Raji-MG63細(xì)胞共培養(yǎng)體系中心肌營養(yǎng)蛋白樣細(xì)胞因子1(CLCF1)對(duì)RANKL/OPG比值及成骨細(xì)胞分化的影響

陳娟 葉云金 謝麗華 陳賽楠 葛繼榮 許惠娟

福建省中醫(yī)藥科學(xué)院骨質(zhì)疏松證候基因組學(xué)重點(diǎn)研究室，福建 福州 350003

2000 年Arron[1]首次提出“骨免疫學(xué)”概念，講述了骨骼系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間的相互關(guān)系，在維持骨代謝平衡過程中，免疫因素發(fā)揮著重要作用。B 淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子和趨化因子等均能與成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞相互作用，調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收[2-3]。其中，骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)/核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)系統(tǒng)是骨代謝與免疫系統(tǒng)之間的橋梁[4]。OPG 主要來源于骨微環(huán)境內(nèi)B 細(xì)胞及漿細(xì)胞，對(duì)骨有保護(hù)作用。成骨細(xì)胞分泌RANKL，可激活破骨細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞(破骨細(xì)胞前體細(xì)胞)膜表面的RANK受體，引起破骨細(xì)胞活化。

心肌營養(yǎng)蛋白樣細(xì)胞因子1(cardiotrophin-like cytokine factor 1，CLCF1)基因?qū)儆诎准?xì)胞介素6(IL-6)細(xì)胞因子家族成員，是一種B細(xì)胞刺激劑，與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)[5-6]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CLCF1 是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)腎陰虛證關(guān)聯(lián)基因[7]。但CLCF1基因參與PMOP的具體機(jī)制尚不清楚。本研究通過構(gòu)建Raji-MG63細(xì)胞共培養(yǎng)體系，研究CLCF1基因?qū)ANKL/OPG比值和成骨細(xì)胞分化的影響。旨在從骨免疫角度，探討CLCF1 對(duì)OPG/RANKL/RANK信號(hào)系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制，闡明PMOP的骨免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人B淋巴瘤細(xì)胞Raji細(xì)胞、人骨肉瘤細(xì)胞 MG63均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；MEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS,GIBCO公司)；青鏈霉素(Invitrogen公司)；CRISPR/Cas9慢病毒系統(tǒng)(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；CLCF1、OPG、RANKL、JAK2、p-JAK2 STAT3、p-STAT3、GAPDH抗體(Abcam公司)；堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);茜素紅(南京凱基)。

1.2 方法

1.2.1CLCF1基因敲除Raji細(xì)胞株的構(gòu)建：Raji細(xì)胞用含10 % FBS、1 %雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于含5 % CO2孵箱中以37 ℃恒溫培養(yǎng)。CRISPR/ Cas9基因編輯技術(shù)介導(dǎo)的CLCF1基因敲除Raji細(xì)胞株的構(gòu)建,參考文獻(xiàn)[8]。CLCF1 sgRNA 序列5’-TTGAAGTCTGGCTCGTTGAA-3’。實(shí)驗(yàn)分2組：對(duì)照組(Control組)和CLCF1敲除組(CLCF1-KO組)。轉(zhuǎn)染前先將Raji細(xì)胞接種于6孔板中，Control組和CLCF1-KO組按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)100，分別感染CRISPR/ Cas9-CLCF1慢病毒及相應(yīng)陰性對(duì)照慢病毒。24 h后換正常培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染72 h后通過熒光顯微鏡及FCM觀察感染效率，并收取細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.2.2Raji-MG63細(xì)胞共培養(yǎng)體系的構(gòu)建：應(yīng)用Transwell 實(shí)驗(yàn)建立共培養(yǎng)體系，將Raji細(xì)胞種植于24孔板Transwell小室上層,下層為成骨細(xì)胞系MG63，細(xì)胞以完全培養(yǎng)基(RPMI1640培養(yǎng)基+10 %胎牛血清+1 %雙抗)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3Western blot檢測(cè)蛋白水平：運(yùn)用RIPA裂解法提取轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞總蛋白，定量蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品，110 V、120 g/L SDS-PAGE分離蛋白70 min。采用濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜 60 min，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入CLCF1抗體(1∶1 000)、OPG抗體(1∶1 000)、JAK2、p-JAK2 STAT3、p-STAT3抗體(均1∶1 000)、RANKL抗體(1∶500)和GAPDH抗體(1∶2 000)。4 ℃孵育過夜；1×TBST 漂洗3次，加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的二抗(1∶4 000)，常溫孵育1 h；1×TBST 漂洗4 次，避光條件下化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，并進(jìn)行灰度值分析。以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白相對(duì)灰度比值[9]。

1.2.4ALP活性檢測(cè)：參考碧云天堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒說明書，收集各組細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，添加150 μL 0.2 %Triton X-100裂解細(xì)胞，4 ℃，15 000 r/min離心15 min，收集上清液作為樣品；向96孔板內(nèi)添加50 μL底物、30 μL緩沖液和20 μL樣品，在微孔板震蕩器上充分振蕩1 min后，37 ℃孵育15 min；添加100 μL反應(yīng)終止液，在微孔板震蕩器上充分振蕩1 min后，酶標(biāo)儀測(cè)量405 nm處的吸光值；同樣方法進(jìn)行空白(蒸餾水)對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取ALP活性與細(xì)胞蛋白總量的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5茜素紅染色：細(xì)胞用PBS洗2次；每孔加入2 mL 4 %中性甲醛溶液，固定30 min；吸走中性甲醛溶液，用PBS洗2次；每孔加入1 mL茜素紅染液染3～5 min；吸走茜素紅染液，用PBS洗2次；每孔加入 1 mL 10 %十六烷基吡啶，輕微搖晃 10 min 洗脫染料，吸取200 μL 加入96孔板中，分光光度計(jì)檢測(cè) 540 nm 處吸光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 抑制CLCF1基因表達(dá)對(duì)RANKL/OPG比值和JAK2/STAT3通路的影響

CRISPR/ Cas9-CLCF1慢病毒感染Raji細(xì)胞72 h后,Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CLCF1基因敲除組CLCF1蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1 A)，提示成功建立CLCF1基因敲除的Raji細(xì)胞株。

為探討CLCF1基因?qū)ANKL/OPG和JAK2/STAT3通路的調(diào)控作用，筆者檢測(cè)了相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CLCF1基因的敲除顯著降低OPG的表達(dá)，但對(duì)RANKL的表達(dá)影響輕微(圖1 A，圖1B)。與對(duì)照組相比，CLCF1基因敲除增加了RANKL/OPG比率(圖1C)。此外，CLCF1基因敲除組，p-JAK2 和p-STAT3水平均減少(圖1 A)，p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3比值降低(圖1B)。說明抑制CLCF1表達(dá)，會(huì)抑制JAK2/STAT3通路的激活，并影響RANKL/OPG的比值。

圖1 CLCF1對(duì)JAK2/STAT3通路和RANKL/OPG比值的影響A:Weste blot分析CLCF1基因敲除對(duì)JAK2/STAT3通路及RANKL和OPG影響;B:相對(duì)蛋白質(zhì)水平的定量分析;C:Weste blot分析顯示CLCF1基因敲除對(duì)RANKL/OPG比值的影響。注：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。Fig.1 Effects of CLCF1 on the JAK2/STAT3 pathway and RANKL/OPG ratio

2.2 抑制CLCF1基因表達(dá)對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響

為了探討CLCF1基因能否通過RANKL/OPG系統(tǒng)影響成骨細(xì)胞分化，筆者通過Transwell小室建立了Raji-MG63細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)。通過堿性磷酸酶(ALP)活性和茜素紅S染色水平分析MG63細(xì)胞成骨分化能力。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，CLCF1基因敲除組MG-63細(xì)胞ALP活性降低(圖2 A)。鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量和體積明顯低于對(duì)照組，茜素紅半定量結(jié)果顯示CLCF1基因敲除組成骨能力弱于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B)。提示抑制CLCF1基因表達(dá)能抑制成骨細(xì)胞分化。WB結(jié)果顯示，CLCF1基因敲除組MG63細(xì)胞OPG蛋白表達(dá)水平明顯降低，RANKL蛋白上調(diào)，RANKL/OPG 比值升高；同時(shí)，p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3比值降低。與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2C)。

圖2 CLCF1基因敲除對(duì)Raji-MG-63共培養(yǎng)體系中MG-63細(xì)胞成骨分化的影響A：MG63細(xì)胞JAK2/STAT3通路和RANKL/OPG的相對(duì)蛋白水平的定量分析；B：MG-63細(xì)胞ALP活性評(píng)價(jià)成骨能力的分析；C：茜素紅染色分析MG63細(xì)胞成骨能力。注：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。Fig.2 Effect of CLCF1 gene knockout on osteogenic differentiation of the MG-63 cells in the Raji-MG-63 co-culture system

3 討論

CLCF1作為IL-6家族的細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的發(fā)育。然而，CLCF1在骨代謝的生理和病理學(xué)中的作用尚待明確。本研究結(jié)果表明，抑制 CLCF1的表達(dá)能使JAK2/STAT3通路失活、RANKL/OPG比值升高。此外，CLCF1基因敲除能抑制成骨細(xì)胞分化。提示CLCF1可能通過調(diào)節(jié)RANKL/OPG平衡在免疫介導(dǎo)的骨代謝中發(fā)揮作用。

骨免疫學(xué)的概念指出，骨質(zhì)疏松癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和牙周炎等慢性炎癥性疾病通過激活免疫細(xì)胞合成的細(xì)胞因子來誘導(dǎo)骨丟失[10-11]。在這方面，許多被認(rèn)為與骨免疫相關(guān)的細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素6(IL-6)[12]、腫瘤壞死因子α(TNF-α)[13]、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)[14]、核因子-κB受體激活劑(RANK)及其配體(RANKL)[15]都被發(fā)現(xiàn)參與了這一生物學(xué)過程。OPG/RANK/RANKL通路在骨免疫中的作用已被廣泛報(bào)道。RANKL負(fù)責(zé)刺激破骨細(xì)胞分化和骨吸收，而OPG通過阻斷RANKL抑制骨吸收。OPG、RANKL 和其唯一受體RANK是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化成熟的重要信號(hào)系統(tǒng)，在骨質(zhì)疏松中起重要作用[16]。RANKL能激活單核巨噬細(xì)胞(破骨細(xì)胞前體細(xì)胞)膜表面的RANK受體，促進(jìn)破骨細(xì)胞的活化[17]。RANKL作為一種重要的細(xì)胞因子,能調(diào)節(jié)T細(xì)胞和早期階段B細(xì)胞的發(fā)育和功能,對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)育也起著起重要作用。OPG與RANK競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合RANKL，阻斷RANKL與RANK結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化，起到抑制骨吸收的作用[18]。因此OPG/RANKL/RANK信號(hào)系統(tǒng)被認(rèn)為是骨免疫研究的介入點(diǎn)。

作為IL-6細(xì)胞因子家族的一員，CLCF1在免疫細(xì)胞中高表達(dá)。CLCF1的作用主要在于支持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生存和發(fā)育。同時(shí)，CLCF1在免疫調(diào)節(jié)功能和B細(xì)胞擴(kuò)張中也發(fā)揮重要作用，影響B(tài)細(xì)胞群的存活和分化[19]。研究[20]表明，由 B細(xì)胞所表達(dá)的RANKL促進(jìn)破骨前體細(xì)胞分化，并引發(fā)骨吸收。在骨骼生物學(xué)中起著至關(guān)重要的作用。IL-6家族的成員，包括睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、心肌營養(yǎng)素-1(CT-1)和腫瘤抑制素M(OSM)等已被證明能在病理?xiàng)l件下刺激成骨細(xì)胞分化并促進(jìn)骨吸收[21-22]。和其他IL-6家族細(xì)胞因子不同的是，關(guān)于CLCF1在骨代謝中作用的數(shù)據(jù)甚少報(bào)道。本研究結(jié)果表明，抑制CLCF1基因表達(dá)，會(huì)引起RANKL/OPG比值失調(diào)。因此，筆者推測(cè)，CLCFI基因可能通過調(diào)節(jié)B細(xì)胞RANKL/OPG的平衡，從而在骨免疫和骨代謝中發(fā)揮重要作用。

CLCF1也參與JAK/STAT級(jí)聯(lián)反應(yīng)的調(diào)節(jié)。Mukut Sharma等[23]的研究表明，CLCF1誘導(dǎo)的STAT3磷酸化。CLCF1作為潛在循環(huán)因子，促進(jìn)腎小球足細(xì)胞中的JAK/STAT信號(hào)通路，在人類腎臟疾病局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用[24]。JAK2/STAT3通路在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。最近的研究[25-26]表明JAK2/STAT3通路能調(diào)節(jié)RANKL水平并增強(qiáng)破骨細(xì)胞的分化。此外，本研究結(jié)果表明，CLCF1基因敲除后，抑制了JAK2/STAT3通路的激活。提示CLCF1可能通過JAK2/STAT3調(diào)控RANKL/OPG的表達(dá)，進(jìn)而影響骨代謝，這一點(diǎn)有待于后續(xù)深入的研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示CLCF1可能是骨免疫調(diào)控基因，通過調(diào)控B淋巴細(xì)胞，影響OPG的生成，繼而影響RANKL/OPG的平衡和成骨分化，參與骨代謝過程。這些結(jié)果為免疫-骨骼相互作用的機(jī)制提供了新的理解，并為CLCF1作為病理性骨丟失的創(chuàng)新治療靶點(diǎn)提供了前景。