補(bǔ)腎化痰方對(duì)腎虛模型裸鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的影響

王俊濤，李偉明，王祥麒

河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

目前，乳腺癌已成為我國女性發(fā)病率和致死率第一位的惡性腫瘤，約70%的乳腺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移［1－2］。骨轉(zhuǎn)移易引起重度疼痛、病理性骨折、脊髓壓迫及高鈣血癥等骨相關(guān)事件，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。一旦出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移，疾病即進(jìn)入不可逆階段，5年生存率僅有20%［3］。王祥麒教授基于“種子－土壤”學(xué)說、“腎主骨生髓”理論，結(jié)合骨痛纏綿難愈的癥狀特點(diǎn)，以補(bǔ)腎填精壯骨、化痰散結(jié)止痛為基本原則，使腎氣旺、精血足、骨髓生化有源、骨骼得以榮養(yǎng)，從根本上阻斷乳腺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。本文觀察了補(bǔ)腎化痰方對(duì)腎虛模型裸鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 動(dòng)物30只7～8周齡，體質(zhì)量20～24 g，雌性裸鼠，在SPF級(jí)條件下飼養(yǎng)，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（豫）2010－0002，合格證號(hào)：1000142。

1.2 藥品與試劑補(bǔ)腎化痰方藥物組成：熟地黃30 g，杜仲15 g，懷牛膝15 g，白芥子15 g，生牡蠣30 g，白芍40 g，姜黃15 g，蘇木30 g，當(dāng)歸15 g，川芎15 g，均購自河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院。熒光標(biāo)記的人乳腺癌骨高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株（上海中科院細(xì)胞庫，批號(hào)：MDA－MB－231BO）；醋酸氫化可的松注射液 （北京紫竹藥業(yè)有限公司，批號(hào)：C1420227188）；注射用硫噴妥鈉（上海新亞藥業(yè)有限公司，批號(hào)：P20170507130032644）；鹽酸氯胺酮注射液（西安漢豐藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：C20170724325）；甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（recombinant parathyroid hormone related protein，PTHrP），Abcam公司，貨號(hào)：ab239527；轉(zhuǎn)化生長因子β（recombinant transforming growth factor beta，TGF－β），Abcam公司，貨號(hào)：ab215715；骨唾液酸蛋白（bonesialoprotein，BSP），Abcam公司，貨號(hào)：ab187051。

1.3 儀器動(dòng)物化學(xué)發(fā)光活體成像系統(tǒng)（PerkinElmer公司，型號(hào)：IVIS?Spectrum BL）；顯微鏡（日本奧林巴斯，型號(hào)：IX70）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州宏瑞凈化科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模及分組30只雌性裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及治療組，每組10只。模型組及治療組裸鼠用醋酸氫化可的松注射液（38 mg·kg－1）皮下注射，每天1次，連用8 d，制成腎虛模型［3］。

模型制成3 d后，將兩組裸鼠腹腔注射硫噴妥鈉（37.5 mg·kg－1）和腿部肌肉注射氯胺酮（75 mg·kg－1），麻醉后使用注射器將8×105個(gè)人乳腺癌細(xì)胞株MDA－MB－231BO單細(xì)胞懸液注射入裸鼠左心室，制作骨轉(zhuǎn)移模型［4］。

2.2 給藥方法于心室注射細(xì)胞株48 h后，治療組以補(bǔ)腎化痰方灌胃。將生藥用5倍體積量水浸泡2 h，煮沸30 min，過濾分離藥液及藥渣，藥渣再加入3倍體積量水煎煮20 min，過濾后留藥液，合并兩次藥液于70℃水浴中濃縮至30 mL。治療組裸鼠的灌胃劑量為3.67 g·kg－1，其余兩組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)2周。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

2.3.1 裸鼠體質(zhì)量的檢測(cè) 造模當(dāng)天稱裸鼠體質(zhì)量，造模后每周稱1次體質(zhì)量。

2.3.2 活體顯像 裸鼠用異氟烷和高壓氧氣的混合氣體麻醉，然后放入活體顯像儀中，擺成仰臥位，四肢伸展，固定好后進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)射波長520 nm，激發(fā)波長480 nm，曝光時(shí)間為1 s。圖像處理軟件為IVIS自帶的LivingImage活體圖像分析系統(tǒng)。記錄裸鼠骨轉(zhuǎn)移部位數(shù)，骨轉(zhuǎn)移部位總數(shù)為該組所有裸鼠骨轉(zhuǎn)移部位數(shù)之和。

平均骨轉(zhuǎn)移數(shù)＝（該組所有裸鼠骨轉(zhuǎn)移部位數(shù)之和／10）×100%

2.3.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 完成活體成像后脫頸處死裸鼠，在無菌條件下取骨轉(zhuǎn)移灶，稱瘤質(zhì)量，各組織以4%甲醛溶液保存，固定144 h，編號(hào)，脫鈣15 d。將病變的骨組織標(biāo)本切成橫截面（約為2～3 mm），梯度酒精脫水1次，二甲苯透明，石蠟包埋。切成5μm厚的薄片，溫水平展，平鋪于載玻片，濾紙吸走多余水分，置于45℃的烤箱烤片24 h。按試劑盒要求對(duì)PTHrP、TGF－β、BSP進(jìn)行免疫組化染色，步驟如下：①脫蠟、水化組織切片；②將組織切片進(jìn)行抗原修復(fù)；③用3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶離子水，室溫（28℃）15 min；④PBS沖洗3次，每次3 min；⑤滴加一抗，4℃過夜。PBS沖洗3次，每次3 min；⑥分別滴加抗體，37℃孵育20 min，PBS沖洗3次，每次3 min；⑦DAB溶液顯色，洗脫，轉(zhuǎn)染，脫水固定；⑧使用IPP（Image Pro Plus）醫(yī)學(xué)圖像分析軟件進(jìn)行免疫組化定量分析，測(cè)定棕黃色部位的總面積大小和總吸光度值，兩者之間的比值是表達(dá)部位的平均光密度值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用Excel建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)有關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較先確定樣本是否符合正態(tài)分布，再進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊性，則采用單因素方差分析；方差不齊，先校正方差，再進(jìn)行方差分析。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)取α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 各組裸鼠體質(zhì)量、瘤質(zhì)量、骨轉(zhuǎn)移部位數(shù)比較與造模前比較，對(duì)照組造模后體質(zhì)量顯著增加（P＜0.01），模型組造模后體質(zhì)量明顯降低（P＜0.05），治療組體質(zhì)量無明顯變化（P＞0.05）；與模型組比較，治療組造模后體質(zhì)量明顯升高（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組瘤質(zhì)量顯著增加，骨轉(zhuǎn)移部位數(shù)顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，治療組瘤質(zhì)量明顯減輕，骨轉(zhuǎn)移部位數(shù)明顯減少（P＜0.05）。見表1。

3.2 各組大鼠骨組織中PTHrP、TGF－β、BSP的表達(dá)與對(duì)照組比較，模型組大鼠骨組織中PTHrP、TGF－β、BSP表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，治療組PTHrP、TGF－β、BSP表達(dá)明顯降低（P＜0.5）。見圖1、圖2、圖3，表2。

表1 各組裸鼠體質(zhì)量、瘤質(zhì)量、骨轉(zhuǎn)移部位數(shù)比較 （±s，g）

表1 各組裸鼠體質(zhì)量、瘤質(zhì)量、骨轉(zhuǎn)移部位數(shù)比較 （±s，g）

注：與造模前比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別 n 造模前體質(zhì)量 造模后體質(zhì)量 瘤質(zhì)量 骨轉(zhuǎn)移部位數(shù)／個(gè)對(duì)照組 10 21.58±0.35 22.38±0.29** 2.14±0.35＃＃ 4.00±1.05＃＃模型組 10 21.41±0.28 20.83±0.74* 3.06±0.48 6.10±0.74治療組 10 21.49±0.52 21.41±0.44＃ 2.61±0.42＃ 5.10±0.88＃

圖1 各組大鼠骨組織中PTH rP表達(dá)情況

圖2 各組大鼠骨組織中TGF－β表達(dá)情況

圖3 各組大鼠骨組織中BSP表達(dá)情況

表2 各組大鼠骨組織中PTH rP、TGF－β、BSP的表達(dá) （±s）

表2 各組大鼠骨組織中PTH rP、TGF－β、BSP的表達(dá) （±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

BSP對(duì)照組組別 n PTHrP TGF－β 10 24.82±7.50 27.72±12.73 23.17±8.39模型組 10 78.84±6.44* 74.41±12.91* 76.35±9.42*治療組 10 66.37±8.12＃ 53.92±11.56＃ 64.28±7.94＃

4 討論

乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者疼痛劇烈，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，許多學(xué)者均進(jìn)行了相關(guān)研究［5－9］。有學(xué)者認(rèn)為，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞為骨轉(zhuǎn)移的重要參與者［10］，而何玉峰等［11］則提出人體ER、PR、HER－2表達(dá)與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移具臨床相關(guān)性。從骨轉(zhuǎn)移學(xué)說分析，PTHrP由腫瘤細(xì)胞分泌，為破骨細(xì)胞活性介導(dǎo)因子之一，刺激骨細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞RANKL合成增加，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體分化成熟而具骨吸收活性［12－13］。TGF－β主要由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞合成，其C端存在RGD序列與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞表面的整合素avβ3識(shí)別而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞與骨小梁的黏附，促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移進(jìn)程。此外，BSP可參與信號(hào)的識(shí)別［14－15］，細(xì)胞黏附與轉(zhuǎn)移且其可通過自分泌方式促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，促成乳腺癌的溶骨性轉(zhuǎn)移。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，乳腺癌發(fā)病高峰為“女子七七”之時(shí)，此時(shí)腎精衰竭，加之癌癥日久，復(fù)經(jīng)手術(shù)、放療、化療等，腎精耗傷，無以充髓養(yǎng)骨，以致毒邪趁虛而入，凝結(jié)于骨而成骨轉(zhuǎn)移。中醫(yī)藥治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移當(dāng)攻補(bǔ)兼施，補(bǔ)腎壯骨治其本，化痰散結(jié)治其標(biāo)［16－17］。補(bǔ)腎化痰方中熟地黃有益精填髓、滋陰補(bǔ)血之功，為“滋真陰、填骨髓之圣藥”；杜仲具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功效，能改善乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者腎功能［18］，二者共為君藥。懷牛膝可引血下行、引藥入腎，具有通利肢節(jié)筋脈之效；白芥子有走散宣通、利氣散結(jié)、通行經(jīng)絡(luò)之功，以緩解疼痛；生牡蠣出自《醫(yī)學(xué)心悟》之消瘰丸，功用清熱消痰，軟堅(jiān)散結(jié)；白芍，泄氣行血，酸甘化陰，制諸藥苦辛燥烈之性，且緩骨轉(zhuǎn)移之痛，四者共為臣藥。當(dāng)歸補(bǔ)血活血、祛瘀止痛；川芎活血行氣止痛；姜黃破血行氣、通經(jīng)止痛；蘇木行血破瘀、消腫止痛，共為佐藥。上述藥物合用，共同發(fā)揮補(bǔ)腎化痰、散結(jié)止痛之效［19－20］。

本研究說明，腎虛能導(dǎo)致乳腺癌骨轉(zhuǎn)移加重，而益腎化痰方能降低腎虛所導(dǎo)致的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的程度；乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展過程中可能有PTHrP、TGF－β、BSP的表達(dá)異常，益腎化痰方減輕乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PTHrP、TGF－β、BSP的表達(dá)有關(guān)。