溫針灸對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠P53、Map2k3和PGE2的影響

王華敏,宓軼群,趙媛媛,張永亮

(1.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院,上海 200233;2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院,石家莊 050000)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis, KOA)是一種多發(fā)生于中老年人的慢性骨關(guān)節(jié)炎疾病,關(guān)節(jié)軟骨退變、滑膜增生與炎癥是該病的主要病理特征。該病具有高發(fā)病率、高增長(zhǎng)率和高致殘率。有文獻(xiàn)研究表明前列腺素E2與KOA發(fā)病關(guān)系密切[1-2]。近年來相關(guān)研究表明KOA的發(fā)病與多條信號(hào)通路中的相關(guān)mRNA調(diào)控有關(guān)[3-4],本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè) KOA大鼠外周血清中前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)含量及滑膜組織中腫瘤抑制蛋白P53(Tumor proteinp53, P53)和促分裂原活化蛋白激酶 3 (Mitogen-activated proteinkinase kinase 3, Map2k3)mRNA的表達(dá)情況,探討溫針灸治療KOA的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

28只健康的清潔級(jí)雄性 3月齡 SD大鼠,體質(zhì)量(270±30)g,購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司[生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2013-0016]。飼養(yǎng)環(huán)境自然光每日光照12 h,溫度18℃～22℃,相對(duì)濕度50%～70%,每籠7只,自由飲水、攝食,常規(guī)飼養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、藥物組和溫針灸組,每組7只。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.2 主要試劑和儀器

小艾炷(上海泰成科技發(fā)展有限公司),針灸針(固始公元醫(yī)療器械有限公司),美洛昔康片(7.5 mg/片,國(guó)藥準(zhǔn)字 H20020217,上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司),papain(P-3250,Sigma公司),EDTA、NaOH、NaCl、Na2HPO4、HCl(上?；瘜W(xué)試劑公司),離心機(jī)(Sigma公司),MK3型酶標(biāo)儀(Thermo公司),PGE2ELISA檢測(cè)試劑盒(KGE004B,RD公司),RNA酶抑制劑(RG90925,Epicentre公司),SuperScriptTMⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶、5×RT緩沖液(Invitrogen公司),Primer(英駿生物技術(shù)有限公司)。其他涉及的試劑設(shè)備和儀器均由上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3 溶液配制

木瓜蛋白酶(papain)溶液的制備[5]方法為 32 mL雙蒸水中加入0.05 g NaH2PO4、0.72 g Na2HPO4、0.04 g NaOH和1.6 g NaCL,混合輕攪溶解后加入NaOH,pH濃度調(diào)至8.0,加0.64 g papain和15 mg EDTA-2Na,輕攪溶解后液體呈淡黃色,最后加入 HCL將 pH值調(diào)至6.5,雙蒸水定溶至40 mL后低溫保存。美洛昔康溶液的制備,選用臨床抗炎鎮(zhèn)痛療效顯著的美洛昔康片,將其碾磨粉碎后溶解于生理鹽水,反復(fù)搖勻后制成0.5 mg/mL溶液。

1.4 模型制備

除正常組外,其余3組采用關(guān)節(jié)腔注射papain結(jié)合被動(dòng)運(yùn)動(dòng)的方法造模[6-7],準(zhǔn)備好配制好的papain溶液、手套和75%醫(yī)用乙醇棉球等,將大鼠固定在解剖板,充分暴露并屈曲雙側(cè)后肢45°,常規(guī)消毒3遍關(guān)節(jié)腔周圍的皮膚,注射器快速破皮后斜刺入關(guān)節(jié)腔,當(dāng)針下有落空感時(shí)外提回抽無血即可注射papain溶液。根據(jù)臨床過度運(yùn)動(dòng)易損傷關(guān)節(jié)造成炎癥反應(yīng)的特點(diǎn),無固定狀態(tài)下用自制滾筒每天強(qiáng)迫大鼠超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)15 min;3組大鼠分別于第1天、第4天、第7天關(guān)節(jié)腔注射 papain,單膝單次注射 0.1 mL,2周后通過Lequesne MG膝關(guān)節(jié)級(jí)別評(píng)估,觀察局部反應(yīng)、步態(tài)反應(yīng)、關(guān)節(jié)活動(dòng)和關(guān)節(jié)腫脹4個(gè)方面,與正常組相比,造模的 3組大鼠差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Kruskal-Wallis分析局部反應(yīng),P=0.00039;步態(tài),P=0.00037;關(guān)節(jié)活動(dòng),P=0.00025;關(guān)節(jié)腫脹,P=0.00048),提示動(dòng)物模型制備成功。詳見表1。

表1 造模后各組大鼠膝關(guān)節(jié)評(píng)估 (例)

1.5 干預(yù)方法

正常組與模型組采用與溫針灸組相同的抓取和固定,余不做特殊處理。溫針灸組誘導(dǎo)大鼠進(jìn)入固定器后仰臥固定于解剖板,將大鼠后肢雙側(cè)膝關(guān)節(jié)彎曲 45°便于關(guān)節(jié)腔的暴露和穴位的定位,揣摩并定位大鼠“膝前穴”(后肢膝蓋前方),穴位定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》及相關(guān)文獻(xiàn)[8-9],用 75%乙醇棉球消毒 3遍后持 0.25×25 mm針灸針迅速刺入,刺入深度為5～7 mm,隨后將長(zhǎng)度為7 mm,直徑為5 mm,重量為0.5 g的小艾炷插入并固定于針柄處,點(diǎn)燃后其燃燒完成后換另外一炷,待其充分燃燒完成后即可拔掉針灸針(約為 10 min),每日1次,每次2壯,連續(xù)治療10 d。藥物組抓緊大鼠背部皮膚,垂直固定身體,充分后仰頭部便于打開嘴巴,將灌胃針沿咽后壁方向從嘴角慢慢插入,當(dāng)進(jìn)針深度約為4～5 mm時(shí)回抽觀察是否有氣泡,如若無氣泡則可慢慢推注,推完后迅速出針,藥物組大鼠灌胃后采用與溫針灸組相同的抓取和固定。根據(jù)人和大鼠體質(zhì)量換算比例 SD大鼠服用美洛昔康溶液的劑量為3.75 mg/kg,每日1次,連續(xù)灌胃10 d。

1.6 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

治療結(jié)束后采用腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后處死大鼠,腹主動(dòng)脈采血 5～10 mL,滴入離心管,隨后以3000 rpm/min,離心3 min,分離出血清,-80℃保存,留待ELISA檢測(cè)。摘取大鼠的雙側(cè)膝關(guān)節(jié),切開皮膚逐層打開并充分暴露關(guān)節(jié)腔,手術(shù)刀沿髕骨下緣向上鈍性分離和剝?nèi)』そM織,將分離好的滑膜組織放入離心管中置于-80℃冰箱保存,留待HE染色和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。

1.6.1 組織形態(tài)學(xué)觀察

采用HE染色觀察4組大鼠滑膜組織形態(tài)學(xué)改變。將滑膜組織浸泡于10%的福爾馬林溶液中,24 h后取出行脫水處理,脫水完成后浸泡于二甲苯中,待組織透明后進(jìn)行石蠟包埋處理,切片處理后貼到載玻片上,放入45℃恒溫箱中烘干;染色之前需要將切片中的蠟塊祛除,具體步驟為將切片放置于二甲苯中 30 min,置于100%乙醇中10 min,置于80%乙醇中5 min,置于蒸餾水中5 min后即可染色。蘇木精染色、沖洗、脫水、伊紅染色、沖洗、封片,最后在電子顯微鏡下觀察各組切片染色結(jié)果。

1.6.2 血清PGE2蛋白含量檢測(cè)

依據(jù)ELISA試劑盒操作步驟檢測(cè)血清PGE2蛋白含量。取出血清和 ELISA試劑盒,室溫下平衡,設(shè)立 10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔,2個(gè)非特異結(jié)合孔,其他為樣品孔,先后加入150 μL相應(yīng)的試劑和樣品,50 μL一抗(除了非特異結(jié)合孔),封板,置于水平搖床(500±50)rpm孵育1 h;不洗板,每孔加入 50 μL PGE2結(jié)合液,封板,室溫?fù)u床孵育2 h;置于自動(dòng)洗板機(jī)上,Wash Buffer洗板4次。每孔加200 μL底物溶液,避光靜置孵育30 min。每孔加入100 μL終止液后,30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度和濃度。

1.6.3 P53和Map2k3 mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)定量 PCR法檢測(cè),取滑膜組織樣品加入Trizol試劑混合勻漿,通過氯仿,異丙醇進(jìn)行RNA的提取,紫外吸收法測(cè)定 RNA的濃度和純度;將提取好的RNA樣品進(jìn)行cDNA的合成,完成后-20℃冰箱保存;將所有的cDNA樣品分別配置Realtime PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng),P53 mRNA、Map2k3 mRNA和管家mRNA GAPDH的濃度結(jié)果由機(jī)器生成,采用 GAPDH作為內(nèi)參來校正差異,結(jié)果選用待測(cè) mRNA相對(duì)含量(每個(gè)樣品的濃度除以其管家的濃度,即為此樣品mRNA校正后的相對(duì)含量)。實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表詳見表2。

表2 引物列表

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0軟件統(tǒng)計(jì)分析各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析;不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù),(四分位數(shù))表示,兩獨(dú)立樣本組間比較用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 滑膜組織形態(tài)學(xué)觀察

正常組可見大量的脂肪細(xì)胞和滑膜細(xì)胞,模型組可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),藥物組可見少量炎性細(xì)胞、部分脂肪細(xì)胞和增生的血管,溫針灸組可見少量炎性細(xì)胞散在分布。詳見圖1。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)比較(×200)

2.2 各組大鼠血清PGE2含量比較

與正常組比較,其他3組PGE2含量均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較,溫針灸組、藥物組 PGE2含量均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而溫針灸組與藥物組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠血清PGE2蛋白含量比較 [M,(P25,P75)]

2.3 各組大鼠滑膜組織Map2k3 mRNA表達(dá)

Map2k3 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)資料不符合正態(tài)分布,4組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),各組大鼠滑膜組織Map2k3 mRNA表達(dá)無顯著差別。詳見表4。

表4 各組大鼠滑膜組織Map2k3 mRNA表達(dá)比較[M,(P25,P75)]

2.4 各組大鼠滑膜組織P53 mRNA表達(dá)

與正常組比較,模型組、溫針灸組和藥物組的大鼠滑膜組織中P53 mRNA均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較,溫針灸組大鼠滑膜組織中P53 mRNA均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而溫針灸組與藥物組,藥物組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表5。

表5 各組大鼠滑膜組織P53 mRNA表達(dá)比較 (±s)

表5 各組大鼠滑膜組織P53 mRNA表達(dá)比較 (±s)

注:與正常組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n P53/GAPDH正常組 7 0.03±0.02模型組 7 0.11±0.041)藥物組 7 0.08±0.011)溫針灸組 7 0.07±0.021)2)

3 討論

KOA又稱為退行性關(guān)節(jié)炎,是一種多發(fā)于中老年人,常累及滑膜、關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨,臨床以疼痛和功能活動(dòng)障礙為主的慢性骨關(guān)節(jié)疾病。常見的臨床表現(xiàn)包括活動(dòng)時(shí)關(guān)節(jié)的彈響和摩擦音,關(guān)節(jié)的疼痛腫脹和畸形,關(guān)節(jié)活動(dòng)不利和功能障礙。據(jù)報(bào)道我國(guó) KOA的整體患病率為 8.1%,最高為西南地區(qū)的 13.7%, 60歲以上達(dá)50%,75歲以上高達(dá)80%,患病率隨年齡的增長(zhǎng)而升高[10-11],KOA的高發(fā)病率和高致殘率,不僅影響個(gè)人生活質(zhì)量,也造成了一定的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

最近的研究表明 KOA和滑膜炎癥關(guān)系密切,滑膜對(duì)于維持正常的關(guān)節(jié)活動(dòng)功能是必需的,它是一種關(guān)節(jié)內(nèi)的間充質(zhì)組織,可以發(fā)生于KOA的早、中和晚期各個(gè)階段,發(fā)病時(shí)的滑膜組織多見滑膜層的增厚,炎性細(xì)胞的浸潤(rùn),彌漫性纖維增生和血管增生等[12-13]。從本次實(shí)驗(yàn)研究來看,正常的滑膜平滑光整、色澤淡紅,模型組滑膜水腫炎性滲出,色澤呈黃白色,可見明顯增生肥厚,鏡下可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。溫針組大鼠經(jīng)過治療后滑膜水腫減輕,色澤較模型組有明顯改善,鏡下炎性細(xì)胞數(shù)量明顯減少,可見溫針灸可以減輕 KOA的滑膜炎癥。

多種細(xì)胞炎性因子參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病進(jìn)程,包括白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子、一氧化氮、基質(zhì)金屬蛋白酶及 PGE2等,其中 PGE2是花生四烯酸環(huán)氧合酶的代謝產(chǎn)物,在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)中通過 COX-2作用生成進(jìn)而產(chǎn)生促炎致痛作用,參與諸多調(diào)節(jié)軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞的過程[14-15]。溫針灸可以通過降低KOA大鼠關(guān)節(jié)液和血清中 PGE2含量[16],這與本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,模型組中大鼠血清PGE2含量明顯高于正常組,進(jìn)一步證實(shí)了 PGE2升高與 KOA的發(fā)病有著密切關(guān)系。而與模型組比較溫針灸治療可以明顯降低大鼠血清PGE2含量,溫針灸組與藥物組比較無顯著差異,說明針灸可以通過降低PGE2表達(dá)水平進(jìn)而起到抗炎的作用。

近年來的研究表明 P53是一種抑癌蛋白,同時(shí)也是一種轉(zhuǎn)錄因子,在細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)可被誘導(dǎo)表達(dá),它能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡,調(diào)控炎癥反應(yīng),同時(shí)還具有調(diào)控代謝的作用。Zhu X等[17]研究表明在KOA患者中P53蛋白的表達(dá)較常人有明顯的升高,P53的上調(diào)可能會(huì)促進(jìn)KOA發(fā)病過程中軟骨細(xì)胞的凋亡。Bateman JF等[18]研究確認(rèn)了在鼠類骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中起關(guān)鍵作用的基因包括 Ptgs2、Crlf1、Inhba、Phdla2、Il11、Col10a1、P53、Foxo4和Xbp1等。Narici M等[19]研究表明全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后患者出現(xiàn)的肌肉減少癥與P53蛋白的表達(dá)密切相關(guān),該基因的有效性可以作為肌肉萎縮的生物標(biāo)記物。P53 mRNA可能與KOA的發(fā)病存在某種聯(lián)系,其可能是通過調(diào)控某種炎癥介質(zhì)作用于某條信號(hào)通路來起到抑炎止痛作用,因此本次實(shí)驗(yàn)研究選取其作為研究指標(biāo),觀察溫針灸是否能對(duì)其表達(dá)起到調(diào)控作用,結(jié)果顯示P53 mRNA在模型組、藥物組和溫針灸組中高表達(dá)提示其可能是 KOA大鼠的其中一個(gè)致病基因,與模型組相比,溫針灸能夠明顯降低 KOA大鼠滑膜組織P53 mRNA的表達(dá)水平。Map2k3屬于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的特異性蛋白激酶,有研究表明Map2k3 mRNA可能通過作用于p38MAPK信號(hào)通路來起到調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎的作用,本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示各組間比較 Map2k3差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能說明Map2k3 mRNA對(duì)骨關(guān)節(jié)炎調(diào)控作用微乎其微。

溫針灸治療大鼠 KOA療效明確,可以減輕滑膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn),減輕滑膜增生水腫,降低 PGE2的含量,抑制P53 mRNA表達(dá)來抑制炎性反應(yīng),這可能是溫針灸防治骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制之一。