玉米細(xì)菌性枯萎病菌熒光重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

單長(zhǎng)林，周 圓，李孝軍

（舟山海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，浙江 舟山 316021）

【研究意義】玉米細(xì)菌性枯萎病菌（Pantoea stewartiisubsp.stewarii，Pss）是我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性病原物之一，主要分布在美國(guó)、加拿大、墨西哥、巴西、秘魯、意大利、波蘭、羅馬尼亞、馬來(lái)西亞、泰國(guó)、越南以及俄羅斯、烏克蘭等原蘇聯(lián)國(guó)家和地區(qū)［1］。盡管我國(guó)是僅次于美國(guó)的第二大玉米生產(chǎn)國(guó)，但隨著國(guó)內(nèi)玉米需求量的激增，未來(lái)中國(guó)仍需要通過(guò)進(jìn)口來(lái)填補(bǔ)玉米產(chǎn)需缺口，玉米凈進(jìn)口將成為常態(tài)［2］。目前玉米進(jìn)口來(lái)源主要集中在烏克蘭、美國(guó)等玉米細(xì)菌性枯萎病菌發(fā)生國(guó)家［3］。隨著玉米進(jìn)口貿(mào)易的發(fā)展，玉米細(xì)菌性枯萎病菌侵入我國(guó)風(fēng)險(xiǎn)劇增，該病原物在我國(guó)主要玉米產(chǎn)區(qū)均適合定殖，具有廣泛的適生區(qū)域，一旦入侵將嚴(yán)重威脅我國(guó)玉米生產(chǎn)安全［4］。因此，建立并掌握針對(duì)玉米細(xì)菌性枯萎病菌快速檢測(cè)技術(shù)至關(guān)重要。

【前人研究進(jìn)展】目前，針對(duì)玉米細(xì)菌性枯萎病菌的檢測(cè)主要有傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)［5］、血清學(xué)檢測(cè)［6］、分子生物學(xué)檢測(cè)［7-8］和紅外光譜檢測(cè)［9］，這些方法或操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)，或需大型儀器的支持，無(wú)法實(shí)現(xiàn)體外恒溫條件的快速檢測(cè)。與傳統(tǒng)PCR的變性-退火-延伸等熱循環(huán)解鏈原理不同，環(huán)介導(dǎo)基因恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）和重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（recombinase-aided amplification,RAA）均可在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的擴(kuò)增。LAMP技術(shù)［10］在65℃條件下，使用鏈置換型BstDNA聚合酶，利用4～6個(gè)引物，通過(guò)類似于滾環(huán)復(fù)制的鏈替換反應(yīng)產(chǎn)生互補(bǔ)序列，形成大小不一的一系列條帶。LAMP技術(shù)是目前體外恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)病原物主要方法之一，廣泛用于細(xì)菌、真菌、病毒等病原物檢測(cè)［11-15］。封立平等［11］利用LAMP技術(shù)成功建立了針對(duì)Pss的快速檢測(cè)方法，該方法特異、靈敏且結(jié)果可視化。但利用LAMP技術(shù)檢測(cè)Pss所得產(chǎn)物為大小不等的一系列條帶，無(wú)法進(jìn)行克隆、測(cè)序等進(jìn)一步驗(yàn)證。而RAA技術(shù)［16］則利用重組酶，在單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestranded DNA binding,SSB）的幫助下,使模板DNA 解鏈，經(jīng)DNA聚合酶的作用，恒溫條件下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的快速擴(kuò)增，且產(chǎn)物為單一條帶。

【本研究切入點(diǎn)】參與磷酸代謝的pst操縱子和相鄰的glmS基因區(qū)間序列（pstS-glmS序列）在不同菌種間存在明顯差異，可用于Pss菌株鑒定［17-18］。RAA方法具有耗時(shí)短、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，是目前應(yīng)用于細(xì)菌、病毒和支原體等病原微生物恒溫檢測(cè)［19-21］研究的熱門方法之一?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本試驗(yàn)使用熒光重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，以pstS-glmS序列為模板設(shè)計(jì)引物和探針，以建立在恒溫條件下快速檢測(cè)玉米細(xì)菌性枯萎病菌的熒光RAA檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試玉米樣本為烏克蘭進(jìn)境飼用玉米，進(jìn)境口岸為舟山，進(jìn)境時(shí)間為2018—2019年，共計(jì)24個(gè)樣品，每個(gè)樣品2 kg。

供試菌株共計(jì)12株，其中玉米細(xì)菌性枯萎病菌菌株（Pantoea stewartiisubsp.stewarii,Pss）為ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株（編號(hào)ATCC 29229），玉米內(nèi)州萎蔫病菌（Clavibacter michiganensissubsp.nebraskensis,Cmn）為ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株（編號(hào)ATCC 27794），由杭州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心贈(zèng)送；丁香假單胞桿菌番茄致病變種（Pseudomonas syringaepv.syringae,Pssy）、磚紅色微桿菌（Microbacterium testaceum,Mt）、密執(zhí)安棍狀桿菌詭譎亞種（Clavibacter michiganensissubsp.insidiosus,Cmi）、密執(zhí)安棍狀桿菌密執(zhí)安（Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis,Cmm）為本實(shí)驗(yàn)室保存；成團(tuán)泛 菌（Pantoea agglomeran,Pag）、菠蘿泛菌（Pantoea ananatis,Pan）、分散泛菌（Pantoea dispersa,Pd）、伯克霍爾德氏菌（Burkholderia andropogonis,Ba）、玉米迪克氏菌（Dickeya zeae,Dz）、歐氏桿菌（Erwinia chrysanthemivar.zea,Ecz），購(gòu)自北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司。

主要試劑：熒光 RAA 試劑盒（S002ZC）購(gòu)自杭州眾測(cè)生物技術(shù)有限公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（9763）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，新型植物基因組DNA提取試劑盒（DP320）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，2×TaqPCR StarMix with Loading Dye（A012）購(gòu)自GenStar-康潤(rùn)生物。主要儀器：熒光定量PCR儀（ABI 7500）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)菌菌株準(zhǔn)備、基因組提取 在NA平板劃線，28 ℃培養(yǎng)48 h，接種環(huán)刮板收集菌株。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組，用微量分光光度計(jì)（Nanodrop 2000）驗(yàn)證提取效果。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2目標(biāo)片段獲取、引物探針設(shè)計(jì) 以Pss全基因組序列（Gen Bank登錄號(hào)：CP 017581）為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增pstS-glmS靶標(biāo)序列引物pss3/pss4，分別對(duì)應(yīng)基因組444415 nt和444914 nt，擴(kuò)增靶標(biāo)序列。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：2×TaqPCR StarMix with Loading Dye 25 μL，pss3/pss4 （10 μmol/L）各 2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳割膠回收，進(jìn)行克隆測(cè)序。

以測(cè)序獲取序列片段（圖1）為模板，按照RAA引物、探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)正向引物F1、F2、F3、F4、反向引物R1、R2、R3和探針P，BLAST分析驗(yàn)證引物、探針特異性。以上引物、探針序列信息見表1、圖1。本試驗(yàn)?zāi)康男蛄锌寺y(cè)序，引物、探針的合成均由生物工程技術(shù)（上海）有限公司完成。

表1 實(shí)驗(yàn)用引物和探針Table 1 Primers and probe sequences used in this experiment

1.2.3引物篩選與體系建立 采用商品化熒光RAA試劑盒，并利用熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光RAA實(shí)驗(yàn)。按照方法1.2.1 提取Pss DNA（280 ng/μL），以無(wú)菌ddH2O進(jìn)行10倍等梯度稀釋，梯度濃度分別為280、28、2.8、2.8×10-1、2.8×10-2、2.8×10-3、2.8×10-4、2.8×10-5ng/μL。以不同濃度的Pss DNA為模板，選取F1/R1引物組合，初步探索熒光RAA最低檢測(cè)濃度。

以Pss最低檢測(cè)濃度DNA為模板，分別探索不同引物組合F1/R1、F1/R2、F1/R3、F2/R1、F2/R2、F2/R3、F3/R1、F3/R2、F3/R3、F4/R1、F4/R2、F4/R3對(duì)Pss的熒光RAA檢測(cè)效果，篩選出擴(kuò)增效率最高的引物組合。反應(yīng)體系采用試劑盒說(shuō)明書推薦體系（50 μL）：A Buffer 40.9 μL，B Buffer 2.5 μL，上游引物和下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，熒光探針（10 μmol/L）0.6 μL，DNA模板2.0 μL；擴(kuò)增程序?yàn)?9 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.4靈敏度測(cè)定及特異性驗(yàn)證 參照1.2.3試驗(yàn)結(jié)果，合理選取不同濃度的Pss DNA樣本，并利用篩選出的最佳引物組合，測(cè)定建立熒光RAA檢測(cè)方法的靈敏度。

熒光RAA特異性檢測(cè)分別以3株泛菌屬其他菌株（Pan、Pag、Pd）及8株病原細(xì)菌（Cmn、Pssy、Mt、Cmi、Cmm、Ba、Dz、Ecz）DNA為 參考模板進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.5熒光RAA檢測(cè)玉米樣本的應(yīng)用 將1.2.1收集的菌體，用無(wú)菌 ddH2O制備菌懸液，采用涂板法測(cè)定菌懸液濃度（3.5×103CFU/mL）。選取鑒定結(jié)果為陰性的進(jìn)境飼用玉米（實(shí)驗(yàn)室編號(hào)1-3103304），磨成粉末狀，每份10 g，共6份，分別加入濃度為3.5×103CFU/mL的Pss菌液，攪拌混勻，制備陽(yáng)性模擬玉米樣本。利用新型植物基因組DNA提取試劑盒提取模擬樣本與真實(shí)玉米樣本DNA，進(jìn)行熒光RAA檢測(cè)。同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn) SN/T 1375-2004：玉米細(xì)菌性枯萎病菌檢疫鑒定方法復(fù)核驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物和探針序列分析

利用BLAST與全數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)，分析實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的引物，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所有引物組合，包 括pss3/pss4、F1/R1、F1/R2、F1/R3、F2/R1、F2/R2、F2/R3、F3/R1、F3/R2、F3/R3、F4/R1、F4/R2、F4/R3對(duì)Pss菌株DC283（登錄號(hào)：CP017581）、ZJ-FGZX1（登錄號(hào)：CP049115）的識(shí)別率和覆蓋率均為100%，對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)其他序列沒有明顯識(shí)別現(xiàn)象；探針P對(duì)Pss菌株DC283（登錄號(hào)：CP017581）、菌株ICMP275pstS-glmS序列（登錄號(hào)：AB894430）的識(shí)別率為100%，菌株ZJFGZX1（登錄號(hào)：CP049115）識(shí)別率為97.87%，對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)其他序列無(wú)識(shí)別現(xiàn)象。

2.2 引物篩選與體系建立

以Pss梯度稀釋DNA為模板，探索引物組合F1/R1的熒光RAA最低檢測(cè)濃度，結(jié)果見圖2A。濃度為2.8、2.8×10-1、2.8×10-2、2.8×10-3ng/μL的DNA模板進(jìn)行熒光RAA檢測(cè)，均具有明顯的擴(kuò)增曲線，濃度為2.8×10-4ng/μL的DNA則沒有典型的擴(kuò)增曲線。故引物組合F1/R1的熒光RAA最低檢測(cè)濃度為2.8×10-3ng/μL。本實(shí)驗(yàn)以2.8×10-3ng/μL DNA為模板進(jìn)行不同引物組合擴(kuò)增效果實(shí)驗(yàn)。

圖3A、B、C顯示的是以2.8×10-3ng/μL DNA為模板，反向引物R1、R2、R3分別與正向引物F1、F2、F3、F4組合的熒光RAA擴(kuò)增曲線。結(jié)果顯示，每種組合均能收集到擴(kuò)增曲線，但引物組合F1/R2與F4/R2在相同反應(yīng)循環(huán)數(shù)下，相對(duì)熒光強(qiáng)度均高于其他引物組合，擴(kuò)增效率明顯高于其他引物組合。不同引物組合熒光RAA 經(jīng)40個(gè)循環(huán)收集到的相對(duì)熒光強(qiáng)度（?Rn）大小依次 為F1/R2＞ F4/R2＞ 250 000＞F1R1/＞ F4/R1＞150 000＞ F3/R1＞ F2/R1＞F3/R2＞100 000＞ F2/R2 ＞F1/R3＞ F4/R3＞50 000＞ F3/R3＞ F2/R3。比較引物組合F1/R2和F4/R2，在38個(gè)循環(huán)前引物組合擴(kuò)增效率F4/R2＞ F1/R2，但在38個(gè)循環(huán)后F1/R2擴(kuò)增效率明顯高于F4/R2。經(jīng)多次重復(fù)，最終選定引物組合F1/R2為玉米細(xì)菌性枯萎病菌熒光RAA檢測(cè)最佳引物組合。

2.3 靈敏性及特異性測(cè)定

參照2.2中引物組合 F1/R1的熒光RAA最低檢測(cè)濃度為2.8×10-3ng/μL（圖2A），本實(shí)驗(yàn)選取濃度為2.8×10-2、2.8×10-3、2.8×10-4及2.8×10-5ng/μL的玉米細(xì)菌性枯萎病菌DNA樣本，進(jìn)行引物組合F1/R2熒光RAA靈敏度測(cè)定，結(jié)果見圖2B。濃度為2.8×10-2、2.8×10-3和2.8×10-4ng/μL的樣本均呈現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線，濃度為2.8×10-5ng/μL的樣本無(wú)明顯擴(kuò)增現(xiàn)象。因此，以引物組合F1/R2建立的熒光RAA檢測(cè)方法的靈敏度為2.8×10-4ng/μL（280 fg/μL），比引物F1/R1組合的熒光RAA靈敏度提高10倍。

特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)選取3株泛菌屬其他菌株及8株病原細(xì)菌DNA為參考模板，以不同濃度的Pss DNA（編 號(hào)Pss-1：280 ng/μL；Pss-2：2.8×10-4ng/μL）為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌ddH2O為陰性對(duì)照，驗(yàn)證建立的熒光RAA檢測(cè)體系的特異性，結(jié)果見圖4，玉米細(xì)菌性枯萎病菌DNA樣品Pss-1、Pss-2均具有明顯擴(kuò)增曲線，包括3株泛菌屬Pag、Pan、Pd基因組在內(nèi)的其他11株參照DNA模板均沒有擴(kuò)增現(xiàn)象，表明以引物F1/R2和探針P組合的熒光RAA檢測(cè)體系可以特異檢出Pss。

2.4 模擬樣本及真實(shí)樣品檢測(cè)效果

利用新型植物DNA提取試劑盒，提取進(jìn)境玉米樣本和模擬玉米樣本DNA。使用建立的熒光RAA檢測(cè)方法和SN/T 1375-2004標(biāo)準(zhǔn)方法同時(shí)進(jìn)行Pss檢測(cè)，結(jié)果利用熒光RAA檢測(cè)方法檢出6份模擬玉米樣本，未檢出24份真實(shí)玉米樣本，檢測(cè)結(jié)果與SN/T 1375-2004方法一致，準(zhǔn)確率100%。證實(shí)新建立的熒光RAA檢測(cè)方法可針對(duì)玉米種子樣本進(jìn)行玉米細(xì)菌性枯萎病菌的檢測(cè)。

3 討論

RAA技術(shù)具有靈敏、特異、簡(jiǎn)便和快速的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)常溫下對(duì)目的序列的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。目前針對(duì)RAA引物、探針設(shè)計(jì)，主要要求引物長(zhǎng)度在30～35 nt之間，序列中無(wú)回文結(jié)構(gòu)、連續(xù)單堿基重復(fù)序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)，暫無(wú)針對(duì)引物與重組酶蛋白結(jié)合方面的設(shè)計(jì)要求。本實(shí)驗(yàn)中以玉米細(xì)菌性枯萎病菌pstS-glmS特異性序列為模板，設(shè)計(jì)4條正向引物和3條反向引物，盡管12組引物對(duì)都能實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，但分析熒光RAA經(jīng)40個(gè)循環(huán)收集的相對(duì)熒光強(qiáng)度（?Rn），擴(kuò)增效率差異很大。同一反向引物中，與正向引物F1、F4組合擴(kuò)增效率明顯高于與引物F2、F3組合擴(kuò)增效率；與F1、F4組合的反向引物R1、R2、R3中，R2組合擴(kuò)增效率明顯高于R1、R3。究其原因，應(yīng)是引物與重組酶蛋白結(jié)合效率存在差異，正向引物F1、F4與重組酶蛋白結(jié)合效率比F2、F3高，反向引物R2與重組酶蛋白結(jié)合效率比R1、R3高。因此，有必要進(jìn)一步研究RAA中引物與重組酶蛋白之間的結(jié)合機(jī)制，以期指導(dǎo)引物的設(shè)計(jì)，提高效率。

分子生物學(xué)檢測(cè)是目前實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行植物病原菌檢測(cè)的重要手段，而靶標(biāo)序列的選擇則是實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)的關(guān)鍵所在。目前針對(duì)玉米細(xì)菌性枯萎病菌進(jìn)行的分子生物學(xué)檢測(cè)，選取的靶標(biāo)序列主要有16S-23S序列、16S序列［7］、cpsD基因序列［8］和pstS-glmS序列［18］。依據(jù)16S-23S序列篩選特異性引物制定的標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3756-2013：玉米細(xì)菌性枯萎病菌檢疫鑒定方法PCR方法，因已被證實(shí)引物序列無(wú)法區(qū)分Pss和Pantoea stewartiisubsp.indologenes（Psi），于2019年12月31日廢止（海關(guān)總署公告2019年第231號(hào)）。王贏等［7］利用16S序列成功設(shè)計(jì)了玉米細(xì)菌性枯萎病菌特異性引物Ps2r/Ps3r，并對(duì)部分文獻(xiàn)中設(shè)計(jì)的引物序列進(jìn)行特異性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)包括DEP1/DEP2、CPSL1/CPSL2c在內(nèi)的多對(duì)依靠16S序列和cps基因序列設(shè)計(jì)的引物均無(wú)法區(qū)分Pss和Psi。Gehring 等［17］和Wensing 等［18］通過(guò)序列分析證實(shí)pstS-glmS序列在不同菌種間存在明顯差異，可以區(qū)分Pss和Psi，用于Pss菌株鑒定。本實(shí)驗(yàn)利用pstS-glmS序列為靶標(biāo)序列，設(shè)計(jì)引物和探針，通過(guò)BLAST與全庫(kù)數(shù)據(jù)序列分析和參考菌株特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)引物探針的特異性，成功建立了針對(duì)玉米細(xì)菌性枯萎病菌的熒光RAA檢測(cè)方法。

新建立的以引物F1/R2和熒光探針P為組合的熒光RAA檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了針對(duì)玉米細(xì)菌性枯萎病菌的特異性擴(kuò)增，靈敏度高達(dá)280 fg/μL，與實(shí)時(shí)熒光PCR方法［8］相比，熒光RAA靈敏度有所提升（Tambong等建立的TaqMan實(shí)時(shí)熒光法靈敏度為1 pg），且檢測(cè)可利用小型儀器—熒光測(cè)試儀在恒溫條件下完成反應(yīng)，不需要大型儀器支持；與酶聯(lián)免疫試紙條法檢測(cè)玉米細(xì)菌性枯萎病菌［6］相比，僅需20 min就可完成反應(yīng)，不需要在4 ℃條件下0.9% NaCl過(guò)夜孵育，節(jié)省檢測(cè)時(shí)間；與LAMP技術(shù)用于檢測(cè)玉米細(xì)菌性枯萎病菌［11］相比，因?yàn)槠鋽U(kuò)增產(chǎn)物為單一條帶，而不是大小不等的一系列片段，可用于后續(xù)的克隆、測(cè)序等進(jìn)一步驗(yàn)證，也可實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增情況，為后續(xù)定量研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究針對(duì)玉米細(xì)菌性枯萎病菌特異性pstS-glmS序列片段，參照RAA原理設(shè)計(jì)引物和探針，并通過(guò)引物篩選、特異性驗(yàn)證和靈敏性測(cè)定等實(shí)驗(yàn)，成功建立了玉米細(xì)菌性枯萎病菌熒光RAA檢測(cè)方法。該方法可在20 min內(nèi)，特異性地完成玉米細(xì)菌性枯萎病菌的檢測(cè)，靈敏度高達(dá)280 fg/μL，且通過(guò)了玉米真實(shí)樣本與玉米模擬樣本檢測(cè)驗(yàn)證，為玉米細(xì)菌性枯萎病菌的快速檢測(cè)提供了新的方法選擇。