HPLC法測定消栓顆粒劑中黃芪甲苷的含量

王法宇 吳 迪 趙鳳明 袁家欣

1.北京醫(yī)藥集團(tuán)職工大學(xué),北京 100079;2.吉林省白城市食品藥品檢驗所，吉林 白城 137000；3.吉林敖東鹿業(yè)有限責(zé)任公司,吉林 長春 133700

消栓顆粒劑出自清朝名醫(yī)王清任的《醫(yī)林改錯》卷下癱痿論方[1]。該方特點為重用黃芪為君藥，其黃芪用量是其它活血藥總和的約3倍，方中重用的黃芪中含有多糖及黃芪甲苷[2-4],同時黃芪還具有抗炎、增強(qiáng)免疫[5-6]、抗氧化[7]、保護(hù)心臟[8]、調(diào)脂[9]、降血糖[10]等作用。黃芪甲苷作為黃芪的主要有效成分，在我國藥典中有含量測定并有相關(guān)含量限度規(guī)定[11]。本研究建立消栓顆粒劑中黃芪甲苷含量測定方法，進(jìn)一步細(xì)化藥品的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器 液相色譜儀(Agilent 1100) 檢測器為四元泵二極管陣列，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換器為Agilent35900E蒸發(fā)散射檢測器(SEDEX-55)，單元泵(DXNamax-SD-200) ，AgII空氣發(fā)生器電子天平(Mettler instrument Corp)，超聲波提取器(型號GT-350W型濟(jì)寧科特超聲電子有限公司)。

1.2 藥品 消栓顆粒( 自制的三批藥品分別為20190905 20190904 20190902)自制的黃芪陰性對照；黃芪甲苷對照品(中檢所110781201717)；乙腈(色譜純)；其它試劑(分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備 ①供試品溶液的制備：取本品7 g，精密稱定，加氨試液40 mL移至具塞三角瓶中搖勻，密閉，過夜。取此提取液以40 mL水飽和正丁醇萃取，共萃取3次后合并正丁醇萃取液，將其水浴蒸干，殘渣以甲醇溶解后移至5 mL容量瓶中，并稀釋到刻度，然后取上清液，用濾膜過濾(0.45 μL)，即得；②對照品溶液配制：稱取黃芪甲苷對照品0.5 mg加甲醇配制成每毫升含0.5 mg的溶液；③陰性對照：按上述工藝配制缺黃芪的陰性對照品溶液。精密吸取上述①②③各10 μL測定。結(jié)果①和②在相同時間內(nèi)出現(xiàn)相對應(yīng)的色譜峰，而③則未出現(xiàn)。相關(guān)圖譜如圖1所示。

2.2 色譜條件 Nanologica SVEA C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-水(35∶65)為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器。1.0 mL/min為流速，柱溫為25 ℃，理論塔板數(shù)不低于4000，以黃芪甲苷峰計算。進(jìn)樣量為10 μL。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 黃芪甲苷對照品溶液(濃度為0.47 mg/mL)精密吸取4～30 μL，進(jìn)行測定峰的面積，縱坐標(biāo)(Y)為峰面積log值，橫坐標(biāo)(X)為進(jìn)樣量log值，回歸處理，結(jié)果顯示黃芪甲苷在0.2742～1.1492 μg范圍內(nèi)，峰面積的積分值與進(jìn)樣量之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=1.4709X+2.7033，R=0.9994(n=6)。

2.4 精密度試驗 精密地吸取上述同一對照品溶液10 μL，在測試的條件和測試的地點相同的前提下，重復(fù)進(jìn)樣6次后測定黃芪甲苷的峰面積，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，取6次RSD的平均值以記錄。結(jié)果表明黃芪甲苷的平均峰面積為5527.88，RSD為1.45%，該方法精密度較好。

2.5 重復(fù)性試驗 同批次的樣品為供試品，按上文所述的方法配制供試品溶液，依上述方法重復(fù)進(jìn)行含量平行測定。黃芪甲苷重復(fù)性試驗結(jié)果的平均值為7919.53，RSD為1.63%。由以上可知，此方法的重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗 取本品供試品溶液，分別放置0～24 h，每次吸取10 μL測定。結(jié)果平均峰面積為7519.55，RSD為1.87%。結(jié)果顯示，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率 精密地稱取已知含量的同一樣品6份，其每份黃芪甲苷含量約1.25 mg。精密地加入對照品溶液(含黃芪甲苷為1.2404 mg)按以上樣品測定項下的方法提取，測定含量并計算回收率，平均回收率為99.16%，RSD為1.21%，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果

2.8 檢出限 取黃芪甲苷對照品配置成濃度為0.001 mg/mL、0.002 mg/mL、0.003 mg/mL、0.004 mg/mL、0.005 mg/mL、0.006 mg/mL、0.008 mg/mL、0.01 mg/mL的對照品溶液，分別注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣量為10 μL，計算不同進(jìn)樣量的信噪比，經(jīng)測定，濃度為0.005 mg/mL的黃芪甲苷進(jìn)樣量為10 μL時，其信噪比為3，因此確定黃芪甲苷的最低檢出限為0.05 μg。

2.9 樣品含量測定 取10批次的上述樣品，按供試品溶液的方法配制并測定其峰面積，再用外標(biāo)兩點法對數(shù)方程計算樣品中黃芪甲苷的含量，測定結(jié)果見表2?？紤]到每批藥材之間質(zhì)量差異和生產(chǎn)實際，最后將黃芪甲苷的含量定為不低于0.70 mg/g。

表2 消栓顆粒劑中的黃芪甲苷的含量

3 討論

黃芪為方中君藥，其主要成分黃芪甲苷的含量測定可以做為控制消栓顆粒劑質(zhì)量的指標(biāo)性成份。本試驗結(jié)果顯示，黃芪甲苷平均加樣回收率為 99.16%，RSD 為1.21%。樣品中黃芪甲苷出峰時間為15.6 min，且樣品峰與其他峰的分離度很好。陰性對照試驗表明，除黃芪外的其他原輔料不干擾樣品中黃芪甲苷的含量測定。表明本結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性良好，可用于對消栓顆粒劑的質(zhì)量控制，從而保證臨床應(yīng)用中制劑的療效和安全。