基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討桔梗-甘草防治COVID-19的機制

馬英華，張古英，趙宜樂，韓 雨，姜錫娟，解偉偉，安 娜，安志華，秦亞彬 (.河北省兒童醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊 05003；.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊 050000)

在抗擊新型冠狀病毒肺炎(Coronavirus disease 2019，COVID-19)時[1]，中醫(yī)藥與西藥相輔相成，做出了巨大貢獻[2-3]。桔梗為桔?？浦参锝酃Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.]的干燥根[4]。甘草為豆科植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)、脹果甘草(GlycyrrhizainflataBat.)或光果甘草(GlycyrrhizaglabraL.)的干燥根和根莖[5]。桔梗和甘草配伍，最早來源于中醫(yī)經(jīng)典《傷寒論》中的桔梗湯，主要用于治療肺熱咽痛、肺熱咳嗽、肺癰等證[6]。桔梗-甘草藥對經(jīng)加味可以演化為清金化痰湯、托里消毒散、清肺湯等經(jīng)典名方[7-8]。同時，桔梗和甘草是在COVID-19的治療中高頻次出現(xiàn)的中藥[9]。但桔梗-甘草藥對干預(yù)COVID-19的作用機制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從系統(tǒng)整體角度出發(fā)，對生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)信號進行多成分-多靶點的系統(tǒng)研究，廣泛應(yīng)用于中藥研究中，而分子對接更能從藥物分子設(shè)計的角度佐證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究結(jié)果[10-11]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，探討并驗證桔梗-甘草藥對干預(yù)COVID-19的作用機制，以期為治療COVID-19提供理論支持。

1 資料與方法

1.1活性成分和靶點篩選 利用TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫，檢索關(guān)鍵詞“桔?！焙汀案什荨?，以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug likeness，DL)≥0.18為篩選條件，篩選出藥效活性成分。同時預(yù)測成分潛在作用靶點，利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Uniprot(https://www.uniprot.org/)和perl腳本程序?qū)Π悬c基因的名稱進行轉(zhuǎn)換，校正為官方的縮寫名稱。

1.2疾病靶點篩選 利用基因數(shù)據(jù)庫Gene Cards(https://www.genecards.org)、OMIM(https://www.omim.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)，對關(guān)鍵詞“COVID-19”和“novel coronavirus”進行檢索，限定選擇相關(guān)度≥1的靶點，收集疾病靶點。

1.3藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 安裝R語言軟件R×64 4.0.2，在R語言上安裝Venny 2.1.0，將藥物與疾病靶點取交集繪制韋恩圖，得到交集靶點文檔，并運用Cytoscape 3.7.2軟件繪制相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用STRING(https://string-db.org/)網(wǎng)站，將1.3項下得到的交集靶點導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫，物種限定為“Homo sapiens”，設(shè)置最低相互作用閾值“medium confidence”為0.7，隱藏離散點，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果以tsv的格式導(dǎo)出，備用。將這些數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件進行可視化，運用CytoNCA插件對交集基因進行打分篩選，得到核心基因。

1.5通路富集分析 使用perl腳本，將交集靶點的symbol 轉(zhuǎn)換為基因ID，再次使用R語言軟件，安裝Bioconductor數(shù)據(jù)庫安裝包，對交集靶點進行GO(gene ontology)分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析，最終得到GO分析的柱形圖、KEGG通路分析的氣泡圖和通路途徑圖。

1.6活性分子與靶點蛋白對接 從PubChem(https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中下載活性成分(Degree≥11)的二維化學(xué)結(jié)構(gòu)，利用Chem Office 3D 18.1.0軟件轉(zhuǎn)換為三維結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)碼為mol2格式文件，備用。從RCSB PDB(http://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫下載Mpro(PDB ID：6LU7)和ACE2(PDB ID：1R42)的3D結(jié)構(gòu)，應(yīng)用PyMOL軟件進行去水分子和去有機物操作，備用。將上述活性化合物和蛋白結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.6軟件進行優(yōu)化操作，設(shè)置蛋白活性口袋，定義盒子大小為(40×40×40)個網(wǎng)格點，每個網(wǎng)格點的距離(spacing)為1.0 nm，最后利用AutoDock Vina軟件進行分子對接。

2 結(jié)果

2.1活性成分和靶點篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中查詢桔梗和甘草的成分，共收集到367種化學(xué)成分(桔梗102種，甘草265種)，設(shè)置參數(shù)(OB≥30%，DL≥0.18)進行篩選，結(jié)果共篩選得到99種成分(桔梗7種，甘草92種)。同時，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選桔梗和甘草成分所對應(yīng)的靶點基因，共獲得2 766個靶點。

2.2疾病靶點篩選 在數(shù)據(jù)庫Gene Cards、OMIM、TTD、PharmGkb和DrugBank中，以“COVID-19”和“novel coronavirus”為搜索詞，得到與COVID-19相關(guān)的靶點，設(shè)置相關(guān)度≥1，去重取并集，共獲得674個靶點。在R語言軟件中運行腳本進行韋恩圖繪制，對交集結(jié)果進行可視化，見圖1A，其中GeneCard 482個、OMIM 3個、TTD 100個、PharmGkb 9個、DrugBank 119個。

2.3活性成分-關(guān)鍵靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 利用R語言軟件，繪制成分-靶點的韋恩圖，得到交集基因67個，見圖1B，并應(yīng)用Cytoscape 3.7.2軟件進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和可視化，見圖2。圓形表示靶點，長方形表示甘草有效成分，倒三角形表示桔梗有效成分，連線表示二者之間的相互作用關(guān)系。如圖2所示，共有150個節(jié)點(83種成分和67個交集基因)和672條連線，此結(jié)果體現(xiàn)了中藥多成分多靶點共同作用的意義。根據(jù)拓撲學(xué)分析，該網(wǎng)絡(luò)中所有靶點按度值(Degree)打分排序，靶點節(jié)點大小用“Degree”表示，得到靶點的得分排序。度值越大表示靶點被越多的有效成分所靶向，說明靶向靶點對蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵作用。而大于平均度值的交集基因有10個，分別為PTGS2(78)、ESR1(71)、NOS2(62)、PPARG(58)、GSK3B(53)、CDK2(53)、CCNA2(50)、MAPK14(43)、PTGS1(41)和DPP4(35)。

圖1 來自5個數(shù)據(jù)庫的靶點韋恩圖注：A.COVID-19疾病靶點韋恩圖；B.桔梗-甘草藥對與COVID-19交集靶點韋恩圖。Fig.1 Target Venn diagrams from 5 databasesNotes：A.Venn diagram of COVID-19 disease targets；B.Venn diagram of intersection targets in Platycodonis Radix-Licorice drug pair and COVID-19 disease.

圖2 藥物-成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Drug-component-target interaction network

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及查找核心基因 將67個交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置物種為人類，剔除離散靶點，篩選得分大于0.7的靶點，最終得到PPI網(wǎng)絡(luò)的關(guān)系數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(圖3A)。運用CytoNCA插件對交集基因進行打分，篩選依據(jù)為中介中心性(betweenness centrality，BC)、緊密中心性(closeness centrality，CC)、程度中心性(degree centrality，DC)、特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)、本地平均水平連接性(local average connectivity，LAC)和網(wǎng)絡(luò)中心性(network centrality，NC)，若6項的評分均大于中位數(shù)，則將該基因保留，否則將其剔除(圖3B)。最后經(jīng)過2輪篩選，得到核心基因(圖3C)。最終核心基因包括RELA、STAT1、MAPK3、TP53、MAPK1、MAPK8、STAT3、MAPK14、IL1B和TNF(詳細節(jié)點參數(shù)見表1)。結(jié)果表明，桔梗-甘草藥對可能通過以上核心基因干預(yù)COVID-19的進展。同時，將2.3項下的主要作用靶標與PPI網(wǎng)絡(luò)的核心基因取交集，得到MAPK14基因，可以推測MAPK14基因不僅對藥材和疾病作用的影響大，而且在PPI網(wǎng)絡(luò)中居于重要地位，推斷這個靶點可能是桔梗-甘草藥對拮抗新型冠狀病毒的重要靶標。

圖3 使用Cytoscape軟件構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)圖注：A.使用CytoNCA插件第一次過濾篩選出的各評分均高于中位數(shù)的倒三角節(jié)點；B.通過CytoNCA插件第二次過濾構(gòu)建的子網(wǎng)絡(luò)；C.最后使用CytoNCA插件2次篩選得到的核心基因。Fig.3 Establishing PPI network by using CytoscapeNotes:A.CytoNCA plug-in was used to filter out the yellow nodes whose scores were higher than the median for the first time；B.subnetwork constructed by a second filtration via CytoNCA；C.final core genes screened after two filtrations by using CytoNCA.

表1 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)核心靶點蛋白拓撲參數(shù)Tab.1 Topological parameters of core target proteins in PPI network

2.5GO富集分析和KEGG通路分析 經(jīng)分析，共獲得2 120個生物過程(biological process，BP)、38種細胞組分(cellular component，CC)和136個分子功能(molecular function，MF)，篩選各組分前10個富集最顯著的GO分析(圖4)，其中BP主要與抗氧化反應(yīng)、細胞對化學(xué)壓力的反應(yīng)、凋亡信號通路的調(diào)控、對脂多糖的反應(yīng)和對細菌起源分子的反應(yīng)等相關(guān)，CC 主要集中在細胞膜活性上，而MF主要與細胞因子活性和受體結(jié)合相關(guān)。以上結(jié)果提示桔梗-甘草藥對的靶點主要與細菌和病毒感染等密切相關(guān)。通過KEGG通路分析，共獲得166條信號通路，選取前30條富集最顯著的通路繪制氣泡圖，見圖5，其中x軸表示富集因子(rich factor)，即背景基因集中在這個通路的所有基因的數(shù)量，y軸表示通路名稱，氣泡顏色表示P值大小，氣泡大小表示基因數(shù)量。如圖5所示，富集通路涉及Coronavirus disease-COVID-19通路，涉及的其他通路大致可分為免疫反應(yīng)相關(guān)通路、炎癥相關(guān)通路、抑制病毒感染通路和抑制癌癥的相關(guān)通路。以上結(jié)果提示桔梗-甘草藥對可能通過干預(yù)這些信號通路來抑制COVID-19的進展。

圖4 桔梗-甘草藥對干預(yù)COVID-19的GO富集分析結(jié)果Fig.4 GO enrichment analysis of Platycodonis Radix-Licorice drug pair for intervention against COVID-19

圖5 桔梗-甘草藥對干預(yù)COVID-19的KEGG富集分析結(jié)果Fig.5 KEGG enrichment analysis of Platycodonis Radix-Licorice drug pair for intervention against COVID-19

2.6核心活性成分與ACE2和Mpro的分子對接 分子對接技術(shù)通過計算機輔助藥物設(shè)計對主要活性成分與疾病關(guān)鍵靶點蛋白進行模擬研究，從而簡單驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果，其結(jié)合自由能越小，則配體與受體的親和力越大，從而側(cè)面佐證活性成分與關(guān)鍵靶點存在相互作用。一般結(jié)合自由能小于-5.0 kcal·mol-1則認為模擬成功，小于-7.0 kcal·mol-1則認為兩者有較好的結(jié)合能力。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中得到的前11種活性成分(Degree≥11)分別與ACE2和Mpro進行對接，計算結(jié)合自由能，采用最小的結(jié)合構(gòu)象，結(jié)果見表2。同時，自由能最小的前4種活性化合物(鱗葉甘草素A、槲皮素、甘草查爾酮A和木犀草素)的分子對接圖見圖6。

表2 核心活性成分與SARS-CoV-2的結(jié)合位點Mpro和ACE2分子對接效能Tab.2 Molecule docking efficiency of core active components with Mpro and ACE2 at the binding sites of SARS-CoV-2

圖6 活性成分與ACE2和Mpro的分子對接模式Fig.6 Molecular docking diagram of active ingredients with ACE2 and Mpro

3 討論

目前對于COVID-19缺乏特效治療藥物，根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第8版)》(國衛(wèi)辦函)，治療以抗病毒、抗感染、免疫治療和對癥治療為主。在中醫(yī)理論背景下[12]，COVID-19屬于中醫(yī)疫病范疇[13]，其病因主要是感受“疫戾”之氣，病理因素主要以濕為主，伴隨毒和瘀，入肺化熱，所以初期治療以清熱解毒化濕為主[14]。從古至今，中醫(yī)藥在各種瘟疫病的治療中都發(fā)揮著重要作用[15]。經(jīng)典藥對桔梗和甘草合用，對COVID-19有一定的防控作用。但是，其對COVID-19的治療作用尚缺乏直接證據(jù)。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接技術(shù)系統(tǒng)分析了經(jīng)典藥對桔梗-甘草干預(yù)COVID-19的潛在作用機制。從現(xiàn)存的中藥數(shù)據(jù)庫中獲得靶標信息，篩選出99種活性成分，并與COVID-19疾病靶標取交集，獲得67個交集靶點，通過對關(guān)鍵交集靶點進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析和篩選，得到關(guān)鍵靶點MAPK14。MAPK14，即p38α，是p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)家族成員之一[16]。MAPK14作為MAPK家族中的重要成員之一，其表達與機體生理功能密切相關(guān)，表達異?？梢l(fā)機體免疫功能失調(diào)，導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，同時也與炎癥反應(yīng)息息相關(guān)。當(dāng)機體受到不同理化因素、炎性因子、脂多糖、紫外線照射等刺激后，可通過活化MAPK14蛋白來激活p38MAPK通路，從而啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)[17]。因此，推測桔梗-甘草藥對可能通過調(diào)控MAPK14蛋白的表達而起到抑制病毒的作用。通過對關(guān)鍵交集靶點進行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，其BP主要與抗氧化反應(yīng)、細胞對化學(xué)壓力的反應(yīng)、凋亡信號通路的調(diào)控、對脂多糖的反應(yīng)、對細菌起源分子的反應(yīng)密切相關(guān)，表明桔梗-甘草藥對可能具有抗病毒和抗感染的作用。而KEGG通路分析結(jié)果則顯示桔梗-甘草藥對干預(yù)COVID-19的通路大致可以分為免疫反應(yīng)相關(guān)通路、炎癥相關(guān)通路、抑制病毒感染通路和抑制癌癥的相關(guān)通路，該結(jié)果提示桔梗-甘草藥對可能通過多渠道、多通路抑制COVID-19的進展。

新型冠狀病毒于2020年2月11日被國際病毒分類委員會命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)。研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome-coronavirus，SARS-CoV)、中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(middle east respiratory syndrome-coronavirus，MER-SCoV)一樣，同屬于β屬的冠狀病毒[18-19]，2019-nCoV與SARS-CoV的基因序列同源性高達79%，與MER-SCoV序列的同源性也達到了40%左右，且三者都是通過刺突糖(spike glycoprotein，S)蛋白的表達與人體黏膜上皮細胞膜表面的ACE2的受體結(jié)合而入侵機體，繼而大量復(fù)制，導(dǎo)致肺炎[20-21]。而ACE2作為炎癥因子調(diào)節(jié)蛋白[22]，通過酪氨酸蛋白磷酸化，激活MAPK受體，誘導(dǎo)激活促炎因子，導(dǎo)致線粒體功能障礙，從而損害組織細胞[23]。因此，活性成分與Mpro和ACE2的靶點結(jié)合能有效抑制病毒的進一步入侵，從而減輕病毒感染的程度。目前，利用分子對接技術(shù)模擬、驗證活性成分與病毒靶點的結(jié)合，初步篩選出能與化學(xué)抗病毒藥物相匹敵的活性成分，為進一步的實驗驗證奠定了理論基礎(chǔ)，也為這些活性成分能夠成為抗病毒藥提供了理論依據(jù)，既減少實驗資源的盲目浪費，又為進一步的實驗研究奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，中藥經(jīng)典藥對桔梗-甘草干預(yù)COVID-19是通過多成分、多靶點、多通路的協(xié)同方式實現(xiàn)，為COVID-19的中醫(yī)防治提供了可行性理論參考。同時，通過分子對接分析藥對的核心成分，也為新藥的開發(fā)提供了新方向，縮短了用于篩選有效化合物的時間，提高了新藥開發(fā)的效率。但是本研究也存在一定的局限性，即預(yù)測的理論結(jié)果還需后期的實驗進行進一步驗證，才能為COVID-19的中醫(yī)防治提供更可靠的理論和數(shù)據(jù)支持。