miR-33b靶向上游轉(zhuǎn)錄因子1基因調(diào)控喉癌細胞的作用機制

倪 紅，周興星，喻慧嶺

0 引 言

喉癌是臨床常見頭頸部惡性腫瘤之一，喉鱗狀細胞癌是喉癌的主要病理類型，既往研究顯示吸煙、飲酒等環(huán)境因素與喉癌發(fā)病密切相關(guān)[1-2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種非編碼小RNA，并可通過調(diào)控下游靶基因表達從而參與多種生理病理過程[3]。部分miRNA在喉癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌或促癌作用[4]。但仍有部分miRNA在喉癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中的調(diào)控機制尚未闡明。微小RNA-33b(microRNA-33b，miR-33b)在骨肉瘤細胞中呈低表達，上調(diào)其表達可通過靶向乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A，LDHA)而抑制骨肉瘤細胞增殖[5]。miR-33b可通過靶向抑制高遷移率族蛋白A2(high mobility group protein A2，HMGA2)的表達而抑制食管鱗狀細胞癌遷移及侵襲[6]。但miR-33b在喉癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中的作用機制尚未可知。靶基因預測網(wǎng)站Targetscan預測顯示上游轉(zhuǎn)錄因子1(upstream transcription factor 1，USF1)可能是miR-33b的靶基因，USF1在胃癌、宮頸癌等腫瘤中呈高表達并可促進腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[7-8]；但miR-33b是否可通過靶向調(diào)控USF1而參與喉癌發(fā)生發(fā)展過程尚未明確。本研究主要探討miR-33b、USF1在喉癌組織及細胞中的表達，觀察miR-33b過表達、沉默USF1表達后喉癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲能力的變化，分析miR-33b與USF1在喉癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中的靶向調(diào)控作用，為揭示喉癌發(fā)病機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑正常支氣管上皮細胞16HBE與喉癌細胞TR-LCC-1均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)均購自上海玉博生物科技有限公司。甲基噻唑基四唑(MTT)、二 喹 啉 甲 酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒、二甲基亞砜(DMSO)均購自上海晶抗生物工程有限公司；miR-33b模擬物(mimics)及陰性對照(miR-con)、USF1小干擾RNA(si-USF1)、亂序無意義陰性序列(si-con)、miR-33b特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-33b)及陰性對照(anti-miR-con)均購自廣州銳博生物科技有限公司；細胞凋亡試劑盒購自北京博爾邁生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；Matrigel基質(zhì)膠購自北京索萊寶科技有限公司；pcDNA3.1與Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司；熒光素酶報告基因載體購自南京中洪博元生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗人Ki-67、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、B淋巴細胞瘤-2 (Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)抗體均購自美國Santa cruz公司；兔抗人USF1抗體與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

收集2016年5月至2018年6月華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院的43例喉癌組織標本及癌旁組織標本，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及實驗分組16HBE細胞與TR-LCC-1細胞培養(yǎng)于含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，待細胞生長密度達到85%左右時進行傳代。取對數(shù)生長期TR-LCC-1細胞接種于6孔板，待細胞生長融合度達到70%時進行轉(zhuǎn)染，參照Lipofectamine2000試劑說明書進行操作，實驗分組：正常組(常規(guī)培養(yǎng)的TR-LCC-1細胞)、miR-con組(miR-con轉(zhuǎn)染至TR-LCC-1細胞)、miR-33b組(miR-33b mimics轉(zhuǎn)染至TR-LCC-1細胞)、si-con組(si-con轉(zhuǎn)染至TR-LCC-1細胞)、si-USF1組(si-USF1轉(zhuǎn)染至TR-LCC-1細胞)、miR-33b+pcDNA組(miR-33b mimics與pcDNA共轉(zhuǎn)染至TR-LCC-1細胞)、miR-33b+ pcDNA-USF1組(miR-33b mimics與pcDNA-USF1共轉(zhuǎn)染至TR-LCC-1細胞)，轉(zhuǎn)染前1 h將培養(yǎng)液更換為不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h更換為含有FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2qRT-PCR檢測細胞中miR-33b、USF1 mRNA表達水平采用Trizol法提取喉癌組織、癌旁組織及細胞總RNA，應用紫外分光光度計測定RNA質(zhì)量，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作合成cDNA。miR-33b正向引物5′-ATTCTTTCGAACTGTCTTGG-3′，反向引物5′-TCACCTTCGGCTGTCCTGACA-3′；U6正向引物5′-AGTACCAGTCTGTTGCTGG-3′，反向引物5′-TAATAGACCCGGATGTCTGGT-3′′；USF1正向引物5′′-CTACCCTGCCACTCAATCCA-3′，反向引物5′-AGAATTGACCAGTGCCAGGA-3′；β-actin正向引物5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′，反向引物5′-TGATGTCACGCACGATTT-3′，引物均由上海生物工程股份有限公司合成。按照qRT-PCR檢測試劑盒說明書配反應體系，置于ABI 7500實時熒光定量PCR儀檢測，反應條件：95 ℃預變性5 min循環(huán)1次，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)40次。miR-33b以U6為內(nèi)參，USF1以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-33b、USF1 mRNA相對表達量。

1.2.3MTT檢測細胞增殖取對數(shù)生長期喉癌TR-LCC-1細胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基制備細胞懸液，接種于96孔板，每孔5×103個細胞，按照1.2.1實驗分組，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入150 μL DMSO，應用酶標儀檢測各孔在波長為490 nm處的相對吸光度值(A)，計算細胞存活率。每組設置3次重復。

1.2.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡收集各組TR-LCC-1細胞，PBS清洗，加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μLAnnexin V-FITC與5 μL PI，室溫避光孵育10 min，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲細胞侵襲實驗：稀釋Matrigel基質(zhì)膠，Transwell小室底部的上室面加入Matrigel基質(zhì)膠(100 μL/孔)，收集各組轉(zhuǎn)染TR-LCC-1細胞，重懸細胞(2×105/mL)，按照每孔200 μL的密度加入Transwell小室上室，Transwell小室下室加入600 μL含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌，結(jié)晶紫溶液染色15 min，PBS洗滌，顯微鏡下觀察侵襲細胞數(shù)。細胞遷移實驗：Transwell小室上室中無需加入Matrigel基質(zhì)膠，后續(xù)實驗步驟同細胞侵襲實驗，實驗結(jié)束后置于顯微鏡下觀察遷移細胞數(shù)。

1.2.6熒光素酶報告基因檢測 miR-33b靶基因Targetscan預測顯示miR-33b與USF1存在結(jié)合位點，將含有結(jié)合位點與突變位點的片段插入熒光素酶報告基因載體分別構(gòu)建野生型報告質(zhì)粒WT- USF1與突變型報告質(zhì)粒MUT- USF1，將WT- USF1、MUT- USF1分別與miR-con、miR-33b mimics共轉(zhuǎn)染至TR-LCC-1細胞，置于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組熒光素酶活性。

1.2.7Western blot檢測USF1、Ki-67、MMP-2、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達取凍存喉癌組織、癌旁組織以及對數(shù)生長期細胞，加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，將30 μg蛋白樣品與上樣緩沖液充分混勻后點樣，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，反應結(jié)束后轉(zhuǎn)膜、封閉，加入蛋白一抗(USF1 1∶500、Ki-67 1∶800、MMP-2 1∶1000、Bcl-2 1∶5000、Bax 1∶5000、Cleaved caspase-3 1∶1000)，4 ℃孵育24 h，TBST洗膜，加入IgG二抗(1∶5000)，滴加ECL顯影，置于自動凝膠成像系統(tǒng)分析各蛋白條帶。

2 結(jié) 果

2.1 miR-33b和USF1在喉癌組織及喉癌細胞株中的表達與癌旁組織比較，喉癌組織中miR-33b的表達水平顯著降低(P<0.05)，USF1 mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見表1，圖1。與正常支氣管上皮細胞16HBE比較，喉癌細胞TR-LCC-1中miR-33b的表達水平顯著降低(P<0.05)，USF1 mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖1，表2。

表 1 miR-33b和USF1在喉癌患者組織中癌旁組織和喉癌組織中的表達

1:癌旁組織; 2:喉癌組織; 3:16HBE; 4:TR-LCC-1

表 2 miR-33b和USF1在正常支氣管上皮細胞16HBE和喉癌細胞TR-LCC-1的表達

2.2轉(zhuǎn)染miR-33b對喉癌細胞TR-LCC-1增殖、遷移和侵襲的影響qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與miR-con組比較，miR-33b組喉癌TR-LCC-1細胞中miR-33b的表達水平顯著升高(P<0.05)。提示成功上調(diào)喉癌TR-LCC-1細胞中miR-33b的表達。與miR-con組比較，miR-33b組喉癌TR-LCC-1的細胞存活率、細胞遷移數(shù)與細胞侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05)，Ki-67、MMP-2蛋白相對表達量亦顯著降低(P<0.05)，見表3，圖2。

表 3 轉(zhuǎn)染miR-33b對喉癌細胞TR-LCC-1增殖、遷移和侵襲及Ki-67和MMP-2蛋白表達的影響

1:正常組; 2:miR-con組; 3:miR-33b組

2.3轉(zhuǎn)染miR-33b促進喉癌細胞TR-LCC-1凋亡與miR-con組比較，miR-33b組喉癌TR-LCC-1細胞的細胞凋亡率、Bax、Cleaved caspase-3蛋白相對表達量均顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，正常組與miR-con組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3、圖4，表4。

1:正常組; 2:miR-con組; 3:miR-33b組

圖 4 流式細胞術(shù)檢測喉癌細胞TR-LCC-1凋亡率

表 4 轉(zhuǎn)染miR-33b對喉癌細胞TR-LCC-1中Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白及細胞凋亡率的影響

2.4miR-33b靶向調(diào)控USF1表達Targetscan預測顯示miR-33b與 USF1 3′UTR存在靶向序列。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型報告質(zhì)粒WT- USF1的實驗中，miR-33b組熒光素酶活性顯著低于miR-con組(P<0.05)。轉(zhuǎn)染突變型報告質(zhì)粒MUT- USF1的實驗中，miR-33b組與miR-con組熒光素酶活性相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5。

表 5 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果

2.5沉默USF1抑制喉癌細胞TR-LCC-1增殖、遷移、侵襲和誘導細胞凋亡與si-con組比較，si-USF1組喉癌TR-LCC-1細胞中USF1蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，提示成功降低喉癌TR-LCC-1細胞中USF1的表達。見表6。與si-con組比較，si-USF1組喉癌TR-LCC-1細胞的細胞存活率、細胞遷移數(shù)與細胞侵襲數(shù)、Ki-67、MMP-2、Bcl-2蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3蛋白相對表達量均顯著升高(P<0.05)，見表6，圖5、圖6。

表 6 沉默USF1對喉癌細胞TR-LCC-1中增殖、遷移、侵襲及細胞凋亡率的影響

1:正常組; 2:si-con組; 3:si-USF1組

圖 6 流式細胞術(shù)檢測喉癌細胞TR-LCC-1凋亡率

2.6過表達USF1和轉(zhuǎn)染miR-33b對喉癌細胞TR-LCC-1增殖、遷移、侵襲和誘導細胞凋亡的影響結(jié)果顯示，與miR-33b+pcDNA組比較，miR-33b+ pcDNA-USF1組喉癌TR-LCC-1細胞中USF1蛋白相對表達量、細胞存活率、細胞遷移數(shù)與細胞侵襲數(shù)、Ki-67、MMP-2、Bcl-2蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3蛋白相對表達量均顯著降低(P<0.05)，見圖7、圖8，表7。

1:miR-con組; 2:miR-33b組; 3:miR-33b+pcDNA組; 4:miR-33b+pcDNA- USF1組

圖 8 流式細胞術(shù)檢測喉癌細胞TR-LCC-1凋亡率

表 7 過表達USF1部分逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染miR-33b對喉癌細胞TR-LCC-1的抑制作用

3 討 論

miRNA可通過與靶基因的mRNA互補結(jié)合而抑制靶基因表達從而調(diào)控細胞增殖、分化及凋亡等生物學過程，研究表明部分miRNA已成為喉癌病理生理學研究的重點，并有望成為喉癌診斷的生物學標志物，還可能成為喉癌的治療靶點[9-11]。但miR-33b在喉癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制尚未可知，因此本研究主要探討miR-33b在喉癌中的表達狀態(tài)及其對喉癌細胞生物學行為的影響，為喉癌的基因治療提供新靶點。

miR-33b在肝細胞癌組織中呈低表達，miR-33b過表達可能通過負向調(diào)控人類婆羅雙樹樣基因4(SALL4)的表達而抑制肝細胞癌細胞增殖[12]。miR-33b在胰腺癌、肺癌、惡性黑色素瘤等腫瘤中表達水平降低，并可調(diào)控細胞增殖及轉(zhuǎn)移[13-15]。本研究結(jié)果顯示miR-33b在喉癌組織及其細胞中的表達水平顯著降低，miR-33b過表達后喉癌細胞存活率顯著降低，進一步研究發(fā)現(xiàn)Ki-67蛋白表達水平顯著降低。Ki-67在喉癌中呈高表達，Ki-67可反映細胞的增殖程度，其表達量升高與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[16]。提示miR-33b可能通過抑制Ki-67的表達從而抑制喉癌細胞增殖。腫瘤遷移、侵襲與細胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶密切相關(guān)，其中MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，并可通過降解Ⅳ型膠原酶而破壞腫瘤細侵襲屏障從而促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[17]。本研究結(jié)果顯示miR-33b過表達后喉癌細胞的遷移細胞數(shù)與侵襲細胞數(shù)均顯著減少，MMP-2蛋白表達水平顯著降低，提示miR-33b可抑制喉癌細胞遷移及侵襲?？沟蛲龅鞍譈cl-2在喉癌中呈高表達，促凋亡蛋白Bax在喉癌中呈低表達[18]。本研究結(jié)果顯示miR-33b過表達后喉癌細胞的細胞凋亡率顯著升高，Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達水平顯著升高，而Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，提示miR-33b可促進喉癌細胞凋亡。

USF1在黑色素瘤中呈高表達并可促進黑色素瘤細胞侵襲[19]。研究表明USF1可促進增強膠質(zhì)母細胞瘤干細胞增殖[20]。相關(guān)報道指出USF1表達量升高與卵巢癌患者預后不良有關(guān)[21]。本研究結(jié)果顯示USF1在喉癌組織及其細胞中的表達水平明顯升高，進一步研究顯示沉默USF1的表達后，喉癌細胞的細胞存活率顯著降低，遷移與侵襲細胞數(shù)均顯著減少，細胞凋亡率升高，并可促進Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達，抑制Ki-67、MMP-2、Bcl-2蛋白表達。提示沉默USF1可能通過上調(diào)Bax、Cleaved caspase-3的表達及下調(diào)Ki-67、MMP-2、Bcl-2的表達從而抑制喉癌細胞增殖、遷移及侵襲，促進細胞凋亡。本研究通過雙熒光素酶報告實驗與Western blot實驗證實miR-33b靶向結(jié)合USF1并可負向調(diào)控USF1的表達，進一步研究結(jié)果顯示USF1過表達聯(lián)合miR-33b過表達后喉癌細胞增殖、遷移、侵襲能力明顯增強，細胞凋亡率明顯降低，提示miR-33b過表達可通過下調(diào)USF1的表達從而抑制喉癌細胞增殖、遷移及侵襲能力，誘導細胞凋亡。

綜上所述，miR-33b通過靶向USF1對喉癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲行為產(chǎn)生影響，miR-33b可能作為喉癌早期診斷及評估患者預后的腫瘤標志物，有望成為喉癌治療的潛在靶點，可為喉癌治療新途徑提供理論依據(jù)。