納米孔三代測(cè)序在HIV/AIDS合并肺部感染者快速病原學(xué)鑒定的應(yīng)用價(jià)值探討

鄧浩輝，劉惠媛，高洪波，陳偉烈

目前，二代宏基因組測(cè)序技術(shù)已廣泛用于臨床，能對(duì)樣本的微生物構(gòu)成進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，但其受限于實(shí)驗(yàn)原理，測(cè)序速度相對(duì)較慢。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，納米孔三代測(cè)序(Oxford Nanopore Technologies)相對(duì)于二代測(cè)序?qū)颖静≡瓕W(xué)鑒定具有更快速且能保持準(zhǔn)確性的優(yōu)勢(shì)。目前該技術(shù)對(duì)人類免疫缺陷病毒/獲得性免疫缺陷綜合征(Human Immunodeficiency Virus/Acquired Immunedeficiency Syndrome，HIV/AIDS)合并肺部感染者快速病原學(xué)鑒定的準(zhǔn)確性評(píng)估尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究納入2019年8月-9月在廣州市第八人民醫(yī)院住院治療的2例HIV/AIDS合并肺部感染者，患者A為男性69歲，患者B為男性60歲。2例患者均留取纖維支氣管鏡肺泡灌洗液樣本。患者HIV/AIDS的診斷符合《中國(guó)艾滋病診療指南(2018版)》[1]?；颊叻尾扛腥镜脑\斷符合《中國(guó)成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎診斷和治療指南(2018版)》[2]，臨床標(biāo)本的留取參照 WS/T640-2018臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)本的采集和轉(zhuǎn)運(yùn)的標(biāo)準(zhǔn)。納入研究的2例患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查 本研究2例患者的肺泡灌洗液樣本均進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌和真菌培養(yǎng)，并常規(guī)行結(jié)核DNA(PCR法)和GeneXpert MTB/RIF等方法對(duì)樣本的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)?；颊哐Ｒ?guī)檢測(cè)使用X1000全自動(dòng)血液分析儀(日本Sysmex公司)，血清降鈣素原使用Cobas 801全自動(dòng)電化學(xué)分析儀(瑞典Roche公司)，CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)使用Canto II流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)(美國(guó)BD公司)。

1.3 樣本DNA提取和測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建

1.3.1 纖維支氣管鏡肺泡灌洗液樣本DNA提取 纖維支氣管鏡肺泡灌洗液樣本首先使用液氮研磨進(jìn)行預(yù)處理，使樣本中的微生物充分裂解，處理后的樣本使用Qiamp DNA Mini Kit試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)進(jìn)行樣本總DNA提取，提取后的核酸使用NanoDrop2000核酸檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.3.2 DNA文庫(kù)的構(gòu)建與測(cè)序 本研究相同的樣本均使用納米孔三代測(cè)序和Illumina二代測(cè)序進(jìn)行建庫(kù)，以比較兩種測(cè)序方法的準(zhǔn)確性。納米孔三代測(cè)序DNA文庫(kù)的構(gòu)建使用快速1D建庫(kù)試劑盒SQK-RAD004(英國(guó)Oxford Nanopore Technologies公司)進(jìn)行建庫(kù)。構(gòu)建好的DNA文庫(kù)使用Flow cells R9.4測(cè)序芯片和MinION測(cè)序儀(英國(guó)Oxford Nanopore Technologies公司)進(jìn)行測(cè)序。Illumina二代測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建使用NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina試劑盒(美國(guó)NEB公司)進(jìn)行DNA文庫(kù)的構(gòu)建，構(gòu)建的DNA文庫(kù)使用Illumina Hiseq平臺(tái)(美國(guó)Illumina公司)，PE150模式進(jìn)行測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

1.4.1 原始測(cè)序數(shù)據(jù)的產(chǎn)生和過(guò)濾 納米孔三代測(cè)序MinION測(cè)序儀產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)文件格式為fast5，使用MinKNOW軟件完成實(shí)時(shí)識(shí)別并生成的fastq文件，然后提取不同時(shí)間1、3、6、12、24 h和所有27 h的測(cè)序數(shù)據(jù)，并通過(guò)MinKNOW軟件過(guò)濾低質(zhì)量值序列。Illumina二代測(cè)序的原始數(shù)據(jù)使用FASTX-Toolkits軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾，剔除Q30小于90%和長(zhǎng)度小于35bp的序列，剩余序列進(jìn)行下游數(shù)據(jù)分析。過(guò)濾后數(shù)據(jù)進(jìn)行去宿主DNA操作(使用人基因組參考序列Hg38)，納米孔三代測(cè)序數(shù)據(jù)使用Minimap2軟件及Illumina二代測(cè)序的數(shù)據(jù)使用Bowtie2軟件進(jìn)行去宿主DNA序列。

1.4.2 測(cè)序數(shù)據(jù)多序列比對(duì)和致病微生物的判定經(jīng)數(shù)據(jù)過(guò)濾和去宿主DNA的測(cè)序數(shù)據(jù)使用Centrifuge v1.0.3進(jìn)行與NCBI非冗余核酸數(shù)據(jù)(NT)庫(kù)進(jìn)行多序列比對(duì)。原始的微生物比對(duì)結(jié)果中除病原微生物外，還包括了大量的背景微生物，因此需要設(shè)立致病菌的判定標(biāo)準(zhǔn)：①本研究納入的樣本為纖維支氣管鏡肺泡灌洗液樣本，剔除正常口咽部微生物；②查閱相關(guān)文獻(xiàn)，排除與肺部感染無(wú)關(guān)的微生物；③對(duì)于細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)，物種覆蓋度(CR)水平大于其他微生物10倍以上；對(duì)于真菌，CR大于5倍以上；對(duì)于結(jié)核分枝桿菌，因提取的DNA含量低，故只要檢測(cè)一條序列，即判定為陽(yáng)性[3-4]；④排除細(xì)菌(結(jié)核除外)、真菌、病毒序列數(shù)少于3的微生物[5]。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)檢查結(jié)果 本研究納入2例HIV/AIDS合并肺部感染者，CT檢查均提示雙肺多發(fā)感染，半乳甘露聚糖和1，3-β-D葡聚糖試驗(yàn)均為陰性?；颊逜入院后查白細(xì)胞為7.59×109/L，中性粒細(xì)胞比例為88.2%，降鈣素原0.096 ng/L，CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)264/μL，肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)提示銅綠假單胞菌感染?；颊連入院后查白細(xì)胞為6.47×109/L，中性粒細(xì)胞比例為80.5%，降鈣素原0.130 ng/L，CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)142/μL，肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)提示肺炎克雷伯桿菌和屎腸球菌混合感染，結(jié)核DNA檢測(cè)陽(yáng)性，GeneXpert MTB/RIF檢查提示樣本中結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性。

2.2 樣本測(cè)序的數(shù)據(jù)量 納米孔三代測(cè)序和Illumina二代測(cè)序的原始數(shù)據(jù)量和過(guò)濾后的數(shù)據(jù)量(表1)，患者A和患者B的纖維支氣管鏡肺泡灌洗液樣本對(duì)應(yīng)為樣本A和樣本B。樣本A和樣本B納米孔三代測(cè)序所產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)量分別為10.2 G和11.3 G，平均序列長(zhǎng)度分別為(1.35±0.42)Kb和(1.40±0.5)Kb。樣本A和樣本B的Illumina二代測(cè)序原始數(shù)據(jù)量為8.3 G和8.5 G。納米孔三代測(cè)序不同時(shí)間產(chǎn)生的序列數(shù)和Illumina二代測(cè)序產(chǎn)生的序列數(shù)，表1。

表1 納米孔三代測(cè)序和Illumina二代測(cè)序原始和去宿主后的序列數(shù)(條)

2.3 納米孔三代測(cè)序快速病原學(xué)鑒定結(jié)果分析 本研究中，樣本A纖維支氣管鏡肺泡灌洗液常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)的結(jié)果提示樣本中的致病菌為銅綠假單胞菌，二代測(cè)序的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌的基因序列，納米孔三代測(cè)序僅1 h的測(cè)序結(jié)果已可檢測(cè)出該菌的基因序列；在樣本B中，常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)和病原學(xué)檢查的結(jié)果提示肺炎克雷伯桿菌、屎腸球菌和結(jié)核分枝桿菌混合感染，二代測(cè)序的結(jié)果也提示上述致病菌感染，對(duì)納米孔三代測(cè)序數(shù)據(jù)的分析結(jié)果提示，在測(cè)序1 h后，即可檢測(cè)出肺炎克雷伯桿菌和屎腸球菌基因序列，6 h的測(cè)序結(jié)果可發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌的序列，表2。

表2 納米孔三代測(cè)序和Illumina二代測(cè)序檢測(cè)致病微生物的序列數(shù)(條)

3 討論

對(duì)于感染性疾病，確定病原體的時(shí)間非常重要，建立快速病原鑒定的方法對(duì)合理使用抗感染藥物有重要的指導(dǎo)作用[6]。傳統(tǒng)的細(xì)菌和真菌培養(yǎng)技術(shù)耗時(shí)較長(zhǎng)，且微生物培養(yǎng)的陽(yáng)性率受限于方法學(xué)和抗菌素治療的影響，大部分的細(xì)菌和真菌在常規(guī)的培養(yǎng)條件下難以生長(zhǎng)[7]。目前，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，二代宏基因組測(cè)序(Illumina和IonPGM測(cè)序等平臺(tái))已廣泛應(yīng)用于科研和臨床診療[8]，其結(jié)果可指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，提高臨床療效，改善患者預(yù)后[9]，二代測(cè)序?qū)ξ⑸餀z測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性高，但受限于其實(shí)驗(yàn)原理，獲取結(jié)果需耗時(shí)3 d以上。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，納米孔三代宏基因組測(cè)序能在極短時(shí)間內(nèi)對(duì)樣本中的微生物進(jìn)行快速病原學(xué)鑒定[10-11]，但目前評(píng)估該技術(shù)在HIV/AIDS合并肺部感染者快速病原學(xué)鑒定準(zhǔn)確性的研究未見(jiàn)報(bào)道。

HIV/AIDS患者由于天然免疫，細(xì)胞和體液免疫受損[12-13]，常合并各種機(jī)會(huì)性感染，其中肺部感染是HIV/AIDS患者最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性感染[14]。HIV/AIDS肺部感染常為多種致病菌混合感染[15]，且反復(fù)發(fā)生。嚴(yán)重的肺部感染常合并呼吸衰竭，是HIV/AIDS患者死亡率上升的主要原因，而快速準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷對(duì)治療肺部感染和減少患者死亡率至關(guān)重要。

本研究中，對(duì)2例HIV/AIDS合并肺部感染者纖維支氣管鏡肺泡灌洗液樣本進(jìn)行研究，結(jié)果表明，納米孔三代測(cè)序僅1 h的測(cè)序結(jié)果即可檢測(cè)出樣本致病菌(銅綠假單胞菌，肺炎克雷伯桿菌和屎腸球菌)的基因序列，6 h的測(cè)序結(jié)果已可檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的基因序列，外加樣本處理和DNA文庫(kù)構(gòu)建，生物信息學(xué)分析(約2 h)，僅需8 h即可檢測(cè)出上述樣本致病微生物的組成，且結(jié)果與常規(guī)病原學(xué)檢查和Illumina二代測(cè)序的結(jié)果基本一致，提示納米孔三代測(cè)序能在極短的時(shí)間準(zhǔn)確判斷樣本中的微生物組成。

綜上所述，納米孔三代測(cè)序的快速測(cè)序模式可快速且準(zhǔn)確地了解HIV/AIDS合并肺部感染者肺泡灌洗液的微生物組成，為患者合理使用抗感染藥物提供理論依據(jù)。由于納米孔三代測(cè)序的成本問(wèn)題，本研究?jī)H納入2例患者進(jìn)行研究，仍需納入更多臨床樣本進(jìn)行研究驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。另外，本研究?jī)H對(duì)樣本的DNA進(jìn)行測(cè)序，下一步研究應(yīng)對(duì)樣本的RNA進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)一步評(píng)價(jià)其在病毒宏基因組測(cè)序中的準(zhǔn)確性。