142例支氣管肺泡灌洗液真菌免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果與G/GM試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比分析

李剛榮 白明明 陶朝欣 楊會(huì)濤 許麗亞

(1.河北省強(qiáng)制隔離戒毒所醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊 050081；2.石家莊榮璦醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所檢驗(yàn)科，石家莊 050021)

近年來，隨著人口老齡化及抗生素的廣泛使用，肺部真菌感染呈升高趨勢(shì)，當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時(shí)可引發(fā)肺部真菌感染[1]，真菌感染后的早期診斷及時(shí)治療對(duì)降低患者死亡率至關(guān)重要。真菌的檢測(cè)手段一直以來是臨床最為迫切的需求，血漿(1,3)-β-D葡聚糖(BG)試驗(yàn)(G試驗(yàn)，Glucan test)和半乳甘露聚糖抗原檢測(cè)試驗(yàn)(GM試驗(yàn),Galactomannan test)的發(fā)展和推廣，為臨床提供了快速有效的檢測(cè)方法。支氣管肺泡灌洗液(brondioalveolar lavage fluid，BALF)的G/GM試驗(yàn)在用于肺部真菌感染的診斷方面逐年推廣，相較于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，該方法具有快速高效、靈敏度和特異性較高的優(yōu)勢(shì)，因而被廣泛運(yùn)用于臨床[2]。

真菌免疫熒光染色檢測(cè)是近年來新發(fā)展的一種染色技術(shù)，染色液中的熒光增白劑是一種熒光染料，與多種植物以及真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)和纖維素具有較強(qiáng)的親和力，在特定的紫外光下(350～400 nm)，能夠發(fā)出亮藍(lán)色熒光，通過熒光顯微鏡觀察其形態(tài)，可達(dá)到檢測(cè)出真菌的目的。我們對(duì)142例BALF進(jìn)行G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行免疫熒光染色法和氫氧化鉀(KOH)濕片法鏡檢作對(duì)比，以期為肺部真菌感染提供更便捷高效的早期聯(lián)合檢測(cè)方法。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2019年1月至12月送檢至本所的BALF真菌檢測(cè)G試驗(yàn)/GM試驗(yàn)142例，其中男性94例，女性48例，年齡14～86歲，中位年齡55.5歲，臨床初步診斷分別為慢性阻塞性肺部疾病(COPD)59例，重癥肺炎21例，真菌性肺炎24例，肺部感染待查38例。所有送檢的BALF在G/GM試驗(yàn)的同時(shí)進(jìn)行免疫熒光染色檢測(cè)和KOH濕片法鏡檢，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2 標(biāo)本采集

所有BALF均為支氣管鏡下采集，方法如下：患者無纖支鏡禁忌證，應(yīng)用2%利多卡因?yàn)榛颊哌M(jìn)行局部麻醉，待麻醉生效后，經(jīng)鼻腔置入纖支鏡，向可疑肺病變部位進(jìn)行灌洗，灌洗液為滅菌氯化鈉注射液，每次30～50 mL，連續(xù)灌洗3～4次后，采用負(fù)壓吸引下對(duì)灌洗液進(jìn)行回收，收集灌洗液10～15 mL進(jìn)行送檢。

1.3 檢測(cè)試劑

真菌免疫熒光顯色試劑II型購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，10%KOH溶液為本室自制。顯微鏡采用奧林巴斯CX31光學(xué)顯微鏡和熒光模塊(MF-UV-LED-0-3型)。G試驗(yàn)試劑盒為真菌葡聚糖檢測(cè)試劑盒(動(dòng)態(tài)濁度法)，購(gòu)自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，Platelia TM曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)伯樂公司。所有實(shí)驗(yàn)步驟均按本室SOP操作。

1.4 檢驗(yàn)方法

BALFG試驗(yàn)和GM試驗(yàn) 低溫保存并無菌送檢的BALF經(jīng)離心處理后，采集上清液進(jìn)行G、GM試驗(yàn)。BALF G試驗(yàn)采用動(dòng)態(tài)濁度法，應(yīng)用TALgent動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)結(jié)果以其濃度值大于20 pg/mL作為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。GM試驗(yàn)運(yùn)用酶聯(lián)免疫雙抗體夾心一步法，對(duì)每個(gè)受檢標(biāo)本計(jì)算指數(shù)I，BALF的GM試驗(yàn)以待測(cè)標(biāo)本的指數(shù)I≥0.5作為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。

真菌免疫熒光染色 按試劑盒操作說明書進(jìn)行，取待測(cè)BALF標(biāo)本離心2000 g/10 min，棄上清液并充分混合沉淀物，以無菌吸管吸取標(biāo)本，取一滴均勻涂至潔凈載玻片上，分別滴加熒光染色液A液和B液各1滴，覆上蓋玻片，靜置1 min后鏡檢。結(jié)果判讀：真菌的菌絲及孢子均呈亮藍(lán)色，結(jié)構(gòu)清晰明顯，其他細(xì)菌和組織呈弱藍(lán)色熒光，背景為藍(lán)黑色，陽(yáng)性報(bào)告為標(biāo)本經(jīng)熒光染色可見有隔的真菌菌絲和卵圓形真菌孢子，陰性報(bào)告為未找到真菌菌絲和孢子。

KOH濕片直接鏡檢 標(biāo)本同免疫熒光染色處理后滴加1滴10%KOH溶液，蓋上蓋玻片，酒精燈火焰上微加熱后，輕壓蓋玻片，使標(biāo)本透明，顯微鏡下直接觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0分析軟件進(jìn)行處理，所得計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BALF真菌直接鏡檢兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較

142例BALF標(biāo)本中免疫熒光染色檢測(cè)陽(yáng)性52例，陰性90例，陽(yáng)性率為36.62%；KOH濕片直接鏡檢檢測(cè)陽(yáng)性27例，陰性115例，陽(yáng)性率19.01%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=45.003，P<0.001)，見表1。

表1 BALF真菌免疫熒光染色檢測(cè)與KOH濕片法直接鏡檢檢測(cè)結(jié)果比較Tab.1 Comparison between the results of fluorescent staining of BALF fungi and the results of direct microscopic examination by KOH

2.2 BALF G/GM試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

以BG濃度高于20 pg/mL作為陽(yáng)性，G試驗(yàn)檢測(cè)出陽(yáng)性例數(shù)為89例(占62.68%)。同時(shí)以單次I值大于0.5為陽(yáng)性，GM試驗(yàn)陽(yáng)性例數(shù)為23例(占16.20%)，見表2。

表2 142例BALF G試驗(yàn)與GM試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Results of BALF G test and GM test in 142 cases

2.3 BALF G試驗(yàn)與免疫熒光染色聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)真菌免疫熒光染色操作說明書，檢出真菌菌絲或孢子者判斷為真菌免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，52例BALF 真菌免疫熒光染色檢測(cè)陽(yáng)性中同時(shí)G試驗(yàn)陽(yáng)性者為49例，GM試驗(yàn)陽(yáng)性者為11例，見表3。G試驗(yàn)陽(yáng)性中免疫熒光染色陽(yáng)性時(shí)BALF G試驗(yàn)(BG)濃度與陰性時(shí)BG濃度比較，兩者差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.814)，見表4。

表3 142例BALF G/GM試驗(yàn)與免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Results of BALF G / GM test and immunofluorescent staining in 142 cases

表4 真菌免疫熒光染色陽(yáng)性BG濃度結(jié)果比較 [例(%)]Tab.4 Comparison of G-test results of fungus fluorescent staining positive BALF [n(%)]

3 討 論

肺部真菌感染的早期診斷對(duì)臨床上很多免疫功能低下的老年患者來說是關(guān)鍵因素，而傳統(tǒng)的呼吸道痰培養(yǎng)及KOH濕片法鏡檢檢出真菌方法敏感性及特異性均較差。G試驗(yàn)是一種通過顯色法對(duì)產(chǎn)生(1,3)-β-D葡聚糖的真菌感染進(jìn)行早期診斷的方法，因普遍存在于真菌細(xì)胞壁中，能特異性激活鱟成份中的凝血因子G因子從而激活鱟試驗(yàn)[3]。體液中的BG含量上升是人體感染真菌后的1種現(xiàn)象，檢測(cè)其水平已成為肺部真菌感染診斷的重要手段。有研究表明BALF(1,3)-β-D葡聚糖濃度峰值出現(xiàn)時(shí)間要早于血漿，且具有較高的特異性，有利于早期診斷[4]。GM試驗(yàn)是檢測(cè)大多數(shù)曲霉感染的一種手段，曲霉在體內(nèi)外生長(zhǎng)時(shí)都能釋放GM抗原。研究表明支氣管鏡下采集BALF行GM試驗(yàn)聯(lián)合G試驗(yàn)，對(duì)于診斷肺曲霉病優(yōu)于單獨(dú)的GM試驗(yàn)、G試驗(yàn)以及血清GM試驗(yàn)聯(lián)合G試驗(yàn)，而聯(lián)合檢測(cè)可以彌補(bǔ)單項(xiàng)檢測(cè)的不足，具有準(zhǔn)確率高、靈敏度高和特異度高等優(yōu)點(diǎn)，有助于肺曲霉的早期診斷[5]。

免疫熒光染色檢測(cè)真菌可直接通過熒光顯微鏡觀察真菌形態(tài)，鏡下菌絲和孢子結(jié)構(gòu)清晰可見(見圖1～8)，顯微鏡下直接檢測(cè)出菌絲或者孢子對(duì)臨床深部真菌感染具有直接指導(dǎo)作用。無論淺部真菌還是深部真菌，相較傳統(tǒng)的KOH濕片法大大提高了真菌的檢出率[6]，同時(shí)免疫熒光染色后標(biāo)本中的菌絲孢子呈現(xiàn)亮藍(lán)色，易分辨，不易漏檢和誤檢，分析顯示免疫熒光染色的真菌檢出率明顯高于KOH濕片法(見表1)。

通過對(duì)BALF真菌免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果與G/GM試驗(yàn)的對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，142例BALF檢測(cè)G試驗(yàn)陽(yáng)性共89例，免疫熒光染色陽(yáng)性為52例，免疫熒光染色與G實(shí)驗(yàn)同時(shí)陽(yáng)性者為49例，與GM試驗(yàn)同時(shí)陽(yáng)性者為11例。BALF中G/GM試驗(yàn)的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于肺部真菌感染的指導(dǎo)價(jià)值，已有很多臨床研究進(jìn)行了探討。BALF真菌免疫熒光染色檢測(cè)受到真菌在標(biāo)本中的含量及檢驗(yàn)醫(yī)師的閱片水平等因素的影響，存在一定程度的假陰性率，在試驗(yàn)設(shè)定的G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)下，真菌免疫熒光染色檢測(cè)的相對(duì)假陰性率分別為44.94%和52.17%。BALF G試驗(yàn)陽(yáng)性時(shí)真菌免疫熒光染色陽(yáng)性與陰性的BG濃度值之間并無顯著差異，P=0.814(見表4)，表明在顯微鏡下未檢測(cè)出真菌時(shí)，通過G試驗(yàn)仍可能檢測(cè)出高濃度BG，可能與真菌感染局部肺組織后形態(tài)被破壞或者標(biāo)本采集的因素影響有關(guān)，這也是導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性的原因。同時(shí)仍有3例(5.67%)G試驗(yàn)陰性BALF標(biāo)本中通過免疫熒光染色直接檢測(cè)出真菌(見表3)，因此，采用多種方法聯(lián)合檢測(cè)共同分析肺部真菌感染，避免單一檢測(cè)方法的假陽(yáng)性或假陰性是臨床診斷工作中的重要方法。

圖1-4 BALF真菌免疫熒光染色檢測(cè)鏡下菌絲(10×40) 圖5-8 BALF真菌免疫熒光染色檢測(cè)鏡下孢子(10×40)Fig.1-4 Detection of hyphae (10×40) in BALF by immunofluorescent staining Fig.5-8 Detection of spores (10×40) in BALF by immunofluorescent staining

真菌菌絲及孢子經(jīng)熒光染色后，形態(tài)清晰，輪廓分明，易于識(shí)別，能提高常規(guī)染色和KOH濕片檢測(cè)真菌的陽(yáng)性率，對(duì)于一些特殊的典型菌體如曲霉、馬爾尼菲籃狀菌、毛霉、接合菌還可以提供初步的形態(tài)學(xué)診斷[7]，這是其他快速檢測(cè)方法所不具備的。因此真菌免疫熒光染色檢測(cè)作為一種快速方便高效直觀的真菌常規(guī)檢測(cè)方法，是BALF標(biāo)本真菌檢測(cè)的重要補(bǔ)充，為臨床肺部真菌感染的診斷提供了一種快速檢測(cè)方法。進(jìn)一步將真菌免疫熒光染色檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合其他檢測(cè)方法，降低肺部及其他臟器的真菌感染假陰性率是今后的重點(diǎn)研究課題。