miR-146a通過靶向CCNJ調(diào)控鼻咽癌細胞HNE-1/DDP對順鉑敏感性的影響

周蘭柱，趙報，張明潔，崔憶旋，吳俊，孫哲，柳申成，王文忠

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科，安徽 蚌埠 233000

鼻咽癌是我國高發(fā)病率的頭頸部惡性腫瘤之一，起源于鼻咽黏膜上皮。它在亞洲具有明顯的地理分布特征，特別是在我國的廣東省，年發(fā)病率從每10萬人中15至50例不等[1]。雖然近年來窄帶成像內(nèi)鏡對鼻咽癌的診斷有了極大的幫助[2]，但由于鼻咽癌發(fā)病部位隱蔽，且具有高侵襲、高轉(zhuǎn)移的特點，多數(shù)患者因頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而就診，故而發(fā)現(xiàn)時已至中晚期。目前鼻咽癌多采用放射治療、化學(xué)治療或同步放化療，已實現(xiàn)較為不錯的局部控制[3]，但最終治療結(jié)果和預(yù)后不盡如人意，且化療后會產(chǎn)生細胞耐藥，導(dǎo)致鼻咽癌患者預(yù)后較差，后期容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[4]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種單鏈、具有19～25個核苷酸的非編碼小RNA的超家族，可以結(jié)合其靶基因的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR），導(dǎo)致mRNA切割或/和翻譯抑制，從而使靶蛋白的表達水平發(fā)生改變。研究表明，miRNA參與各種生物過程的調(diào)節(jié)，包括胚胎發(fā)育，細胞周期，分化，增殖，遷移和凋亡[5,6]。近年來，miRNA在治療腫瘤以及腫瘤細胞耐藥方面嶄露頭角[7～9]，miR-146a已經(jīng)被證明具有抑制多種腫瘤細胞侵襲和遷移能力，例如宮頸癌、甲狀腺癌、乳腺癌、胰腺癌以及肺癌等[5,10～13]。然而，還沒有HNE-1/DDP細胞上調(diào)miR-146a的相關(guān)報道。本研究分析上調(diào)miR-146a對HNE-1/DDP細胞對順鉑（DDP）敏感性的作用及可能機制，為臨床DDP耐藥的鼻咽癌患者增加新的治療方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

人鼻咽癌耐DDP細胞株HNE-1/DDP購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胰蛋白酶（含EDTA）購自上海生工，苯甲基磺酰氟化物（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）購自上海碧云天公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自浙江天杭生物科技股份有限公司，Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，順鉑（DDP）粉劑由美國Sigma公司生產(chǎn)，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，增強型化學(xué)發(fā)光底物（enhanced chemiluminescent，ECL）試劑盒購自美國Pierce公司，雙染細胞凋亡檢測試劑盒（Annexin VFITC/PI）、BCA蛋白定量試劑盒購于上海碧云天公司，miR-146a類似物、陰性對照序列購于上海吉瑪公司，SYBR Premix Ex Tap TM試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，MRP1、P-gp、β-actin、CCNJ抗體購自美國CST公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取出凍存的HNE-1/DDP細胞，放入37℃水浴鍋中來回搖動使其融化，細胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，離心機900 r/min離心4 min，棄上清，加入8 ml培養(yǎng)基包含10%FBS和1μg/ml DDP，移至培養(yǎng)皿，放入5%CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中。為保持細胞的耐藥性，培養(yǎng)過程中持續(xù)使用含DDP的RPMI培養(yǎng)基，若需進行細胞實驗，提前48 h使用無DDP的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 選取對數(shù)期生長的HNE-1/DDP細胞接種于6孔板中，分為空白組、陰性對照組、mimicsmiR-146a組。各組細胞生長至70%時，開始進行mimics-miR-146a組、陰性對照組的轉(zhuǎn)染，具體步驟為：根據(jù)說明書，將8μl miR-146a類似物、陰性對照物（NC）分別加入含有400μl RPMI培養(yǎng)液的無酶EP管中，混勻靜置5 min后分別與lip 2000混勻，靜置20 min，分別加入6孔板，空白組只加入lip 2000，用RPMI培養(yǎng)液將每孔體積調(diào)整至2 ml，重復(fù)3次。將細胞置入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，8 h后更換為含10%FBS但不含雙抗的RPMI培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24 h收集細胞進行MTT實驗、Annexin V-FITC/PI雙染實驗，轉(zhuǎn)染48 h后進行Western blot蛋白免疫印跡實驗和實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-qPCR）。

1.2.3 MTT檢測轉(zhuǎn)染后HNE-1/DDP細胞對順鉑敏感性的變化 胰酶消化收集轉(zhuǎn)染后空白組、NC組、mimics-miR-146a組的HNE-1/DDP細胞分別按5000個/孔接種于3個96孔板，培養(yǎng)24 h，吸去原培養(yǎng)液，按照每96孔板設(shè)置6個濃度梯度分別加入終濃度為（0、2、4、8、16、32）μmol/L的含DDP培養(yǎng)液，以不接種細胞而只加培養(yǎng)基的孔作為調(diào)零孔，以不加藥的孔作為對照組，每個濃度設(shè)10個復(fù)孔，給藥后培養(yǎng)48 h，檢測其490 nm處吸光度。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡 選取對數(shù)期生長的鼻咽癌HNE-1/DDP細胞，消化離心，每孔25×104個細胞接種于6孔板，待貼壁生長至70%開始轉(zhuǎn)染，共分成3組，分別為空白組、陰性對照組、mimics-miR-146a組。轉(zhuǎn)染后24 h，miR-146a孔、空白對照孔、陰性對照孔均加入8μmol/L DDP2 ml處理細胞，放回5%CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后用不含EDTA的胰酶消化細胞加入1.5 ml的離心管中，600 g/min離心5 min，PBS清洗兩次，加入200μl Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細胞，加入1.5μl Annexin V-FITC染色液混勻，避光冰浴15 min；加入1.5μl PI染色液，流式細胞儀測出細胞凋亡率，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 RT-qPCR檢測細胞 將轉(zhuǎn)染48 h的細胞從6孔板消化收集，PBS洗滌，1500 g/min離心5 min，棄上清，加入1 ml Trizol試劑，混勻后移至無RNA酶的1.5 ml EP管中，冰上裂解10 min，加入0.2 ml預(yù)冷的氯仿，劇烈震蕩混勻約15 s，在冰上放置3 min，使用4℃離心機進行離心（12000 r/min，15 min）。取上層無色水相至無RNA酶EP管，加入異丙醇混勻，冰浴20 min，4℃離心機離心10 min（12000 r/min），可見白色沉淀，棄上清。使用預(yù)冷的75%無RNA酶的乙醇洗滌2次，室溫干燥。加入0.1%DEPC水溶解后冰上保存。經(jīng)Nano Vue TM Plus分光光度儀檢測RNA樣品濃度和純度，分別讀取A260和A280吸光度值，重復(fù)3次取平均值。根據(jù)制造商的說明書進行miRNA或mRNA的定量。使用的RT-qPCR引物如下：CCNJ正向序列：5'-TGTCCGTCAGAACCCATGC-3'，反向序列：5'-AAAGTCGAAGTTCCATCGCTC-3'；GAPDH正向序列：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'和反向序列：5'-TGGT GAAGACGCCAGTGGA-3'。循環(huán)條件如下：在95℃下初始變性60 s，95℃下5秒，58℃下20 s，40個循環(huán)。

1.2.6 Western blot（蛋白免疫印跡法）檢測蛋白表達水平 收集各組細胞，加入含PMSF的裂解液，冰上裂解30 min，放入-20℃冰箱過夜，離心30 min（12000 r/min），留取上清液。BCA法測出蛋白濃度，調(diào)整每組樣本所需上樣量相同，將各組樣本加入蛋白凝膠內(nèi)，90 V恒壓電泳，200 mA恒流將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。室溫搖床，使用5%脫脂奶粉進行封閉2 h，使用TPBS洗滌5 min，重復(fù)3次。按1：1000稀釋CCNJ一抗，搖床1 h后，4℃孵過夜，次日用HRP標(biāo)記的山羊抗兔（二抗）孵育2 h。使用凝膠成像系統(tǒng)進行曝光，使用β-actin內(nèi)參。獲取圖像后用Image J分析軟件計算灰度值，從而計算蛋白表達量，每組實驗獨立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)，服從或近似服從正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。當(dāng)P＜0.05時，認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT實驗

MTT結(jié)果顯示，上調(diào)HNE-1/DDP中miR-146a，細胞存活率較空白組、陰性對照組組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），由此可知上調(diào)miR-146a可提高HNE-1/DDP細胞對DDP的敏感性，降低細胞耐藥性(圖1)。

圖1 MTT檢測細胞存活率統(tǒng)計圖上調(diào)miR-146a使HNE-1/DDP細胞存活率降低*P＜0.05，**P＜0.01，與陰性對照組及空白組比較Fig.1 Statistical chart of cell survival rate detected by MTTUp-regulated miR-146a reduces cell survival rate of HNE-1/DDP*P＜0.05,**P＜0.01,compared with blank control group and negative control group

2.2 流式細胞儀檢測

根據(jù)Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)果，mimics-miR-146a組細胞的凋亡率較其他兩組升高，由此可知，上調(diào)miR-146a可使HNE-1/DDP細胞對DDP的敏感性提高，從而促進細胞發(fā)生凋亡(圖2)。

圖2 流式細胞儀檢測結(jié)果,上調(diào)miR-146a使HNE-1/DDP細胞凋亡率升高Mock+DDP：空白組NC+DDP：陰性對照組miR-146a+DDP：mimics-miR-146a組Fig.2 Detection result by flow cytometry,up-regulated miR-146a to increase apoptosis rate of HNE-1/DDPMock+DDP:blank control group；NC+DDP:negative control group；miR-146a+DDP：mimics-miR-146a group

2.3 RT-qPCR檢測

由RT-qPCR結(jié)果可知，mimics-miR-146a組中CCNJ的mRNA的相對表達水平較陰性對照組和空白對照組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05，如圖3。

2.4 Western blot檢測

Western blot檢測結(jié)果顯示，mimics-miR-146a組的p53、caspase3以及CCNJ蛋白的相對表達量較陰性對照組、空白對照組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），當(dāng)CCNJ下降時，其使得下游耐藥性相關(guān)蛋白如P-gp，MRP1含量降低，繼而提高細胞對DDP的敏感性(圖4)。

3 討論

鼻咽癌是耳鼻喉科常見的惡性腫瘤，發(fā)病部位隱蔽，病情發(fā)展迅速，預(yù)后差，復(fù)發(fā)率高，確診后以放化療為主。但放化療副作用較大，故如何以最小的劑量獲得最大的療效成為當(dāng)代治療惡性腫瘤的主旨。miRNA家族是一種單鏈非編碼小RNA的超家族，以其豐富的作用成為近年來研究的熱點。大量研究證明，不同miRNA或可抑制腫瘤或可誘發(fā)腫瘤，且對腫瘤細胞的侵襲、增殖、遷移能力都有調(diào)控作用[14～17]；其在降低非小細胞肺癌等腫瘤耐藥性方面有突出療效[5]，還具有抑制乳腺癌和胰腺癌的侵襲和遷移能力的潛力。miR-146a還可促進動脈粥樣硬化形成[18,19]。

圖3 RT-qPCR檢測結(jié)果統(tǒng)計圖上調(diào)miR-146a使HNE-1/DDP細胞中CCNJmRNA表達降低*P＜0.05，與陰性對照組及空白組比較Fig.3 Statistical chart of detection result by RT-qPCRUp-regulated miR-146a reduces the expression of CCNJmRNA in HNE-1/DDP*P＜0.05,compared with negative control group and blank control group

CCNJ是細胞周期蛋白家族成員，通過形成CDK2/CCNJ復(fù)合物來控制參與腫瘤發(fā)生和胚胎發(fā)生的細胞有絲分裂[20,21]。在體外，抑制CCNJ蛋白表達可以修復(fù)乳腺癌和胃癌細胞的增殖能力[22]。研究表明，CCNJ蛋白可能是肝癌（HCC）和急性白血病（ALM）的新型預(yù)后標(biāo)志物[23,24]。

本組曾研究miR-146a可降低HNE-1/DDP的耐藥性，提高對DDP的敏感性，本次MTT實驗證實上調(diào)miR-146a后細胞增殖率降低；Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)果顯示加入相同濃度的DDP，細胞凋亡率升高；通過RT-qPCR檢測到mimics-miR-146a組CCNJmRNA較其他兩組降低；Western blot顯示CCNJ蛋白較其他兩組降低，其下游信號分子P-gp、MRP1相對表達量降低，證明CCNJ可能是其重要靶點之一。因此推斷，上調(diào)miR-146a可提高HNE-1/DDP細胞對DDP的敏感性，作用機制可能是上調(diào)miR-146a能夠抑制細胞周期素相關(guān)蛋白CCNJ的表達進而調(diào)控下游信號分子MRP1、P-gp，從而降低細胞耐藥性。

圖4 Western blot檢測結(jié)果上調(diào)miR-146a使HNE-1/DDP細胞中CCNJ、P-gp、MRP1蛋白含量降低A：蛋白印跡實驗結(jié)果B：MRP1蛋白相對表達量統(tǒng)計圖C：P-gp蛋白相對表達量統(tǒng)計圖D：CCNJ蛋白相對表達量統(tǒng)計圖Mock：空白組NC：陰性對照組miR-146a：mimics-miR-146a組*P＜0.05，**P＜0.01，與相應(yīng)的陰性對照組及空白組比較Fig.4 Western blot detection resultUp-regulated miR-146a reduces the protein level of CCNJ、P-gp、MRP1 in HNE-1/DDPA：Result of Western blot；B：Statistical chart of protein relative expression level of MRP1；C：Statistical chart of protein relative expression level of P-gp；D：Statistical chart of protein relative expression level of CCNJ；Mock：blank control group；NC：negative control group miR-146a：mimics-miR-146agroup*P＜0.05,**P＜0.01,compared with negative control group and blank control group

本實驗表明上調(diào)miR-146a可提高HNE-1/DDP細胞對DDP的敏感性，減少常規(guī)化療藥物產(chǎn)生耐藥性的弊端，為鼻咽癌的臨床治療提供了新思路，為廣大化療效果不明顯的患者提供了希望，但其詳細機制尚需反復(fù)驗證，并需要進行活體實驗以確定在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境中miR-146a與DD聯(lián)用對鼻咽癌的治療效果。