洛神花總黃酮提取工藝及其穩(wěn)定性研究

黃 瓊，謝向機(jī)，林嘉麗，陳 楠

（1.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350003；2.三明市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，福建 三明 365000）

洛神花又名玫瑰茄、山茄、洛神葵等[1]，是錦葵科木槿屬的一年生草本植物[2]。洛神花花萼含有豐富的有機(jī)酸、碳水化合物、粗蛋白、粗脂肪和總黃酮等物質(zhì)[3]，其中總黃酮具有消炎、抑菌、抗氧化、抗腫瘤等生理作用[4]。目前，洛神花的栽培技術(shù)及化學(xué)成分研究報(bào)道較多[5-6]，但尚未見洛神花總黃酮提取及其穩(wěn)定性的研究報(bào)道。總黃酮提取方法有乙醇熱浸提[7]、微波提取[8]、超聲波提取[9]、超臨界萃取[10]、超聲波微波協(xié)同萃取[11]等，其中超聲波提取具有提取效率高、縮短提取時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用超聲波提取洛神花總黃酮，響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件，同時(shí)考察光照、溫度、pH、常見金屬離子對(duì)洛神花總黃酮穩(wěn)定性的影響，以期為洛神花總黃酮的進(jìn)一步純化和活性研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

洛神花為市售；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；無(wú)水乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、KCl、NaCl 等化學(xué)試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

ME204 梅特勒電子天平，UV-1800-DS2 型紫外可見分光光度計(jì)，F(xiàn)Z102 微型植物粉碎機(jī)，LGR10-4.2型高速冷凍離心機(jī)，KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

洛神花花萼→清洗→55 ℃烘干→粉碎→過(guò)篩→超聲波輔助提取→離心→取上清液→定容→樣品提取液

1.2.2 洛神花總黃酮含量的測(cè)定

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 方法[12]，測(cè)定波長(zhǎng)510 nm，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：C=0.1025A-0.000 51，R2=0.999 9，式中：C為蘆丁質(zhì)量濃度，mg/mL；A為吸光度。表明蘆丁質(zhì)量濃度在0～5.0 mg/mL 范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出洛神花總黃酮含量。

洛神花總黃酮含量（mg/g）=提取液中總黃酮質(zhì)量（mg）/樣品質(zhì)量（g）

1.2.3 洛神花總黃酮得率的計(jì)算

準(zhǔn)確移取1.0 mL 樣品提取液置于50 mL 容量瓶并用70%乙醇定容，搖勻，即得稀釋50 倍的樣品溶液。量取1.0 mL 稀釋液置于25 mL 容量瓶中，按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟，測(cè)定樣品吸光度，得樣品總黃酮質(zhì)量濃度，并按下列公式計(jì)算洛神花總黃酮得率。

式中：C為樣品提取液總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V為樣品提取液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品干粉質(zhì)量，mg。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 乙醇濃度對(duì)洛神花總黃酮得率的影響

設(shè)置提取溫度40 ℃，液固比20∶1（mL/g），提取時(shí)間20 min，超聲波功率200 W，乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%，考察乙醇濃度對(duì)洛神花總黃酮得率的影響。

1.2.4.2 液固比對(duì)洛神花總黃酮得率的影響

設(shè)置乙醇濃度60%，提取溫度40 ℃，提取時(shí)間20 min，超聲波功率200 W，液固比分別為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g），考察液固比對(duì)洛神花總黃酮得率的影響。

1.2.4.3 提取溫度對(duì)洛神花總黃酮得率的影響

設(shè)置乙醇濃度60%，液固比50∶1（mL/g），提取時(shí)間20 min，超聲波功率200 W，提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃，考察提取溫度對(duì)洛神花總黃酮得率的影響。

1.2.4.4 提取時(shí)間對(duì)洛神花總黃酮得率的影響

設(shè)置乙醇濃度60%，液固比50∶1（mL/g），提取溫度60 ℃，超聲波功率200 W，提取時(shí)間分別為20、30、40、50、60 min，考察提取時(shí)間對(duì)洛神花總黃酮得率的影響。

1.2.4.5 超聲波功率對(duì)洛神花總黃酮得率的影響

設(shè)置乙醇濃度60%，液固比50∶1（mL/g），提取溫度60 ℃，提取時(shí)間50 min，超聲波功率分別為200、250、300、350、400 W，考察超聲波功率對(duì)洛神花總黃酮得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Box-Behnken 模型，對(duì)影響洛神花總黃酮得率的3 個(gè)關(guān)鍵因素（液固比、提取溫度、提取時(shí)間）進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平詳見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.6 洛神花總黃酮穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.2.6.1 溫度對(duì)洛神花總黃酮穩(wěn)定性的影響

取7 份洛神花總黃酮提取液10.0 mL，分別置于30、40、50、60、70、80、90 ℃水浴60 min，取出后冷卻至室溫，測(cè)定洛神花總黃酮含量。

1.2.6.2 光照對(duì)洛神花總黃酮穩(wěn)定性的影響

取3 份洛神花總黃酮提取液50.0 mL，分別在室外自然光、室內(nèi)自然光和室內(nèi)避光保存0、1、2、3、4、5、6、7 d，測(cè)定洛神花總黃酮含量。

1.2.6.3 pH 對(duì)洛神花總黃酮穩(wěn)定性的影響

取10.0 mL 洛神花總黃酮提取液共12 份，調(diào)節(jié)其pH 分 別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，靜置60 min，測(cè)定洛神花總黃酮含量。

1.2.6.4 常見金屬離子對(duì)洛神花總黃酮穩(wěn)定性的影響

取洛神花總黃酮提取液10.0 mL 共9 份，分別加入濃度為0.1 mol/L 的KCl、NaCl、ZnSO4、CuSO4、CaSO4、Al2(SO4)3、FeSO4、NiSO4、MgCl2金屬離子溶液0.10 mL，靜置60 min，測(cè)定洛神花總黃酮含量，并作空白對(duì)照。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。單因素顯著性分析利用SPSS22.0 軟件，響應(yīng)面設(shè)計(jì)及優(yōu)化分析利用Design-Expert 8.0.5 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)洛神花總黃酮得率的影響

如圖1 所示，洛神花總黃酮得率隨著乙醇濃度的增大先升高后降低，乙醇濃度為60%時(shí)，總黃酮得率最大。原因可能是乙醇濃度越高，越有利于總黃酮溶出，但乙醇濃度過(guò)高，醇溶性雜質(zhì)溶出量增多，與總黃酮爭(zhēng)奪溶劑，降低總黃酮得率。因此，乙醇濃度選定為60%。

圖1 乙醇濃度對(duì)洛神花總黃酮得率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentrations on total flavonoids yields of roselle

2.1.2 液固比對(duì)洛神花總黃酮得率的影響

如圖2 可見，洛神花總黃酮得率隨著液固比的增大先升高后降低，液固比為50∶1（mL/g）時(shí)，總黃酮得率最大。原因可能是液固比越大，傳質(zhì)推動(dòng)力越強(qiáng)，總黃酮提取越徹底，但液固比過(guò)高會(huì)削弱超聲波的輔助作用，影響總黃酮的溶出，降低總黃酮得率。因此，選定液固比為50∶1（mL/g）。

圖2 液固比對(duì)洛神花總黃酮得率的影響Fig.2 Effects of liquid-material ratios on total flavonoids yields of roselle

2.1.3 提取溫度對(duì)洛神花總黃酮得率的影響

如圖3 所示，洛神花總黃酮得率隨著提取溫度的升高先增加后減少，提取溫度為60 ℃時(shí)，總黃酮得率最大。原因可能是總黃酮在高溫下易被破壞，同時(shí)增大雜質(zhì)的溶出，對(duì)后續(xù)的操作造成一定的影響。因此，選定提取溫度為60 ℃。

圖3 提取溫度對(duì)洛神花總黃酮得率的影響Fig.3 Effects of extraction temperatures on total flavonoids yields of roselle

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)洛神花總黃酮得率的影響

如圖4 可示，洛神花總黃酮得率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后減少，提取時(shí)間為50 min 時(shí)，總黃酮得率最大。原因可能是提取時(shí)間短，總黃酮還未完全溶出，但提取時(shí)間太長(zhǎng)，導(dǎo)致總黃酮被分解，降低總黃酮得率。因此，選定提取時(shí)間為50 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)洛神花總黃酮得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on total flavonoids yields of roselle

2.1.5 超聲波功率對(duì)洛神花總黃酮得率的影響

如圖5 所示，洛神花總黃酮得率隨著超聲波功率的增大先增加后減少，超聲波功率為350 W 時(shí)，總黃酮得率最大。原因可能是超聲功率的增大有利于細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)的釋放，但一些能分解總黃酮的酶也被充分釋放出來(lái)，導(dǎo)致總黃酮分解，降低總黃酮得率。因此，選定超聲波功率為350 W。

圖5 超聲波功率對(duì)洛神花總黃酮得率的影響Fig.5 Effects of ultrasound powers on total flavonoids yields of roselle

2.2 洛神花總黃酮提取響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，液固比、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)洛神花總黃酮得率影響顯著，乙醇濃度和超聲波功率對(duì)得率的影響不顯著。因此，選取對(duì)得率影響顯著的液固比、提取溫度、提取時(shí)間3 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。采用Box-Behnken 模型優(yōu)化設(shè)計(jì)提取工藝條件，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2，回歸方程方差分析見表3。

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation

根據(jù)表2 結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程式為：

由R2值可知該模型與實(shí)際試驗(yàn)誤差較小。由表3 可見，模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明此模型可以預(yù)測(cè)總黃酮最優(yōu)提取工藝條件。A、B、AB、BC、A2、B2、C2對(duì)總黃酮得率影響極顯著（P＜0.01），C、AC對(duì)總黃酮得率的影響不顯著。3 個(gè)條件對(duì)洛神花總黃酮得率影響大小順序?yàn)椋篈液固比＞B提取溫度＞C提取時(shí)間。

2.2.2 各因素間的交互作用對(duì)洛神花總黃酮得率的影響

等高線變化越密集，該因素對(duì)響應(yīng)值影響越大，根據(jù)圖6～8 等高線疏密程度，得3 因素對(duì)洛神花總黃酮得率影響大小順序?yàn)椋篈液固比＞B提取溫度＞C提取時(shí)間，再次驗(yàn)證了表3 的分析結(jié)果。響應(yīng)面曲線越陡，說(shuō)明兩者交互作用對(duì)響應(yīng)值影響越顯著，響應(yīng)曲面越平滑，說(shuō)明兩者交互作用對(duì)響應(yīng)值影響越不顯著。根據(jù)圖6～8，得液固比和提取溫度及提取溫度和提取時(shí)間的交互作用對(duì)洛神花總黃酮得率影響顯著，而液固比和提取時(shí)間交互作用對(duì)洛神花總黃酮得率影響不顯著，再次驗(yàn)證了表3 的分析結(jié)果。

圖6 液固比和提取溫度的交互作用對(duì)洛神花總黃酮得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Contour plot and response surface showing the interactive effects of liquid-material ratios and extraction temperatures on total flavonoids yields of roselle

圖7 液固比和提取時(shí)間的交互作用對(duì)洛神花總黃酮得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Contour plot and response surface showing the interactive effects of liquid-material ratios and extraction time on total flavonoids yields of roselle

圖8 提取溫度和提取時(shí)間的交互作用對(duì)洛神花總黃酮得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.8 Contour plot and response surface showing the interactive effects of extraction temperatures and extraction time on total flavonoids yields of roselle

2.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷尿?yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面模型得到優(yōu)化提取工藝條件為：液固比48.53∶1（mL/g），提取溫度59.19 ℃，提取時(shí)間50.21 min，洛神花總黃酮得率理論值為3.71%?？紤]到操作簡(jiǎn)便、實(shí)用，最終確定最優(yōu)工藝條件為：液固比50∶1（mL/g），提取溫度60 ℃，提取時(shí)間50 min。在此條件下總黃酮得率為3.69%，與理論值（3.71%）相對(duì)誤差為0.54%。

2.3 洛神花總黃酮穩(wěn)定性研究

2.3.1 溫度對(duì)洛神花總黃酮穩(wěn)定性的影響

如圖9 所示，溫度在30～60 ℃時(shí)，洛神花總黃酮含量隨著溫度的升高變化不大，說(shuō)明洛神花總黃酮在30～60 ℃時(shí)穩(wěn)定性好。但溫度升高到60 ℃以上，其含量隨溫度升高而降低，原因是溫度升高加快分子間運(yùn)動(dòng)，總黃酮氧化分解。因此，洛神花總黃酮生產(chǎn)和保存應(yīng)在30～60 ℃環(huán)境中。

圖9 不同溫度下洛神花總黃酮含量的變化Fig.9 Effects of temperatures on stability of total roselle flavonoids

2.3.2 光照對(duì)洛神花總黃酮穩(wěn)定性的影響

如圖10 所示，室外自然光下保存時(shí)，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，洛神花總黃酮含量降低，原因是洛神花總黃酮對(duì)紫外線敏感，室外自然光照射會(huì)破壞總黃酮結(jié)構(gòu)；而室內(nèi)自然光對(duì)洛神花總黃酮穩(wěn)定性影響較小，避光保存不影響其穩(wěn)定性。因此，室外自然光會(huì)影響洛神花總黃酮穩(wěn)定性，故長(zhǎng)期保存應(yīng)避光，短期保存可在室內(nèi)自然光下。

2.3.3 pH 對(duì)洛神花總黃酮穩(wěn)定性的影響

如圖11 所示，pH 為1.0～3.0 及6.0～12.0 時(shí)，洛神花總黃酮含量降低，pH 為3.0～6.0 時(shí)，其含量基本穩(wěn)定。原因是總黃酮苯環(huán)結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，顯弱酸性，所以總黃酮在弱酸性的環(huán)境中比較穩(wěn)定。因此，洛神花總黃酮在強(qiáng)酸強(qiáng)堿的環(huán)境中易受到破壞，適宜在弱酸性條件下保存使用。

圖11 不同pH 下洛神花總黃酮含量的變化Fig.11 Effects of pH on stability of total roselle flavonoids

2.3.4 常見金屬離子對(duì)洛神花總黃酮穩(wěn)定性的影響

如圖12 所示，同空白組相比較，K+、Na+、Zn2+、Ca2+、Ni2+、Mg2+組洛神花總黃酮含量基本沒有改變，說(shuō)明K+、Na+、Zn2+、Ca2+、Ni2+、Mg2+對(duì)其穩(wěn)定性基本沒有影響；但Al3+、Cu2+、Fe2+組洛神花總黃酮含量降低，且三者的影響大小表現(xiàn)為：Fe2+＞Al3+＞Cu2+，原因是Al3+與總黃酮中的酚羥基形成絡(luò)合物，F(xiàn)e2+、Cu2+與提取液的鄰二酚羥基反應(yīng)生成不溶性絡(luò)合物。因此，洛神花總黃酮儲(chǔ)存和食品加工中應(yīng)避開Al3+、Cu2+、Fe2+金屬離子。

圖12 不同金屬離子條件下洛神花總黃酮含量的變化Fig.12 Effects of metal ions on stability of total roselle flavonoids

3 結(jié)論

（1）采用Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法研究超聲波提取洛神花總黃酮最佳工藝條件的結(jié)果表明，影響洛神花總黃酮得率因素大小順序?yàn)椋阂汗瘫龋咎崛囟龋咎崛r(shí)間，最佳工藝條件為：乙醇濃度60%，液固比50∶1（mL/g），提取溫度60 ℃，提取時(shí)間50 min，超聲波功率350 W，在此條件下，洛神花總黃酮得率為3.69%，與理論值（3.71%）相對(duì)誤差為0.54%。

（2）洛神花總黃酮穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，洛神花總黃酮在30～60 ℃下比較穩(wěn)定，在pH 3.0～6.0 下最穩(wěn)定，室外強(qiáng)光和金屬離子Cu2+、Fe2+、Al3+對(duì)其穩(wěn)定性影響較大。因此，應(yīng)在弱酸性條件下保存與使用；洛神花總黃酮儲(chǔ)存和加工中應(yīng)避光，避高溫，避免接觸強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及Al3+、Cu2+、Fe2+金屬離子。