)實驗采用10 ng/ml的終濃度[13,14]，但有些實驗使用了更低濃度的TGF-β3[15]。本實驗主要比較添加常規(guī)濃度FBS（10%）和ITS（胰島素10μg/L、5.5μg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、0.67μg/L亞硒酸鈉），以及高濃度和低濃度TGF-β3（10 ng/ml vs 1 ng/ml）的軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)MSCs成軟骨分化的效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 人脂肪干細(xì)胞的分離和擴增 在超凈臺內(nèi)用眼科剪將人脂肪組織剪碎，用0.2%的I型膠原酶（PBS配置）恒溫?fù)u床中37℃消化40 min，基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM，10%FBS，1%雙抗）終止消化，1000 r/min離心5 min取細(xì)胞沉淀，用生長培養(yǎng)基重懸后接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，48 h后第1次換液，以后隔2 d換1次液體，細(xì)胞生長融合達(dá)90%時按1：2比例傳代。

1.1.2 人脂肪干細(xì)胞的微球培養(yǎng) 取第3代人脂肪干細(xì)胞（human adipose mesenchymal stem cells，hASCs），消化后移入15 ml離心管內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×l05個，1200 r/min離心5 min制成細(xì)胞微球。加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM、10%FBS、1%雙抗），置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，使細(xì)胞團(tuán)聚集。

1.1.3 人脂肪干細(xì)胞的成軟骨分化 配置A、B、C組軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，共有成分為（DMEM、1%雙抗、100 nmol/L地塞米松、50 nmol/L L-抗壞血酸、23μmol/L L-脯氨酸），A組添加10%FBS、10 ng/ml TGF-β3，B組添加ITS（胰島素10μg/l、5.5μg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、0.67μg/l亞硒酸鈉）、1 ng/ml TGF-β3，C組添加ITS（胰島素10 μg/L、5.5μg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、0.67μg/L亞硒酸鈉）、10 ng/ml TGF-β3。取第3代hASCs，以1×104cells/cm2的密度接種至12孔板，細(xì)胞融合達(dá)80%時將平面培養(yǎng)和培養(yǎng)3 d的hASCs微球的基礎(chǔ)培養(yǎng)基更換成A、B、C軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，隔天換液，在3周時對樣品進(jìn)行Western blot、阿爾新藍(lán)染色、甲苯胺藍(lán)染色，檢測細(xì)胞的成軟骨分化水平。

1.1.4 細(xì)胞微球冰凍切片 3周后取細(xì)胞微球，PBS清洗3次，4%多聚甲醛溶液在室溫下固定1 h，15%和30%蔗糖溶液在室溫下分別梯度脫水1 d，OCT包埋劑包埋，4μm厚度冰凍切片，得到的冰凍切片分別進(jìn)行甲苯胺藍(lán)、阿爾新藍(lán)、天狼星紅組織學(xué)染色。

1.2 實驗觀察

圖1 單層培養(yǎng)hASCs 3周后阿爾新藍(lán)染色GM：生長培養(yǎng)基A：成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基A B：成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基B C：成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基CFig.1 Alcian blue staining of hASCs in monolayer cultures treated with growth medium(GM)and chondrogenic induction medium A,B and C for 3 weeksGM:growth medium；A:chondrogenic induction medium A；B:chondrogenic induction medium B；C:chondrogenic induction medium C

1.2.1 阿爾新藍(lán)染色 PBS清洗3次貼壁細(xì)胞和冰凍切片，4%多聚甲醛固定10 min，阿爾新藍(lán)染液染色20 min，PBS清洗3次，每次5 min，顯微鏡下拍照。

1.2.2 甲苯胺藍(lán)染色 取細(xì)胞切片，PBS清洗3次，1%甲苯胺藍(lán)染液（1 g甲苯胺藍(lán)+99 ml雙蒸水）染色15 min，流水沖洗10 min，風(fēng)干，顯微鏡下拍照。

1.2.3 天狼星紅染色 取細(xì)胞切片，PBS清洗3次，天狼星紅染液染色30 min，流水稍沖洗去除表面染液，蘇木素染液染細(xì)胞核10 min，流水沖洗10 min，自然風(fēng)干，顯微鏡下拍照。

1.2.4 Western blot實驗 貼壁細(xì)胞PBS清洗3次，全蛋白提取試劑盒冰上裂解10 min，刮下細(xì)胞置于EP管，4℃、12 000 rpm離心5 min，取上清加入1/4體積的5×上樣緩沖液，95℃水浴10 min。SDS-PAGE膠電泳，半干法轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗孵育1 h，TBST洗凈，二抗孵育1 h，TBST洗凈后曝光。

2 結(jié)果

2.1 單層培養(yǎng)3周的阿爾新藍(lán)染色

分別用生長培養(yǎng)基（GM）和A、B、C 3種軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3周的單層培養(yǎng)的hASCs進(jìn)行阿爾新藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)，較GM組，3個軟骨誘導(dǎo)處理組出現(xiàn)不同程度的著色，著色差異較大，C組比A組和B組藍(lán)染更深（圖1）。

2.2 單層培養(yǎng)3周細(xì)胞的Western blot實驗

提取生長培養(yǎng)基（GM）組和A、B、C成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理3周的單層培養(yǎng)的hASCs的全蛋白，經(jīng)Western blot檢測各組軟骨標(biāo)志物，蛋白條帶半定量分析顯示C組軟骨標(biāo)志物表達(dá)高于A組和B組（圖2）。結(jié)合單層培養(yǎng)3周的阿爾新藍(lán)染色結(jié)果，C組成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果優(yōu)于A、B組。

圖2 單層培養(yǎng)hASCs 3周后蛋白樣品的Western blot條帶GM：生長培養(yǎng)基 A：成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基A B：成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基B C：成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基CFig.2 Western blot bands of monolayer cultured hASCs protein samples were treated with growth medium(GM)and chondrogenic induction medium A,B and Cfor 3 weeksGM:growth medium；A:chondrogenic induction medium A；B:chondrogenic induction medium B；C:chondrogenic induction medium C

2.3 微球培養(yǎng)3周的阿爾新藍(lán)、甲苯胺藍(lán)、天狼星紅染色

實驗不僅比較了單層培養(yǎng)A、B、C成軟骨誘導(dǎo)效果，還進(jìn)行了微球培養(yǎng)hASCs 3組軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的比較。各組微球冰凍切片后行阿爾新藍(lán)、甲苯胺藍(lán)、天狼星紅染色，可見在3種染色中C組著色均高于A組和B組，這說明微球培養(yǎng)C組的誘導(dǎo)效果也優(yōu)于A、B組（圖3～5）。

圖3 微球培養(yǎng)hASCs 3周后冰凍切片阿爾新藍(lán)染色GM：生長培養(yǎng)基A：成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基A B：成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基B C：成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基CFig.3 Alcian blue staining was performed on the frozen sections of hASCs in microsphere culture treated with growth medium(GM)and A,B,and C chondrogenic induction medium for 3 weeksGM:growth medium A:chondrogenic induction medium A B:chondrogenic induction medium B C:chondrogenic induction medium C

圖4 微球培養(yǎng)hASCs 3周后冰凍切片甲苯胺藍(lán)染色GM：生長培養(yǎng)基A：成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基A B：成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基B C：成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基CFig.4 Toluidine blue staining was performed on the frozen sections of hASCs in microsphere culture treated with growth medium(GM)and A,B,and C chondrogenic induction medium for 3 weeksGM:growth medium A:chondrogenic induction medium A B:chondrogenic induction medium B C:chondrogenic induction medium C

圖5 微球培養(yǎng)hASCs 3周后冰凍切片天狼星紅染色GM：生長培養(yǎng)基A：成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基A B：成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基B C：成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基CFig.5 Sirius red staining was performed on the frozen sections of hASCs microsphere culture treated with growth medium(GM)and A,B,and C chondrogenic induction medium for 3 weeksGM:growth medium A:chondrogenic induction medium A B:chondrogenic induction medium B C:chondrogenic induction medium C

3 討論

FBS中含有多種類型的細(xì)胞因子和激素等，被廣泛用于輔助細(xì)胞增殖和分化的補充劑，有研究表明將FBS添加到軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中可抑制間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的成軟骨分化[10]。本研究比較了在成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別添加FBS和ITS的成軟骨誘導(dǎo)效果，C組（ITS組）的軟骨誘導(dǎo)水平高于B組（FBS組），因此無論是單層培養(yǎng)還是微球培養(yǎng)，相比FBS，添加ITS在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中是更好的選擇。

TGF-β3廣泛應(yīng)用于軟骨組織工程，而其在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中最適合的終濃度見仁見智。本實驗比較了添加10 ng/ml和1 ng/ml至軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中處理hASCs的分化效果，顯示單層培養(yǎng)和微球培養(yǎng)均為C組（10 ng/ml）軟骨標(biāo)志物水平高于B組（1 ng/ml）。因此軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加10 ng/ml的TGF-β3成軟骨效果優(yōu)于1 ng/ml。需要強調(diào)的是，MSCs的成軟骨誘導(dǎo)效果與多種因素相關(guān)，選取不同來源的MSCs，或者應(yīng)用不同的細(xì)胞支架可能會得到不同的結(jié)果。設(shè)若選取不同濃度的FBS、ITS、TGF-β3進(jìn)行實驗（如降低A組的FBS濃度），可能會有不同的發(fā)現(xiàn)。

總之，本實驗在一定程度上說明在對hASCs成軟骨誘導(dǎo)時添加ITS效果優(yōu)于FBS；TGF-β310 ng/ml的濃度優(yōu)于1 ng/ml。