己糖氧化酶的研究進(jìn)展

包怡,胡友明,朱林江,陸躍樂(lè),陳小龍

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,浙江 杭州,310014)

食品用酶制劑是指從生物中提取且有催化活性的蛋白質(zhì),具有加速食品生產(chǎn)過(guò)程和改善食品品質(zhì)的作用[1-2]。近年來(lái),隨著食品加工行業(yè)的發(fā)展,食品用酶制劑以其安全無(wú)毒、反應(yīng)條件溫和、具有專一性等優(yōu)點(diǎn),常用于對(duì)食品加工過(guò)程進(jìn)行工藝優(yōu)化,以改善食品風(fēng)味、色澤、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì),提高產(chǎn)率,延長(zhǎng)貨架期等[2-7]。常用的食品酶制劑有淀粉酶、木瓜蛋白酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)、己糖氧化酶(hexose oxidase,HOX)等[4,8-9]。

近幾年,GOD和HOX因具有殺菌、脫氧、去除葡萄糖的作用逐漸得到了廣泛的研究和應(yīng)用,常用于啤酒、牛奶保鮮、蛋白脫糖、面粉改良、紡織品漂白,檢測(cè)血糖濃度和抑制病原微生物等[6,10-14]。HOX具有廣泛的底物特異性,在面包烘焙、乳制品酸化、動(dòng)物飼料添加劑等方面都具有良好的應(yīng)用價(jià)值[15-18]。

HOX是從紅藻類物種中提取的一種能夠催化六碳糖氧化為相應(yīng)內(nèi)酯的酶,具有較寬底物譜。除葡萄糖外,HOX還可利用其他單糖和二糖進(jìn)行除氧和酸化,如D-半乳糖,麥芽糖等,從而作為天然的抗氧化劑、防腐劑、保鮮劑和酸化劑用于食品。本文主要介紹了HOX的分離純化方法和酶學(xué)性質(zhì),并對(duì)生產(chǎn)方法和在食品方面的應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)介紹,以期為HOX的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供參考。

1 HOX的發(fā)現(xiàn)

1969年,IKAWA等[19]在新英格蘭海岸發(fā)現(xiàn)2種紅藻Chondruscrispus和Euthoracristata能夠抑制蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)的生長(zhǎng)，進(jìn)一步研究表明,該抑制行為是由于蛋白核小球藻生長(zhǎng)環(huán)境中的葡萄糖被氧化而釋放出的H2O2所致，后經(jīng)過(guò)分離鑒定表明,這2種紅藻中存在的HOX催化了這一氧化反應(yīng)。后來(lái),BEAN等[20]從Iridophycusflaccidum中也提取了HOX,兩者性質(zhì)較為相似，均可利用多種底物,包括D-葡萄糖、D-半乳糖、麥芽糖、乳糖和纖維二糖等。這種廣泛的底物特異性使HOX與GOD存在顯著差異,后者只能特異地催化D-葡萄糖的氧化[21]。

目前已被表征的HOX主要來(lái)源于紅藻類物種,包括C.crispus、I.flaccidum和E.cristata。另外,OGASAWARA等[22]從Ptilophorasubcostata中也分離到了HOX。

2 HOX的分離純化

目前,常用的HOX分離純化方法包括以下幾個(gè)步驟：粗酶液的濃縮、鹽析、脫鹽和層析。分離純化過(guò)程中通常會(huì)將幾種方法結(jié)合使用以獲得高純度的蛋白。

SULLIVAN等[23]采用鹽析、離子交換層析和凝膠過(guò)濾結(jié)合的方法首次從C.crispus中純化得到HOX。將經(jīng)過(guò)初步處理的HOX粗酶液用DEAE-纖維素色譜純化,通過(guò)含有NaCl的磷酸緩沖液洗脫后以水透析,隨后又采用葡聚糖凝膠G-200進(jìn)一步純化。其中,采用了胃蛋白酶-胰蛋白酶處理DEAE-纖維素色譜純化后的酶,這一過(guò)程對(duì)于去除HOX中的藻紅蛋白至關(guān)重要,且酶活力并未因此受到影響,最終比酶活力為4 095 U/mg[23]。

采用上述離子交換層析和凝膠過(guò)濾結(jié)合的方法,雖然純化出的HOX純度較高,但操作繁瑣、耗時(shí)、收率低。SAVARY等[24]優(yōu)化了分離純化的方法,采用灌注層析法。多孔灌注色譜的介質(zhì)基于苯乙烯-二乙烯基苯共聚物,可實(shí)現(xiàn)較高的顆粒內(nèi)對(duì)流傳輸流量,在高流動(dòng)相速度下分離蛋白質(zhì)而不降低分辨率和容量,具有流速快和分辨率高的優(yōu)點(diǎn)[25]。研究中首先采用Poros DEAE色譜,對(duì)粗酶液進(jìn)行純化和濃縮,有效去除了殘留的藻膽蛋白和角叉菜膠。隨后將洗脫的酶液通過(guò)Poros HP2疏水相互作用色譜,并用35%的飽和硫酸銨洗脫。通過(guò)Poros HQ陰離子交換色譜分離到兩個(gè)HOX活性峰,其中第1個(gè)峰在200 mmol/L磷酸鈉時(shí)洗脫,包含約67%的回收活性。與SULLIVAN等[23]采用的DEAE-纖維素色譜相比,Poros HQ/H柱具有與之相當(dāng)?shù)臉悠费b載量,但流速相較前者可提高10倍。

BEAN等[20]嘗試通過(guò)有機(jī)溶劑沉淀法和無(wú)機(jī)鹽沉淀法提取I.flaccidum中的HOX。首先在經(jīng)過(guò)預(yù)處理的紅藻提取物中加入氯化鋇,使之與硫酸鹽形成硫酸鋇沉淀而析出。隨后在低溫條件下加入預(yù)冷的甲醇溶液使HOX沉淀析出。有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)在于沉淀不用脫鹽,操作較為方便[26]。但操作需要在低溫下進(jìn)行以防止蛋白變性。經(jīng)甲醇沉淀的HOX顯示出較好的穩(wěn)定性,在-10 ℃條件下存放7個(gè)月后還能保留90%的活性。隨后,又采用了硫酸銨分級(jí)沉淀法進(jìn)一步純化HOX。經(jīng)過(guò)以上兩步純化,最終HOX的比酶活力為1 060 U/mg。

3 HOX的酶學(xué)性質(zhì)

不同來(lái)源的HOX性質(zhì)有所不同,如表1所示。I.flaccidum來(lái)源的HOX顯示出不包含黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)的特性,最適反應(yīng)溫度為30 ℃,最適pH為5.0,大于7.5時(shí)逐漸失活[20]。但C.crispus來(lái)源的HOX性質(zhì)還存在爭(zhēng)論,例如是否含有FAD、Cu等[20,22-24,27-33]。

表1 HOX的性質(zhì)Table 1 Properties of hexose oxidase

C.crispus來(lái)源的HOX受到二乙基二硫代氨基甲酸鈉強(qiáng)烈抑制,在10-4mol/L的濃度下就能使其失活。另外,氰化物、羥胺、疊氮化物、乙酸鹽和丙酮酸也能抑制其活性[32]。對(duì)于來(lái)自I.flaccidum的HOX,氯化汞、醋酸鉛、硝酸銀在10-3mol/L的濃度下就能完全抑制其活性。苯甲酸鈉、醋酸鈉也有微弱的抑制作用[20]。

HOX能夠在氧氣存在的條件下將D-葡萄糖和其他幾種己糖氧化成各自的內(nèi)酯,同時(shí)消耗O2生成H2O2。隨后內(nèi)酯自發(fā)水解為相應(yīng)的醛酸。以D-葡萄糖為例,HOX利用分子氧為電子受體,催化D-葡萄糖C-1上的羥基,生成δ-D-葡萄糖酸內(nèi)酯,隨后緩慢水解為D-葡萄糖酸(gluconic acid,GA)[34]。

HOX催化葡萄糖和半乳糖氧化的反應(yīng)如下：

D-葡萄糖+O2→δ-D-葡萄糖酸內(nèi)酯+H2O2

D-半乳糖+O2→γ-D-半乳糖酸內(nèi)酯+H2O2

a-H2O2形成過(guò)程;b-δ-D-葡萄糖酸內(nèi)酯形成過(guò)程圖1 KERSCHENSTEINER推測(cè)的HOX的作用機(jī)制Fig.1 Proposed mechanism of HOX by KERSCHENSTEINER

4 HOX的異源表達(dá)

天然來(lái)源的HOX可從海藻物種中分離提取[20,23-24,27,28,30,35]。但由于藻類中HOX的含量很低,直接提取的生產(chǎn)成本偏高。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,基因的克隆與表達(dá)成為提高HOX產(chǎn)量和活性的重要手段。C.crispus來(lái)源的HOX基因已被克隆,并分別在大腸桿菌(Escherichia.coli)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、畢赤酵母(Pichiapastoris)和多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)中表達(dá)。

WOLFF等[32]從C.crispus中成功分離并測(cè)定了HOX的編碼基因序列,將其克隆至大腸桿菌宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá),最終在SDS-PAGE中觀察到分子質(zhì)量為62 kDa的蛋白質(zhì)條帶,與計(jì)算預(yù)測(cè)的單體HOX分子質(zhì)量一致,但是并未在細(xì)胞中檢測(cè)到HOX活性。結(jié)果表明大腸桿菌表達(dá)出了大量無(wú)酶活性的HOX多肽。

畢赤酵母具有翻譯后加工修飾的能力,用于表達(dá)真核生物來(lái)源的蛋白質(zhì),且分泌蛋白的能力較強(qiáng)。因此HANSEN等[27]嘗試通過(guò)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組HOX，首先將HOX基因克隆至誘導(dǎo)型胞內(nèi)表達(dá)載體pPIC3,并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母KM71菌株進(jìn)行整合表達(dá)，結(jié)果表明重組酶與天然酶的比活性、酶學(xué)性質(zhì)相似。為了提高HOX的表達(dá)水平,WOLFF等[32]通過(guò)紫外誘變重組畢赤酵母表達(dá)菌株,最終產(chǎn)量達(dá)到250 mg/L，同時(shí),為優(yōu)化HOX的分泌,又將來(lái)自釀酒酵母的轉(zhuǎn)化酶和α-交配因子信號(hào)肽序列分別與HOX基因進(jìn)行融合,卻未能在胞外檢測(cè)到酶活性。然而表達(dá)不含有信號(hào)肽序列的重組HOX,卻在培養(yǎng)基中檢測(cè)到活性,即HOX采用不依賴信號(hào)肽的胞外分泌表達(dá)。目前,HOX在酵母菌中的分泌機(jī)制尚未闡明。

另外,STOUGAARD等[36]嘗試采用自主復(fù)制型質(zhì)粒pYES2在釀酒酵母PAP1500菌株中表達(dá),并成功獲得了有活性的HOX。OLEMPSKA等[34]則報(bào)道了在多形漢遜酵母中表達(dá)HOX的方法,構(gòu)建了一個(gè)基于大腸桿菌pBR322質(zhì)粒的整合型表達(dá)載體,并電轉(zhuǎn)化至RB11宿主菌株。隨后對(duì)重組菌株進(jìn)行紫外誘變進(jìn)一步提高了其活性,最終比酶活力達(dá)到100 U/mg。

5 應(yīng)用

HOX具有廣泛的底物特異性,利用糖類物質(zhì)進(jìn)行除氧及抑制好氧菌生長(zhǎng),可作為抗氧化劑、酸化劑、面粉改良劑,在食品、畜牧養(yǎng)殖等方面具有廣泛的應(yīng)用。

5.1 乳制品的酸化劑

HOX能夠氧化包括葡萄糖、半乳糖和果糖在內(nèi)的多種己糖,最后產(chǎn)生的內(nèi)酯自發(fā)水解為相應(yīng)的醛酸,可作為乳制品的酸化劑。在不含葡萄糖或葡萄糖含量非常低的產(chǎn)品中,HOX比GOD使用更為有效、方便,因?yàn)楹笳咧荒芴禺愋匝趸咸烟恰＠缭谌橹破分?大量存在的乳糖和半乳糖則幾乎不會(huì)被GOD氧化。因此GOD只能在含有葡萄糖或同時(shí)加入了乳糖酶的乳制品中使用[37]。即便如此,GOD也只能利用乳糖分解產(chǎn)物的50%作為其底物。相反,HOX對(duì)葡萄糖、半乳糖、乳糖都具有氧化作用。因此HOX是乳制品中有效的酸化劑。

5.2 面粉制品的改良劑

HOX可作為改良劑添加至面粉或面團(tuán)中,以克服面包彈性差、易塌陷等質(zhì)量問(wèn)題。常用的面團(tuán)改良劑分為2類,一類是化學(xué)類氧化劑,如溴酸鉀、抗壞血酸等[38-39],另一類是氧化還原酶,如HOX、GOD、漆酶等[16-40]。一般認(rèn)為,在面團(tuán)中添加氧化劑可增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)共價(jià)鍵的形成,如二硫鍵、谷氨酰賴氨酸交聯(lián)鍵等,從而促進(jìn)面筋蛋白之間形成較好的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu),提高面團(tuán)穩(wěn)定性、強(qiáng)度,增大面團(tuán)體積等[17]。長(zhǎng)期以來(lái)被廣泛使用的溴酸鉀由于具有毒性且易爆已相繼被許多國(guó)家禁用。隨后一些改進(jìn)措施是在面粉或生面團(tuán)中添加GOD。這種氧化還原酶通過(guò)巰基基團(tuán)的氧化交聯(lián),酪氨酸殘基的交聯(lián)或氨基酸殘基之間的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)促進(jìn)多肽鏈之間共價(jià)鍵的形成[16]。但谷物面粉中葡萄糖含量較低,GOD的使用效果并不盡如人意。相反,具有廣泛底物譜的HOX可以催化面團(tuán)中由大量的β-淀粉酶分解淀粉生成的麥芽糖。因此相較GOD,HOX是作為生面團(tuán)改進(jìn)劑的更好選擇。

GüL等[41]研究發(fā)現(xiàn),添加30 mg/kg的HOX能有效地增強(qiáng)面團(tuán)中的面筋網(wǎng)絡(luò),改善面團(tuán)流變性能,同時(shí)產(chǎn)生的H2O2能增大面包體積。POULSEN等[30]通過(guò)對(duì)比分別添加了GOD和HOX的面包發(fā)現(xiàn),與同劑量GOD相比,HOX更有效地提高了面團(tuán)強(qiáng)度和面包體積。并且HOX對(duì)葡萄糖的親和性高于GOD對(duì)葡萄糖。ALMEIDA等[15]在面團(tuán)中添加了3種酶——葡萄糖酯酶、半纖維素酶和HOX,烘焙后沒(méi)有出現(xiàn)常見(jiàn)的面包塌陷、結(jié)皮脫落等現(xiàn)象,獲得了令人滿意的效果。

5.3 食品的降糖護(hù)色劑和保鮮劑

一些含有蛋白質(zhì)和還原糖的食品,特別是烘焙食品,在常溫或加熱的條件下會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng),導(dǎo)致食品過(guò)度褐變、降低食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。這一反應(yīng)造成的影響可以通過(guò)添加HOX將還原糖氧化的方式來(lái)控制。S?E[35]的研究表明,在奶酪或淀粉中添加HOX,顯著減少了烘焙后的食品的褐變面積,提高了食物品質(zhì),有效地預(yù)防或減輕了美拉德反應(yīng)。

此外,HOX可去除食品中殘留的O2,顯著降低氧化作用,同時(shí)能抑制好氧菌生長(zhǎng),實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)產(chǎn)品保鮮期和保質(zhì)期的目的。所以,HOX可改進(jìn)乳酪、黃油、果汁等食品的儲(chǔ)存穩(wěn)定性,可用于替代防腐劑。

5.4 作為新型抑菌劑等應(yīng)用

近年來(lái),伴隨著飼料工業(yè)和酶制劑工業(yè)的快速發(fā)展,一種安全、無(wú)毒、無(wú)副作用的新型飼料添加劑——飼料酶制劑逐漸興起。這種飼料酶制劑的使用能夠強(qiáng)化飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和質(zhì)量穩(wěn)定性、改善動(dòng)物健康狀況和畜產(chǎn)品品質(zhì),對(duì)緩解動(dòng)物飼料資源緊張、保障食品安全及減輕環(huán)境污染等方面具有重要意義[3,42]。

將HOX加入到青貯飼料中,可通過(guò)己糖的氧化反應(yīng)消耗飼料中的O2,建立抑制致病好氧微生物生長(zhǎng)的厭氧環(huán)境[18]。HOX可作為抑菌劑添加至牙膏等牙齒保健品中,其原理與動(dòng)物飼料添加劑相似。HOX還可作為分析試劑確定糖含量,或?qū)⑵浼尤雮鞲衅髦衃18]。

6 總結(jié)

HOX是一種來(lái)源于藻類物種的氧化還原酶,具有安全、無(wú)毒、無(wú)副作用的優(yōu)點(diǎn)?？勺鳛橐环N新型的食品和飼料用酶,添加至面粉、乳制品及動(dòng)物飼料中使用,起到殺菌、抗氧化的效果,對(duì)于改善食品風(fēng)味、保證食品安全、促進(jìn)動(dòng)物健康等起到重要作用。HOX催化效率高、底物范圍廣,是一種潛力很大的生物催化劑。

目前已被發(fā)現(xiàn)的HOX來(lái)源菌種較少,天然物種中含量較低,且不適合大規(guī)模生產(chǎn)。應(yīng)用基因工程技術(shù)已異源表達(dá)HOX,并通過(guò)菌株誘變?cè)谝欢ǔ潭壬咸岣吡嘶钚?但其表達(dá)水平仍較低,未見(jiàn)大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。隨著HOX應(yīng)用特性不斷被開發(fā),應(yīng)進(jìn)一步挖掘不同來(lái)源的HOX,并優(yōu)化異源表達(dá)策略,提高食品級(jí)宿主的表達(dá)水平。此外,解析HOX的晶體結(jié)構(gòu),加強(qiáng)HOX催化特性的研究與改造,擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍將會(huì)是未來(lái)的發(fā)展方向。