馬鈴薯開放組織培養(yǎng)抑菌劑的篩選探究

謝慧芳 楊穎 朱陽陽 陳彩婷 李欣鑫 王翩翩

摘要 向馬鈴薯培養(yǎng)基中添加抑菌劑進(jìn)行開放式組織培養(yǎng)，是降低馬鈴薯脫毒種薯成本、簡化組織培養(yǎng)操作程序、有效控制培養(yǎng)過程中的污染最簡便、有效的方法。加入少量抑菌劑時(shí)，真菌和細(xì)菌污染培養(yǎng)基導(dǎo)致培養(yǎng)失敗;加入過量抑菌劑時(shí)，組培苗矮化或不生長。結(jié)果表明：向1 L培養(yǎng)基中各加入0.01 g鹽酸環(huán)丙沙星和伊曲康唑后，可以有效控制細(xì)菌和真菌的生長，對(duì)馬鈴薯組培苗的生長沒有明顯的抑制作用。

關(guān)鍵詞 馬鈴薯;開放式組織培養(yǎng);抑菌劑

中圖分類號(hào)：S532 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：2095–3305（2021）10–0119–02

1 研究目的

馬鈴薯在種植過程中易受病毒浸染，導(dǎo)致其產(chǎn)量下降。較為理想的解決辦法是通過組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行脫毒處理。但是，組織培養(yǎng)需要專門的儀器設(shè)備，且對(duì)操作技術(shù)的要求較高。因而此方法在常規(guī)種植中推廣率不高[1]。目前，最簡便、有效的方法是向培養(yǎng)基中添加抑菌劑進(jìn)行開放式組織培養(yǎng)。用抑菌劑替代高壓滅菌，在較為開放的環(huán)境中進(jìn)行接種，在保障植物生長的同時(shí)，控制細(xì)菌和真菌的生長，使組織培養(yǎng)成功。

2 研究方法

（1）搜集可以控制細(xì)菌、真菌的不同種類抑菌劑。

（2）利用實(shí)驗(yàn)比較法，篩選出對(duì)MS培養(yǎng)基中自生菌和環(huán)境中對(duì)細(xì)菌、真菌有抑制作用的抑菌劑。

（3）將初選的抑菌劑按不同濃度進(jìn)行組合，并加入到培養(yǎng)基中，找到效果最好的抑菌劑組合及其最低濃度。

（4）將抑菌劑組合按最低濃度到一定濃度分別加到MS培養(yǎng)基中。接入馬鈴薯組培苗，觀察組培苗的生長和污染情況。篩選出既能保證馬鈴薯組培苗正常生長，又能有效抑菌的最佳濃度。

（5）根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果，確定每升培養(yǎng)基中加入抑菌劑的量。

3 實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 抑菌劑的初選

培養(yǎng)基雖營養(yǎng)豐富，能使植物正常生長，但也容易滋生細(xì)菌和真菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。因此需將不同種類的抗細(xì)菌、真菌藥劑加入培養(yǎng)基，使培養(yǎng)取得成功[2]。選用的抗細(xì)菌、真菌藥品目錄分別見表1、表2。

3.2 抑菌劑對(duì)自生菌和環(huán)境的抑菌效果篩選

（1）為觀察不同藥品在同等濃度下的抑菌效果，將不同的抗細(xì)菌藥品都配制成2.5 g/L的水溶液，抗真菌藥品配成1 g/L的水溶液[3]。（2）在沒有經(jīng)過任何消毒滅菌處理的室內(nèi)，向50 mL的MS培養(yǎng)基中分別加入單一的、不等量且攪拌均勻的抑菌劑水溶液，開展培養(yǎng)基自然落菌試驗(yàn)，觀察抑菌劑對(duì)自生菌和環(huán)境的抑菌效果。（3）每個(gè)處理做3次重復(fù)，在空氣中暴露1 h后，封口放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，觀察其生菌狀況（表3）。

在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)：②號(hào)和④號(hào)抑菌劑對(duì)易生長在MS培養(yǎng)基中的細(xì)菌均有較好的抑制作用。其中，向50 mL培養(yǎng)基中加入300 μL及以上的②號(hào)抑菌劑，對(duì)細(xì)菌有一定的控制作用，而④號(hào)抑菌劑加入200μL及以上時(shí)，可以有效控制細(xì)菌的生長。1號(hào)和2號(hào)抑菌劑對(duì)MS培養(yǎng)基中易滋生的真菌均有一定的抑制作用。此外，向50 mL培養(yǎng)基中加入400 μL及以上的1號(hào)抑菌劑，或者500 μL及以上的2號(hào)抑菌劑，都對(duì)真菌生長有一定的抑制作用。

3.3 抑菌劑組合及濃度篩選

為了充分發(fā)揮抑菌劑的抑制作用，控制MS培養(yǎng)中易滋生的細(xì)菌和真菌，將初選出的2種細(xì)菌抑制劑與2種真菌抑制劑按不同濃度兩兩配對(duì)組合，并加入到50 mL的MS培養(yǎng)基中，每個(gè)處理3次重復(fù)，開蓋放在空氣中1 h后，封口培養(yǎng)，觀察其生菌狀況（表4）。

從不同濃度組合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：④抑制細(xì)菌的效果優(yōu)于②號(hào)，1號(hào)控制真菌的效果比2號(hào)好。從培養(yǎng)結(jié)果可以看出向50 mL培養(yǎng)基中加入200 μL④號(hào)和500 μL的1號(hào)抑菌劑后，可以有效控制細(xì)菌和真菌的生長。因此，可以選擇④號(hào)和1號(hào)作為抑菌劑。

3.4 按組培苗的生長情況確定抑菌劑的最佳劑量

首先，將選定的④號(hào)和1號(hào)抑菌劑按不同濃度組合分別加入到MS培養(yǎng)基中。其次，用75%的酒精將接種臺(tái)面和手消毒，接種器具用75%酒精浸泡擦洗后灼燒滅菌。接著，在酒精燈附近將馬鈴薯組培苗切段接種到對(duì)應(yīng)抑菌劑的培養(yǎng)基中并封口[4]。另外，每種組合濃度處理50次重復(fù)，將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。最后，在培養(yǎng)過程中，定期對(duì)培養(yǎng)室進(jìn)行滅菌，及時(shí)清理污染苗，保持一個(gè)相對(duì)干凈的培養(yǎng)環(huán)境（表5）。

從培養(yǎng)結(jié)果看出：當(dāng)1號(hào)抑菌劑加入濃度為8 mL/L時(shí)，真菌污染瓶數(shù)較多;當(dāng)④號(hào)抑菌劑加入濃度為6 mL/L時(shí)，馬鈴薯組培苗與對(duì)照植株相比，株長偏低，當(dāng)濃度進(jìn)一步加大時(shí)，組培苗植株矮化，頂端或部分膨大，顏色變?yōu)樗{(lán)紫色，表現(xiàn)為明顯的生長抑制作用;當(dāng)加入4 mL④號(hào)抑菌劑和10 mL 1號(hào)抑菌劑后，瓶苗的總污染瓶數(shù)和植株生長高度與對(duì)照接近。

4 小結(jié)與討論

加入抑菌劑量少時(shí)，真菌和細(xì)菌污染培養(yǎng)基導(dǎo)致培養(yǎng)失敗;當(dāng)加入過量抑菌劑后，組培苗矮化或不生長，顏色變?yōu)樗{(lán)紫色;當(dāng)向1 L培養(yǎng)基中各加入0.01 g鹽酸環(huán)丙沙星和伊曲康唑后，可以有效控制細(xì)菌和真菌的生長，對(duì)組培苗的生長沒有明顯的抑制作用[5]。

在培養(yǎng)過程中，由于未經(jīng)高壓滅菌，瓊脂加入量應(yīng)比正常加入量要少，否則培養(yǎng)基太硬會(huì)加大接種難度，對(duì)組培苗生長也不利。同時(shí)，如果瓶苗被細(xì)菌和真菌污染，須進(jìn)行高壓滅菌后再清洗培養(yǎng)瓶。此外，長期利用抑菌劑控制細(xì)菌和真菌，是否會(huì)對(duì)組培苗后期培養(yǎng)產(chǎn)生影響，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1] 張慎，郭陶然，鄧志瑞，等.植物開放式組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（26）：14281-14283，14288.

[2] 崔剛，單文修，秦旭，等.植物開放式組織培養(yǎng)研究初探[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，35（4）：529-533.

[3] 張薪薪，唐金花，王關(guān)林.抑菌劑在開放組培中的使用及效果研究[J].遼寧師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005（4）：466-469.

[4] 王春.醫(yī)用抗生素在馬鈴薯組織培養(yǎng)中的抑菌效應(yīng)研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技，2004 （10）：15-16.

[5] 閻志紅，劉文革，趙勝杰，等.青霉素和乳酸對(duì)西瓜組織培養(yǎng)中細(xì)菌污染的抑制作用[J]. 長江蔬菜，2009（18）：21-23.

責(zé)任編輯：黃艷飛

Screening of Bacteriostatic Agent in Potato Open Tissue Culture

XIE Hui-fang et al（Ningxia Vocational and Technical College of Wine and Desertification Prevention and Control， Yinchuan， Ningxia 750000）

Abstract Adding bacteriostatic agent to potato culture medium for open tissue culture is the simplest and most effective method to reduce the cost of virus-free seed potato， simplify the operation procedure of tissue culture， and effectively control the contamination in the culture process. When the dose of inhibition was low， the culture failed due to fungi and bacteria contamination. When excessive bacteriostatic agent is added， tissue culture seedlings dwarf or do not grow. The resurts showed that： adding 0.01 g ciprofloxacin hydrochloride and itraconazole into 1 L medium could effectively control the growth of bacteria and fungi， and had no obvious inhibition on the growth of potato tissue culture seedlings.

Key words The potato; Open tissue culture; Bacteriostatic agent