花生胚小葉再生體系的建立

馬倩 馬瑩瑩 高古腔 朱樹良 屈成鑫 鞏方平 任銳 李忠峰 馬興立 張幸果 殷冬梅

摘要：本研究選用不同花生品種遠(yuǎn)雜9102、豐花2號和花814的胚小葉為外植體，通過分析不同激素配比、不同基因型誘導(dǎo)不定芽的差異，確定了適宜花生胚小葉不定芽誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基，經(jīng)伸長和生根培養(yǎng)，最終建立了花生胚小葉的離體再生體系。結(jié)果表明，6-BA和NAA組合誘導(dǎo)效果優(yōu)于TDZ，最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為M519+4.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，豐花2號、遠(yuǎn)雜9102、花814均有較高的不定芽誘導(dǎo)率;最佳繼代培養(yǎng)基為M519+4.0mg/L6-BA，3個基因型品種的芽再生率較高，均超過64%;在1/2MS+0.2mg/LIBA+0.1mg/LNAA的生根培養(yǎng)基中，豐花2號、遠(yuǎn)雜9102、花814的生根率依次為73.80%、60.32%、50.66%。本研究初步建立了不依賴于基因型的較廣適花生胚小葉再生體系。

關(guān)鍵詞：花生;胚小葉;不定芽誘導(dǎo);離體再生體系

中圖分類號：S565.201 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2021）12-0017-08

花生（ArachishypogaeaL.）又名落花生，雙子葉植物，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，是重要的油料和經(jīng)濟作物之一，具有適應(yīng)性廣、經(jīng)濟效益高等優(yōu)點。我國是全球花生貿(mào)易四大出口國之一，花生在我國占有極其重要的地位[1]。目前，我國花生種植面積為油料作物的第二位，總產(chǎn)量居首位[2]?；ㄉ漠a(chǎn)量和品質(zhì)往往受到多種病蟲害的影響，選育抗病蟲新品種、改良品質(zhì)對花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。近年來分子生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，利用該技術(shù)改良花生品質(zhì)、提高抗病蟲能力的新型育種方式受到了廣大育種工作者的青睞。分子育種技術(shù)往往同組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化過程緊密聯(lián)系，花生離體再生及遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)發(fā)展相對緩慢，在一定程度上限制了其分子育種技術(shù)的發(fā)展，建立高效、穩(wěn)定、廣適的再生體系是促進(jìn)花生分子育種研究的關(guān)鍵。

目前，關(guān)于花生組織培養(yǎng)的報道日益增多，其中以花生胚小葉為外植體的再生體系已有較多報道。何曄[3]、尤淑麗[4]等研究了不同花生品種的愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率。張月婷等[5]建立了高效的花生再生體系，認(rèn)為豐花2號有較強的再生能力。隋炯明等[6]比較了不同基因型的胚小葉不定芽誘導(dǎo)率，認(rèn)為龍生型>珍珠豆型>多粒型。任艷等[7]比較了不同濃度NAA和TDZ對胚小葉的誘導(dǎo)情況。但仍然存在較多問題，如再生體系重復(fù)性差，再生過程基因型依賴性強等。因此，建立一個不依賴基因型的廣適性再生體系勢在必行。本研究選用不同花生品種的胚小葉為外植體，通過對不同激素配比的篩選試驗，確定了適宜花生胚小葉不定芽誘導(dǎo)、伸長和生根的最佳培養(yǎng)基，初步建立了適于不同基因型花生的離體再生體系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用花生品種為遠(yuǎn)雜9102（珍珠豆型）、花814（普通型）、豐花2號（珍珠豆型），以其自然風(fēng)干的種子為試材。

1.2 試驗方法

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 基礎(chǔ)培養(yǎng)基為M519和1/2MS，添加3%蔗糖和0.8%瓊脂，用NaOH調(diào)pH值至5.7～5.8。所有培養(yǎng)基均在121℃ 下高壓蒸汽滅菌15 min。培養(yǎng)條件：26/24℃，16h/8h光/暗循環(huán)，60%相對濕度。

1.2.2 種子預(yù)培養(yǎng) 分別取豐花2號、遠(yuǎn)雜9102、花814莢果，去殼后挑選飽滿健康的種子進(jìn)行消毒：將種子放入無菌罐頭瓶中，倒入75%乙醇消毒40s，棄乙醇，用無菌水沖洗幾次;加入0.1%氯化汞溶液浸泡10min，棄氯化汞溶液，用無菌蒸餾水清洗4～5次，最后加入無菌蒸餾水浸泡過夜。

1.2.3 外植體制備及不定芽誘導(dǎo) 將浸泡好的種子在無菌條件下取出完整胚，并從基部切下胚小葉，將胚小葉在一次性培養(yǎng)皿上用手術(shù)刀充分分散成單一胚小葉，使之不粘連，然后接種于含有不同配比6-BA和NAA或不同濃度TDZ的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)40～50d后統(tǒng)計不定芽誘導(dǎo)率。

6-BA設(shè)置3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mg/L的濃度梯度，NAA設(shè)置0.2、0.5mg/L的濃度梯度，TDZ設(shè)置0.02、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mg/L的濃度梯度;6-BA和NAA配比的篩選以李拴柱[8]的4.5mg/L6-BA+1.4mg/LNAA為對照。每皿接種30個外植體，每種激素處理設(shè)置3次重復(fù)，每3皿為一個重復(fù)。

1.2.4 叢生芽誘導(dǎo)及再生成苗 誘導(dǎo)培養(yǎng)60d后，切下誘導(dǎo)出的不定芽，接種至繼代培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽，之后每30d繼代一次。繼代培養(yǎng)基設(shè)置3.0、4.0、5.0mg/L的6-BA濃度梯度。繼代時將仍有芽點的組織接種至相同的繼代培養(yǎng)基增殖，而將長度1cm左右的芽移至生根培養(yǎng)基1/2MS+0.2mg/LIBA+0.1mg/LNAA，使之伸長并生根。每處理繼代3～4次，每次均記錄叢生芽數(shù)及芽再生數(shù)，并進(jìn)行生根培養(yǎng)，統(tǒng)計生根率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用MicrosoftExcel對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與統(tǒng)計分析。根據(jù)下列公式計算各指標(biāo)值。

不定芽誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出不定芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100 ;

叢生芽誘導(dǎo)率（%）=產(chǎn)生叢生芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100 ;

芽再生率（%）=叢生芽上長度大于1cm的芽數(shù)/外植體數(shù)×100 ;

生根率（%）=生根芽數(shù)/再生芽數(shù)×100 。

2 結(jié)果與分析

2.1 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

2.1.1 不同品種的不定芽誘導(dǎo)差異 將遠(yuǎn)雜9102、豐花2號、花814的胚小葉置于含有4.5mg/L6-BA+1.4mg/LNAA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，豐花2號培養(yǎng)3周左右分化出嫩綠的具有生命力的不定芽，且產(chǎn)生的不定芽多，培養(yǎng)至30d時產(chǎn)生的水漬狀愈傷少，不定芽仍然具有旺盛的生命力;而遠(yuǎn)雜9102培養(yǎng)20d左右即分化出深綠色不定芽和松軟的水漬狀愈傷，培養(yǎng)至30d時水漬狀愈傷增多且有部分轉(zhuǎn)化成雪花狀，已經(jīng)分化的不定芽也逐步向水漬狀愈傷轉(zhuǎn)化;花814培養(yǎng)過程中誘導(dǎo)不定芽的同時往往伴隨大量松散的愈傷，影響后期不定芽的伸長（圖1）?？梢?，3個品種胚小葉在相同環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，均可誘導(dǎo)出不定芽，但不定芽形態(tài)存在差異，推測形態(tài)差異可能與內(nèi)源激素含量不同有關(guān)。

2.1.2 6-BA與NAA不同配比對不定芽誘導(dǎo)的影響 由表1可見，豐花2號和遠(yuǎn)雜9102的最適激素配比均為4.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，誘導(dǎo)率分別為75.60%和66.17%，其中，豐花2號顯著高于對照，而遠(yuǎn)雜9102與對照無顯著差異。NAA濃度為0.5mg/L時，無論6-BA濃度多少，遠(yuǎn)雜9102各組誘導(dǎo)率均與對照無顯著差異?；?14的最適激素配比為4.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA，誘導(dǎo)率為66.30%，4.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA的誘導(dǎo)率略低，但兩者間差異不顯著，均與對照組無顯著差異;NAA濃度為0.5mg/L時，各種配比的不定芽誘導(dǎo)率也均與對照差異不顯著。3個品種間比較，在最適6-BA和NAA配比下，豐花2號的不定芽誘導(dǎo)率明顯高于遠(yuǎn)雜9102和花814;而在對照組6-BA和NAA配比下，遠(yuǎn)雜9102和花814的不定芽誘導(dǎo)率要高于豐花2號。

以豐花2號為例，將其胚小葉接種至6-BA和NAA不同濃度配比的培養(yǎng)基上，一周后胚小葉逐步變綠，3周后葉柄基部或傷口處開始膨大并出現(xiàn)綠色芽點。隨著培養(yǎng)時間的延長，芽點逐步發(fā)育成不定芽，30d時不定芽清晰可見（圖2A）;但繼續(xù)培養(yǎng)，會出現(xiàn)水漬狀和白色蓬松狀愈傷，不定芽誘導(dǎo)率逐步降低，因此選擇每30d繼代一次。

2.1.3 不同濃度TDZ對不定芽誘導(dǎo)的影響 由表2可見，豐花2號在5.00mg/LTDZ處理時有最高不定芽誘導(dǎo)率，但與3.00、4.00mg/LTDZ處理差異不顯著。遠(yuǎn)雜9102在1.00mg/LTDZ處理時不定芽誘導(dǎo)率顯著高于0.02mg/LTDZ處理，繼續(xù)提高TDZ濃度可提高不定芽誘導(dǎo)率，但未達(dá)顯著水平?；?14在3.00mg/LTDZ處理時不定芽誘導(dǎo)率顯著高于CK，繼續(xù)提高TDZ濃度可提高不定芽誘導(dǎo)率，但差異不顯著。

以豐花2號為例，將其胚小葉接種至不同濃度TDZ誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，胚小葉前期迅速膨大變綠，培養(yǎng)20d左右時逐步在小葉背面基部出現(xiàn)芽點，培養(yǎng)30d時仍較?。▓D2B），整個培養(yǎng)過程中幾乎沒有出現(xiàn)水漬狀或雪花狀愈傷;但隨著TDZ濃度升高，產(chǎn)生的不定芽越來越難以分化出叢生芽，在伸長培養(yǎng)基上逐步轉(zhuǎn)化為水漬狀愈傷。

綜合來看，6-BA和NAA配合使用對3個花生品種不定芽的誘導(dǎo)效果優(yōu)于單獨使用TDZ;其中豐花2號更易被激素誘導(dǎo)，而遠(yuǎn)雜9102和花814誘導(dǎo)效果更為穩(wěn)定。

2.2 繼代培養(yǎng)基及繼代次數(shù)的篩選

3個品種在含不同濃度6-BA的繼代培養(yǎng)基上均可實現(xiàn)芽再生，但叢生芽誘導(dǎo)率和芽再生率存在差異。其中豐花2號、遠(yuǎn)雜9102均在添加4.0mg/L6-BA的培養(yǎng)基上有最高叢生芽誘導(dǎo)率（分別為56.69%、36.36%）和芽再生率（分別為267.54%、72.73%），花814在添加5.0mg/L6-BA 的培養(yǎng)基上有最高叢生芽誘導(dǎo)率（27.78%），但在該濃度下芽再生率小于添加4.0mg/L6-BA的繼代培養(yǎng)基（表3）。此外，無論是含3.0mg/L還是4.0mg/L6-BA的培養(yǎng)基，叢生芽誘導(dǎo)率基本一致，但芽再生率均為含4.0mg/L6-BA的培養(yǎng)基最佳。這表明3個品種對外源激素的敏感性不同，可能受自身內(nèi)源激素的影響。綜上所述，含4.0mg/L6-BA的繼代培養(yǎng)基對3個品種的芽再生效果更好，具有廣適性。

繼代過程中發(fā)現(xiàn)隨著繼代次數(shù)的增多，繼代誘導(dǎo)的叢生芽比例逐步增多。3個品種均存在這種現(xiàn)象。以豐花2號在含有4.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的不定芽的繼代情況為例（圖3和圖4），第一次繼代叢生芽誘導(dǎo)率僅為20.25%，平均芽再生數(shù)約為1.70個;第二次繼代后叢生芽誘導(dǎo)率大幅提升至90.11%，平均芽再生數(shù)約為2.41個;第三次繼代后，叢生芽誘導(dǎo)率達(dá)到最大值94.37%，平均芽再生數(shù)略有降低，約為1.86個;直至繼代4次后，叢生芽誘導(dǎo)率依然大于90%，而平均芽再生數(shù)增加至最大值4.11個。由此可見，繼代對不定芽再生有著重要影響，可通過適當(dāng)提高繼代次數(shù)來為更多具有潛在再生能力的不定芽提供充足養(yǎng)分，從而獲得更多再生植株。

2.3 不同品種生根培養(yǎng)差異

再生芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，兩個月后產(chǎn)生粗壯根系，繼續(xù)培養(yǎng)可在瓶中開花下針（圖5）。在添加0.2mg/LIBA+0.1mg/LNAA的生根培養(yǎng)基中，豐花2號、遠(yuǎn)雜9102、花814的生根率分別為73.80%、60.32%、50.66%（表4）。

2.4 花生胚小葉再生體系的建立

綜合上述試驗結(jié)果，建立了比較廣適的花生胚小葉再生體系：挑選飽滿健康的花生種子，消毒并浸泡過夜后在無菌條件下取出完整胚，從基部切下胚小葉，充分分散后作為外植體接種于M519+4.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，不定芽誘導(dǎo)過程約需30d;叢生芽誘導(dǎo)及芽再生過程需及時繼代，繼代培養(yǎng)基為M519+4.0mg/L6-BA，誘導(dǎo)培養(yǎng)60d時第一次繼代，后每30d繼代一次，以使更多的不定芽伸長、叢生芽生長更為旺盛，本試驗共繼代3～4次;生根過程需持續(xù)兩個月，生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2mg/LIBA +0.1mg/LNAA，第一個月時再生芽即可誘導(dǎo)出根，繼續(xù)培養(yǎng)根系逐漸粗壯，側(cè)根增多，植株生長發(fā)育更為健壯，部分植株甚至可在培養(yǎng)瓶中開花下針;將健壯植株移栽至花盆中，在32℃/25℃、16h/8h光/暗循環(huán)、60%相對濕度的室內(nèi)培養(yǎng)，最終收獲莢果（圖6）。整個再生周期約為8個月。

3 討論與結(jié)論

前人的研究表明基因型依賴性是限制花生離體培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的重要因素[9]。為解決這一問題，本試驗以花生胚小葉為外植體，對豐花2號、遠(yuǎn)雜9102、花814進(jìn)行再生培養(yǎng)，旨在通過改變激素比例，使之忽略基因型依賴性，從而建立較為廣適的再生體系，實現(xiàn)花生離體再生。

不同品種由于內(nèi)源激素含量不同，外植體離體再生所需的培養(yǎng)條件也不盡相同。本試驗用到的3個品種在相同的培養(yǎng)條件（M519+4.5mg/L6-BA+1.4mg/LNAA）下誘導(dǎo)的不定芽形態(tài)存在較大差異且生長速度也不同，這表明3個品種內(nèi)源激素含量存在差異，為建立廣適性的再生體系提供了前提。

前人研究已確定花生胚小葉誘導(dǎo)不定芽的激素及濃度范圍為6-BA3～6mg/L、NAA1mg/L左右[10-12]，不定芽分化則多使用3～5mg/L6-BA[13-15]。本試驗所設(shè)6-BA和NAA濃度均在此范圍內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6-BA濃度對不定芽誘導(dǎo)的影響較NAA更大，這印證了適宜的6-BA和NAA濃度配比對不定芽誘導(dǎo)和分化起著重要作用[16]。此外，我們還發(fā)現(xiàn)6-BA和NAA組合誘導(dǎo)效果優(yōu)于單獨使用TDZ，這表明多激素組合使用再生效果更好，側(cè)面反映花生的生長發(fā)育是多激素協(xié)調(diào)合作的結(jié)果[17]。

此外，繼代培養(yǎng)過程中我們發(fā)現(xiàn)多次繼代可使更多具有潛在再生能力的不定芽形成叢生芽，從而提高芽再生率，繼代4次后叢生芽誘導(dǎo)率仍大于90%，平均芽再生數(shù)為4.11個。這表明在不定芽誘導(dǎo)率較低的情況下，可以通過多次繼代獲得較多再生苗，這也為后期提高遺傳轉(zhuǎn)化效率提供了一定參考。

本研究建立了以胚小葉為外植體的較廣適的花生高效再生體系，適宜不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為M519+4.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，不定芽誘導(dǎo)率均大于50%，最佳繼代培養(yǎng)基為M519+4.0mg/L6-BA，芽再生率均大于64%，其中豐花2號高達(dá)267.54%，繼代4次的叢生芽誘導(dǎo)率仍高于90%;在1/2MS+0.2mg/LIBA+0.1mg/LNAA的生根培養(yǎng)基中，生根率均大于50%。這為下一步進(jìn)行花生遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定了基礎(chǔ)。