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    HPLC法測定益腦心顆粒中10種成分及化學(xué)計量的研究

    2021-02-28 04:02:12黃美玲任曉東聶振興陳明會漢中市人民醫(yī)院藥劑科漢中7000漢中市鐵路中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科漢中7000西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部西安7006
    西北藥學(xué)雜志 2021年6期
    關(guān)鍵詞:兒茶腦心巴利

    王 鑫,黃美玲,張 松,任曉東,聶振興,陳明會*(.漢中市人民醫(yī)院藥劑科,漢中 7000;.漢中市鐵路中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,漢中 7000;.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,西安 7006)

    益腦心顆粒由川芎、制首烏、丹參、郁金、山楂、天麻6味中藥制成,具有平肝熄風(fēng)、活血散瘀的作用,用于治療血瘀肝旺所致的眩暈頭痛等[1-3]。方中川芎有治療心血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等作用[4-5];丹參中含丹酚酸B、原兒茶醛、丹參素等成分,有改善微循環(huán)、抗凝血等作用[6-7];何首烏含有二苯乙烯苷類、沒食子酸等成分,具有明顯的抗衰老和保護神經(jīng)等作用[8-11];天麻含有天麻素、巴利森苷類等成分,具有保護腦、抗暈眩、鎮(zhèn)靜催眠等作用[12-15];山楂有明顯的抗氧化作用[16-19];郁金有抗腫瘤、抗炎等作用[20-21]。

    由于中藥成分復(fù)雜,具有通過多靶點整體協(xié)同作用的特征,故單成分質(zhì)量控制模式難以全面、科學(xué)地評價其產(chǎn)品質(zhì)量。因此,近年來已廣泛將多指標成分質(zhì)量控制模式應(yīng)用于中藥的質(zhì)量控制中[22]。現(xiàn)行該制劑質(zhì)量標準僅對原兒茶醛進行定量控制,筆者前期曾對該制劑進行了定性研究[23],目前無對其所含多成分進行定量研究的文獻報道,為了更加全面地評價益腦心顆粒的整體質(zhì)量,本實驗采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法同時測定天麻素、丹參素鈉、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、原兒茶醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、二苯乙烯苷、丹酚酸B 10種成分的含量,建立益腦心顆粒多指標成分評價模式,并采用主成分分析(principal component analysis,PCA)、聚類分析(cluster analysis,CA)等化學(xué)計量學(xué)方法對定量結(jié)果進行分析,為提升益腦心顆粒的質(zhì)量提供依據(jù)。

    1 儀器與試藥

    1.1儀器 NexeraXR型島津高效液相色譜儀、SPD-M40A型二極管陣列檢測器、LC/Labsoluion色譜工作站均購自日本島津公司;KQ-100DE型臺式數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);AUW220D型十萬分之一電子分析天平(日本島津公司);Shim-pack Scepter C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)(日本島津公司)。

    1.2試藥 乙腈、甲醇(色譜級,美國Honeywell公司);水為自制超純水;其余藥品均為分析純。天麻素(批號110807-202010,質(zhì)量分數(shù)95.5%,中國食品藥品檢定研究院);巴利森苷E(編號HP265839,質(zhì)量分數(shù)98%),巴利森苷C(編號HP8265838,質(zhì)量分數(shù)98%),巴利森苷B(編號HP265837,質(zhì)量分數(shù)98%),巴利森苷A(編號HP265836,質(zhì)量分數(shù)98%),丹參素鈉(編號HS034209,質(zhì)量分數(shù)98%),對羥基苯甲醇(編號HA062812,質(zhì)量分數(shù)98%),原兒茶醛(編號HP019896,質(zhì)量分數(shù)98%),二苯乙烯苷(編號HO118401,質(zhì)量分數(shù)98%),丹酚酸B(批號HA170502,質(zhì)量分數(shù)98%),均購自寶雞辰光生物技術(shù)有限公司;川芎(批號200604)、制何首烏(批號200921)、丹參(批號200824)、郁金(批號200726)、山楂(批號201022)、天麻(批號201108),均購自陜西鐸耀中藥飲片有限公司;益腦心顆粒(國藥準字Z20025079,規(guī)格15 g×9袋/盒,批號010001~010015,編號S1~S15,陜西漢王藥業(yè)股份有限公司)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1色譜條件 色譜柱:Shim-pack Scepter C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流動相:0.1 g·L-1甲酸水溶液溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0~8 min,96%~91% A;8~43 min,91%~68% A;43~70 min,68%~50% A)。記錄時間:70 min;流速:0.8 mL·min-1;柱溫:20℃;檢測波長:220、310 nm;進樣量:10 μL。

    2.2混合對照品溶液的配制 分別精密稱取巴利森苷A 6.64 mg、巴利森苷B 5.74 mg、巴利森苷C 10.73 mg、原兒茶醛 9.05 mg 置于50 mL量瓶中,加體積分數(shù)為50%的甲醇至刻度,搖勻,作為A溶液;另再分別精密稱取對照品天麻素7.32 mg、丹參素鈉12.01 mg、對羥基苯甲醇6.62 mg、巴利森苷E 7.03 mg、二苯乙烯苷6.12 mg、丹酚酸B 22.23 mg置于10 mL量瓶中,加A溶液至刻度,搖勻,即得10種成分的混合對照品溶液,作為儲備液。

    2.3供試品溶液的制備 取5袋益腦心顆粒內(nèi)容物,研細,混勻,精密稱定5 g,置于具塞錐形瓶中,加入體積分數(shù)為50%的甲醇50 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率100 W,頻率40 Hz)40 min,取出,放冷,再稱定質(zhì)量,用體積分數(shù)為50%的甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,用0.45 μm的微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即為供試品溶液。

    2.4陰性對照溶液的制備 按處方比例分別制成缺天麻、缺制首烏、缺丹參的模擬制劑,再依據(jù)2.3項下方法制備缺天麻、缺制首烏、缺丹參的陰性對照溶液。

    2.5線性關(guān)系考察 分別精密量取儲備液0.01、0.04、0.20、0.40、0.08、1.00 mL,分別置于1 mL量瓶中,加體積分數(shù)為50%的甲醇定容,混勻,即得系列混合對照品溶液,進樣。以各對照品的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(x)、峰面積值為縱坐標(y),繪制標準曲線,進行線性回歸。線性方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)(r)見表1。結(jié)果表明,10種對照品在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    表1 對照品的線性方程與質(zhì)量濃度范圍及相關(guān)系數(shù)Tab.1 Linear equations and their concentration ranges of the reference substances

    2.6專屬性實驗 分別精密量取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL進樣,記錄色譜圖。實驗結(jié)果見圖1,結(jié)果表明陰性對照無干擾,專屬性強。

    圖1 HPLC圖注:A.混合對照品;B.供試品;C.天麻陰性對照;D.制何首烏陰性對照;E.丹參陰性對照;1.天麻素;2.丹參素鈉;3.對羥基苯甲醇;4.巴利森苷E;5.原兒茶醛;6.巴利森苷B;7.巴利森苷C;8.巴利森苷A;9.二苯乙烯苷;10.丹酚酸B。Fig.1 HPLC chromatogramsNotes:A.mixed reference substance;B.sample;C.sample without Gastrodiae Rhizoma;D.sample without Polygoni multiflori radix Praeparata;E.sample without Salviae miltiorrhizae radix Et Rhizoma;1.gastrodin;2.danshensu sodium;3.p-hydroxybenzyl alcohol;4.palisenoside E;5.protocatechuic aldehyde;6.palisenoside B;7.palisenoside C;8.palisenoside A;9.stilbene glycoside;10.salvianolic acid B.

    2.7精密度實驗 精密吸取供試品溶液(批號010001),重復(fù)進樣5次,計算得天麻素、丹參素鈉、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、原兒茶醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、二苯乙烯苷、丹酚酸B峰面積的RSD值分別為0.99%、0.95%、1.09%、1.04%、0.97%、0.91%、0.97%、0.91%、0.92%、0.85%,表明儀器的精密度良好。

    2.8穩(wěn)定性實驗 精密吸取供試品溶液(批號010001),在0、2、4、8、12、24 h進樣。計算得天麻素、丹參素鈉、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、原兒茶醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、二苯乙烯苷、丹酚酸B峰面積的RSD值分別為0.94%、0.91%、1.17%、1.12%、1.06%、1.21%、1.09%、1.03%、1.08%、1.11%,表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.9重復(fù)性實驗 精密稱取樣品(批號010001)6份,分別按2.3項下方法制備供試品溶液,按2.1項下條件測定,計算天麻素、丹參素鈉、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、原兒茶醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、二苯乙烯苷、丹酚酸B的平均含量與RSD值,結(jié)果見表2,表明該方法重復(fù)性良好。

    表2 重復(fù)性實驗結(jié)果Tab.2 Results of repeatability test

    2.10加樣回收率實驗 精密稱定益腦心顆粒(批號010001)內(nèi)容物7.5 g,置于具塞錐形瓶中,添加混合對照品溶液10 mL(分別精密稱取對照品:天麻素20.52 mg、丹參素鈉100.00 mg、對羥基苯甲醇8.16 mg、巴利森苷E 9.18 mg、原兒茶醛11.22 mg、巴利森苷B 2.55 mg、巴利森苷C 16.33 mg、巴利森苷A 7.14 mg、二苯乙烯苷61.22 mg、丹酚酸B 418.37 mg置于100 mL量瓶中加體積分數(shù)為50%的甲醇至刻度,搖勻,得混合對照品溶液,質(zhì)量濃度依次為0.196、0.980、0.080、0.090、0.110、0.025、0.160、0.070、0.600、4.100 mg·mL-1),再按照2.3項下方法制備供試品溶液,按照2.1項下色譜條件測定,重復(fù)制樣6份,結(jié)果見表3,表明該方法回收率良好。

    表3 加樣回收率實驗結(jié)果Tab.3 Test results of sample recovery

    2.11含量測定 精密稱取15批樣品,分別按2.3項下方法制備供試品溶液,按2.1項下條件測定。天麻素、丹參素鈉、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、原兒茶醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、二苯乙烯苷、丹酚酸B的含量測定結(jié)果見圖1與表4。

    表4 15批益腦心顆粒中10種成分的含量測定結(jié)果Tab.4 The results of determination of 10 components in 15 batches of Yinaoxin Granules

    2.12色譜條件及制樣方法篩選結(jié)果 對以下項目進行比較:不同品牌的色譜柱,如Shim-pack Scepter C18、Phenomenex/Luna C18、Kromasil C18等,不同規(guī)格,如(150 mm×4.6 mm,5 μm)、(250 mm×4.6 mm,5 μm)、(100 mm×4.6 mm,5 μm)等;不同流動相系統(tǒng),如甲醇-甲酸水溶液(0.05、0.1、0.15 g·L-1)、乙腈-甲酸水溶液(0、0.05、0.1、0.15 g·L-1)、 乙腈-醋酸水溶液(0.2、0.5、1.0 g·L-1)等;不同柱溫(20、25、30 ℃);不同流速(0.6、0.8、1.0、1.2 mL·min-1);不同溶劑(甲醇、水、不同體積分數(shù)的甲醇、不同體積分數(shù)的乙醇);提取方法(超聲及超聲時間、加熱回流)等。最終選擇色譜柱為Shim-pack Scepter C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相系統(tǒng)為0.1 g·L-1甲酸水溶液-乙腈,梯度洗脫;流速為0.8 mL·min-1;柱溫為20 ℃;選擇體積分數(shù)為50%的乙醇超聲。見2.1項、2.3項及圖2~圖5。

    圖2 不同品牌色譜柱HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of different brands of chromatographic columns注:A.檢測波長為220 nm;B.檢測波長為310 nm;a、d.Shim-pack Scepter C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm);b、e.Phenomenex/Luna C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm);c、f.Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm)。1.天麻素;2.丹參素鈉;3.對羥基苯甲醇;4.巴利森苷E;5.原兒茶醛;6.巴利森苷B;7.巴利森苷C;8.巴利森苷A;9.二苯乙烯苷;10.丹酚酸B。Notes:A.the detection wavelength was 220 nm;B.the detection wavelength was 310 nm;a,d.Shim-pack Scepter C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);b,e.Phenomenex/Luna C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm);c,f.Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm).1.gastrodin;2.danshensu sodium;3.p-hydroxybenzyl alcohol;4.palisenoside E;5.protocatechuic aldehyde;6.palisenoside B;7.palisenoside C;8.palisenoside A;9.stilbene glycoside;10.salvianolic acid B.

    圖3 不同規(guī)格色譜柱HPLC圖(220 nm)注:A.250 mm×4.6 mm,5 μm;B.150 mm×4.6 mm,5 μm;C.100 mm×4.6 mm,5 μm;1.天麻素;2.丹參素鈉;3.對羥基苯甲醇;4.巴利森苷E;5.原兒茶醛;6.巴利森苷B;7.巴利森苷C;8.巴利森苷A;9.二苯乙烯苷;10.丹酚酸B。Fig.3 HPLC chromatograms of different specifications of chromatographic columns (220 nm)Notes:A.250 mm×4.6 mm,5 μm;B.150 mm×4.6 mm,5 μm;C.100 mm×4.6 mm,5 μm;1.gastrodin;2.danshensu sodium;3.p-hydroxybenzyl alcohol;4.palisenoside E;5.protocatechuic aldehyde;6.palisenoside B;7.palisenoside C;8.palisenoside A;9.stilbene glycoside;10.salvianolic acid B.

    圖4 不同流動相與不同柱溫HPLC圖(220 nm)

    圖5 不同流速、樣品不同處理方法與不同超聲時間HPLC圖注:A.不同流速;B.樣品不同處理方法;C.不同超聲時間;s1.流速為0.6 mL·min-1;s2.流速為0.8 mL·min-1;s3.流速為1.0 mL·min-1;s4.流速為1.2 mL·min-1;t1.樣品處理溶劑為甲醇超聲40 min;t2.樣品處理溶劑為水超聲40 min;t3.樣品處理溶劑為體積分數(shù)50%甲醇,超聲40 min;t4.樣品處理溶劑為體積分數(shù)50%乙醇,加熱回流40 min;u1.樣品處理溶劑為體積分數(shù)50%乙醇,加熱回流30 min;u2.樣品處理溶劑為體積分數(shù)50%乙醇,超聲60 min。Fig.5 HPLC chromatograms of different flow rates,different sample treatment methods and different ultrasonic timesNotes:A.different flow rates;B.different treatment methods of samples;C.different ultrasonic time;s1.the flow rate was 0.6 mL·min-1;s2.the flow rate was 0.8 mL·min-1;s3.the flow rate was 1.0 mL·min-1;s4.the flow rate was 1.2 mL·min-1;t1.the sample treatment solvent was methanol,ultrasonic for 40 min;t2.the sample treatment solvent was water ultrasonic for 40 min;t3.the sample treatment solvent was 50% methanol,ultrasonic for 40 min;t4.the sample treatment solvent was 50% ethanol,heated and refluxed for 40 min;u1.sample treatment solvent was 50% ethanol,heated and refluxed for 30 min;u2.sample was treated with 50% ethanol for 60 min.

    2.13化學(xué)計量研究

    2.13.1聚類分析 運用SPSS 26.0軟件,以15批益腦心顆粒中10種活性成分的含量為數(shù)據(jù)樣本,采用組間聯(lián)接法,以歐氏距離為測度[24-25],進行系統(tǒng)CA,結(jié)果見圖6。依據(jù)聚類分析樹狀圖,當類間距離為6時,15批樣品可聚為4類,S3、S13、S8、S6、S5、S15、S7、S9、S10為第Ⅰ類,S1、S11為第Ⅱ類,S2、S12為第Ⅲ類,S4、S14為第Ⅳ類;當類間距離為10時,15批樣品可聚為3類,上述第Ⅰ、Ⅱ類聚為一類,第Ⅲ類聚為一類;第Ⅳ類聚為一類。當類間距離為15時,15批樣品可聚為2類,上述第Ⅰ、Ⅱ類聚為一類,第Ⅲ、Ⅳ類聚為一類;第Ⅳ類聚為一類。

    圖6 15批益腦心顆粒聚類分析樹狀圖Fig.6 CA tree diagram of 15 batches of Yinaoxin Granules

    2.13.2主成分分析 將15批益腦心顆粒中10種成分的含量導(dǎo)入統(tǒng)計軟件SPSS 26.0 中,進行PCA,計算相關(guān)系數(shù)的特征值和方差貢獻率[24-25],提取出4種主成分,結(jié)果見圖7和表5。由表5可知,前4種主成分特征值大于1,即3.244、2.518、1.757、1.270,對方差的貢獻率分別為32.439%、25.176%、17.568%、12.698%,累計方差貢獻率為87.881%,大于85%,表明提取前4種主成分即可代表益腦心顆粒10種共有成分87.881%的信息,可以被用于評價益腦心顆粒的質(zhì)量。

    圖7 樣品PCA碎石圖Fig.7 PCA scree plot of various samples

    表5 主成分方差分析Tab.5 Analysis of variance for PCA

    以y1、y2、y3、y4表示表6種4種主成分1、2、3、4作為15批次益腦心顆粒所含10種成分的信息并建立線性方程。

    表6 初始因子載荷矩陣Tab.6 Initial factor load matrix

    y1=0.531x1+0.483x2-0.46x3-0.453x4+0.167x5-0.021x6+0.121x7+0.087x8+0.079x9-0.056x10;y2=0.023x1+0.127x2-0.025x3+282x4+0.553x5+0.461x6-0.387x7+0.175x8-0.331x9-0.309x10;y3=-0.001x1+0.129x2+0.234x3+0.033x4-0.177x5+0.269x6-0.073x7+0.684x8+0.592x9-0.006x10;y4=-0.023x1-0.32x2-0.339x3-0.138x4+0.121x5+0.339x6-0.258x7+0.005x8+0.062x9+0.75x10。式中各變量為標準化變量。將線性方程與所對應(yīng)主成分的方差貢獻率相乘后再除以累計貢獻率可計算綜合得分,計算綜合得分的方程為y=(32.439y1+25.176y2+17.568y3+12.698y4)/87.881。根據(jù)此方程計算得出的綜合得分與排序見表7。綜合得分越高,表明該批次樣品的質(zhì)量越好。由表7可見,010010批次的質(zhì)量最優(yōu),其次是010009批次和010006批次,排在最后是010001批次和010011批次。

    表7 15批益腦心顆粒的綜合得分Tab.7 Comprehensive score of 15 samples Yinaoxin Granules

    3 分析與討論

    3.1檢測方法的選擇 使用二極管陣列檢測器對益腦心顆粒樣品進行全波長掃描,結(jié)果顯示各成分的最大吸收波長:天麻素為220、270 nm,丹參素鈉為199、301 nm,對羥基苯甲醇為223、274 nm,原兒茶醛為277、312 nm,巴森利甘A、B、C、E均為220、270 nm,二苯乙烯苷為235、310 nm,丹酚酸B為288、309 nm。因此,將220 nm作為天麻素、對羥基苯甲醇及巴森利甘A、B、C、E的檢測波長,將310 nm作為丹參素鈉、原兒茶醛、二苯乙烯苷、丹酚酸B的檢測波長。采用梯度洗脫,選擇不同品牌的色譜柱,如Shim-pack Scepter C18、Phenomenex/Luna C18、Kromasil C18等進行比較,選擇不同規(guī)格的色譜柱,如(150 mm×4.6 mm,5 μm),(250 mm×4.6 mm,5 μm)、(100 mm×4.6 mm,5 μm)等進行比較,選擇不同流動相系統(tǒng),如甲醇-甲酸水溶液(0.05、0.1、0.15 g·L-1),乙腈-甲酸水溶液(0、0.05、0.1、0.15 g·L-1),乙腈-醋酸水溶液(0.2、0.5、1.0 g·L-1)等,選擇不同柱溫(20、25、30 ℃),不同流速(0.6、0.8、1.0、1.2 mL·min-1)進行比較。最終確定檢測色譜條件:色譜柱Shim-pack Scepter C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相系統(tǒng)乙腈-0.1 g·L-1甲酸水溶液;柱溫20 ℃;流速0.8 mL·min-1,在該條件下目標峰分離度良好。因為天麻含有天麻素、對羥基苯甲醇及巴森利甘A、B、C、E等成分,所以制備陰性對照時需要剔除天麻;二苯乙烯苷僅在制首烏中存在,制備陰性對照時需要去除制首烏;丹參中含有丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B,故制備陰性對照時需要去除丹參。益腦心顆粒中天麻為生藥粉入藥,對溶劑(甲醇、水、不同體積分數(shù)的甲醇、不同體積分數(shù)的乙醇)及提取方法(超聲及超聲時間、加熱回流)等進行比較,結(jié)果選擇體積分數(shù)為50%的乙醇超聲40 min提取,得到較理想的目標峰信息。

    3.2化學(xué)計量學(xué)研究 CA結(jié)果顯示聚類為兩大類,不同批次益腦心顆粒中10種成分的含量差異可能與益腦心顆粒生產(chǎn)所用原藥材的種屬來源、產(chǎn)地、采收季節(jié)、生長年限、加工炮制方式等因素有關(guān)。PCA結(jié)果顯示前4種主成分特征值大于1(分別為3.244、2.518、1.757、1.270),對方差的貢獻率分別為32.439%、25.176%、17.568%、12.698%,累計方差貢獻率達87.881%,大于85%,表明提取前4種主成分即可代表益腦心顆粒10種共有成分87.881%的信息;綜合得分表明,編號為010010、010009和010006的樣品質(zhì)量較好。因此,2項分析可以用于評價益腦心顆粒的質(zhì)量。

    總之,本實驗采用HPLC 梯度洗脫法測定了益腦心顆粒中天麻素、丹參素鈉、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、原兒茶醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、二苯乙烯苷、丹酚酸B的含量,該方法操作簡單,易于實施,準確性、穩(wěn)定性、重復(fù)性好,專屬性強,并對含量測定結(jié)果進行了PCA和CA,提示藥品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)加強對原藥材源頭的質(zhì)量控制和對藥品生產(chǎn)過程參數(shù)的優(yōu)化。本研究亦為全面提升該產(chǎn)品的質(zhì)量,保證該藥品質(zhì)量與臨床療效的一致性提供科學(xué)依據(jù)。

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