規(guī)模化羊場(chǎng)支原體感染的流行病學(xué)調(diào)查

王雅雯，李仕林，姜水兵，郭良帥，努爾麥麥提·麥麥提敏，焦海宏

（塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾843300）

綿羊肺炎支原體（Mycoplasmasheep pneumoniae）是由綿羊支原體（Mycoplasma ovis，MO）引起的具有傳染性的典型性肺炎[1-3]。綿羊和山羊均可感染支原體，且羔羊的發(fā)病率和死亡率較高，成為危害養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展的主要傳染病之一。支原體肺炎臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、腹式呼吸、漸進(jìn)性消瘦及增生性、化膿性肺炎。單純由綿羊支原體引起的綿羊肺炎支原體通常呈慢性肺炎，早期大多數(shù)病羊沒(méi)有明顯臨床癥狀，當(dāng)與其他病原體交叉感染或發(fā)生應(yīng)激時(shí)會(huì)出現(xiàn)常見(jiàn)的肺炎感染癥狀，感染率和死亡率較高[4]。研究表明，綿羊支原體不僅在患病羊的肺中可以分離得到，在健康羊的肺中也可分離得到[5-8]。

近幾年，國(guó)內(nèi)部分省先后開(kāi)展區(qū)域性綿羊支原體感染的流行病學(xué)調(diào)查。綿羊支原體本身并不會(huì)對(duì)宿主機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p害，通常只是慢性肺炎，只有在繼發(fā)性感染其他病原體或發(fā)生應(yīng)激時(shí)才會(huì)導(dǎo)致病情發(fā)展成常見(jiàn)的肺炎感染癥狀[9]。綿羊支原體對(duì)山羊和綿羊有很強(qiáng)的致病性，綿羊感染后發(fā)病率很高。近年來(lái)，此病的死亡率不斷上升，嚴(yán)重威脅著綿羊和山羊的生產(chǎn)效率，可為羊養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

規(guī)?；驁?chǎng)采集羊血液樣品169份；烏什某規(guī)?；驁?chǎng)病羊組織樣品2份；某規(guī)模化羊場(chǎng)羊血清DNA樣本15份；塔里木大學(xué)試驗(yàn)站的疑似病例鼻拭子2份、病死羊1只。

1.2 試驗(yàn)試劑

TE緩 沖 液、2XPowerTaqPCRMasterMix、D2000、GeneGreen核酸染料購(gòu)自北京天根生物工程有限公司；DNAzolReagent購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司；羊支原體抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳市豫崧生物技術(shù)有限公司。

1.3 分子鑒定

根據(jù)患病羊的流行病學(xué)資料、臨床癥狀和解剖病理變化等，初步判斷為支原體感染。根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]中的已知引物序列進(jìn)行分析驗(yàn)證，合成支原體屬綿羊支原體檢測(cè)引物。lmf：GACTTCATCCTGCACTCTGT；lmr：TGAACGGAATATGTTAGCTT，產(chǎn)物長(zhǎng)度361 bp，由北京華大基因進(jìn)行合成。使用DNAzol Reagent提取疑似發(fā)病羊的肺臟、脾臟、鼻拭子樣品的DNA，具體操作步驟均參考說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以提取的DNA為模板，采用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25μL）：2×Power Taq PCR MasterMix12.5μL、去離子水9.5μL、提取DNA 2μL、上下游引物各0.5μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸50 s，72℃延伸5 min，35個(gè)循環(huán)，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電泳完成后在凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

1.4 血清抗體監(jiān)測(cè)

對(duì)規(guī)?；驁?chǎng)的羊血清進(jìn)行羊支原體抗體檢測(cè)，檢測(cè)方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。試驗(yàn)建立的前提條件為陰性對(duì)照（N）OD值＜0.2，且陽(yáng)性對(duì)照（P）OD值＞0.5。判定標(biāo)準(zhǔn)：S/P值=樣品OD值/陽(yáng)性對(duì)照OD平均值，S/P值≥0.4則為陽(yáng)性；S/P值＜0.4則為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 解剖病理變化

病羊病理變化主要為肺泡充血、病變部位肺容積增大、斷面光滑、肺放入水中不下沉、肺組織變軟。

2.2 支原體病原學(xué)檢查結(jié)果（見(jiàn)圖1）

圖1 綿羊支原體基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of Mycoplasma ovis gene fragments

支原體病原學(xué)檢查結(jié)果陽(yáng)性樣品4個(gè)，其中烏什綿羊場(chǎng)1個(gè)；某規(guī)?；驁?chǎng)3個(gè)，陽(yáng)性率為26.67%（4/15）；試驗(yàn)站疑似病例未檢出。

由圖1可知，4份陽(yáng)性樣品基因片段均在361 bp，與支原體通用引物基因片段一致。

2.3 綿羊支原體肺炎血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表1）

表1 綿羊肺炎支原體血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Serological test results of Mycoplasma sheep pneumoniae

由表1可知，阿拉爾市陽(yáng)性率為58.82%；沙雅縣陽(yáng)性率為84.00%；民豐縣陽(yáng)性率為48%；策勒縣陽(yáng)性率為50.00%；烏什縣42.11%，5個(gè)縣合計(jì)陽(yáng)性率為52.07%。

3 討論

綿羊肺炎支原體是綿羊養(yǎng)殖過(guò)程中常見(jiàn)的呼吸道傳染病之一，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展造成極大的影響.長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)對(duì)綿羊肺炎支原體沒(méi)有得到較好的控制。該病原可長(zhǎng)期存在動(dòng)物體內(nèi)，難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)出現(xiàn)明顯的臨床癥狀時(shí)往往發(fā)病較為嚴(yán)重，易造成死亡。

本次試驗(yàn)通過(guò)使用PCR和ELISA方法檢測(cè)規(guī)?；驁?chǎng)進(jìn)行綿羊支原體。PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率為26.67%。經(jīng)序列對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)的PCR產(chǎn)物與NCBI公布的1株美國(guó)肺炎支原體分離株和1株土耳其綿羊肺炎支原體分離株同源性為100%。分子生物學(xué)證明本試驗(yàn)檢測(cè)到的為綿羊肺炎支原體。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，南疆各規(guī)?；驁?chǎng)綿羊肺炎支原體的陽(yáng)性率為52.07%。烏什縣某規(guī)模化羊廠中有7份樣品的S/P值大于1，經(jīng)過(guò)臨床觀察該7只羊都有明顯的呼吸道癥狀，表明樣品的S/P值大于1，臨床上會(huì)出現(xiàn)明顯羊支原體肺炎的癥狀，而其他羊存在著支原體感染，只是在臨床上未表現(xiàn)出來(lái)。

剡文亮等[11]研究表明，新疆5個(gè)地區(qū)的規(guī)?；驁?chǎng)的羔羊血清綿羊支原體抗體陽(yáng)性率為46.66%～100.00%，表明5個(gè)地區(qū)的羊場(chǎng)都被綿羊支原體感染；山羊肺炎支原體抗體陽(yáng)性率為19.05%～58.33%,說(shuō)明山羊肺炎支原體抗體和抗原陽(yáng)性低于綿羊支原體陽(yáng)性率。吳錦艷等[12]研究表明，國(guó)內(nèi)部分地區(qū)羊血清中綿羊支原體陽(yáng)性率為31.92%，山羊支原體山羊肺炎亞種陽(yáng)性率為10.67%，說(shuō)明我國(guó)養(yǎng)羊地區(qū)大多都存在羊支原體肺炎的感染。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率為26.67%。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，南疆各規(guī)?；驁?chǎng)綿羊肺炎支原體的陽(yáng)性率為52.07%。結(jié)果提示，羊場(chǎng)應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和本病的防控。