AAT基因轉(zhuǎn)化雜交構(gòu)樹葉片組培篩選研究*

謝曉陽(yáng)，魏磊，王偉，景炳年，陳譚星，顏慧萍，曹力凡，常霞，高正龍

(1.河南省生物技術(shù)開發(fā)中心 河南省科學(xué)院天然產(chǎn)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.河南省高新技術(shù)實(shí)業(yè)有限公司，河南 鄭州 450002)

構(gòu)樹(Broussonetiapapyrifera)屬于?？?Moraceae)構(gòu)屬(Broussonetia)多年生喬木，又稱褚桃，是一種具有重要價(jià)值的多功能樹種[1]。構(gòu)樹葉可做蛋白飼料，樹皮是造紙的優(yōu)質(zhì)原料，根、莖、葉、果實(shí)及種子均可入藥[2]。構(gòu)樹具有分布廣和適應(yīng)性強(qiáng)的特性[3-4]，雌雄異株，花期4—5月，果期6—9月。嚴(yán)格異交，其有性繁殖和無(wú)性繁殖迅速，世代周期短，株型多樣，基因組緊湊，易轉(zhuǎn)化，表型性狀和遺傳多樣性豐富[5-6]。

雜交構(gòu)樹(HybridBroussonetiapapyrifera)是中國(guó)科學(xué)院植物研究所沈世華團(tuán)隊(duì)研究出的無(wú)性良種組培苗，其由落葉喬木系構(gòu)樹為父本，小灌木系構(gòu)樹為母本，雜交選育獲得。歷經(jīng)十幾年潛心研究并通過示范驗(yàn)證，是中國(guó)大部分地區(qū)均可種植的優(yōu)質(zhì)樹種。采用現(xiàn)代農(nóng)業(yè)育種技術(shù)，通過太空搭載育種，雜交選育等手段培育出了中科1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)雜交構(gòu)樹，雜交構(gòu)樹101，雜交構(gòu)樹201等樹種。雜交構(gòu)樹具有生長(zhǎng)速度快，當(dāng)年樹高生長(zhǎng)速度可到3～5 m；粗蛋白含量達(dá)到20%以上，飼用價(jià)值高[7]，司炳文等[8]通過在構(gòu)樹青貯飼料中添加糖蜜和酶菌復(fù)合制劑獲得優(yōu)質(zhì)的青貯飼料。由于構(gòu)樹對(duì)生物及非生物脅迫耐受性好以及葉片吸塵吸霾強(qiáng)等特點(diǎn)，李梅如等[9]通過轉(zhuǎn)化高牛毛草中FaDREB1基因在構(gòu)樹中異位表達(dá)，從而提高構(gòu)樹抗逆性的相關(guān)轉(zhuǎn)基因研究。這些工作都是以構(gòu)樹為研究對(duì)象，目前在雜交構(gòu)樹轉(zhuǎn)基因方面的研究很少，本研究首次選取雜交構(gòu)樹為研究對(duì)象進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究，以充分利用雜交構(gòu)樹這種經(jīng)濟(jì)樹種，因其在農(nóng)業(yè)飼料、中醫(yī)藥、造紙行業(yè)、生態(tài)修復(fù)及綠化等方面的自身優(yōu)勢(shì)，使得本研究更具有研究意義和價(jià)值。

目前雜交構(gòu)樹項(xiàng)目作為國(guó)家重點(diǎn)扶貧工程，已在國(guó)內(nèi)很多省份開展試驗(yàn)，河南省蘭考縣作為國(guó)家級(jí)重點(diǎn)試點(diǎn)地區(qū)，已經(jīng)開展了相關(guān)工作，建立了試驗(yàn)區(qū)和組培中心。一直以來(lái)，雜交構(gòu)樹繁育主要是扦插，而組織培養(yǎng)成活率低，使得效率低下[10-11]。本研究通過優(yōu)化組織培養(yǎng)中的消毒方法、愈傷期及壯苗期各項(xiàng)激素施加條件，建立組培篩選體系。

雜交構(gòu)樹作為重要經(jīng)濟(jì)樹種，應(yīng)用廣泛，尤其在生物飼料方面。為了挖掘其遺傳轉(zhuǎn)化方面的潛力和價(jià)值，以及開展相關(guān)工作研究做鋪墊，本文進(jìn)行了相關(guān)研究，研究發(fā)現(xiàn)雜交構(gòu)樹的粗蛋白含量與水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)等谷物相比有一定優(yōu)勢(shì)，但含量并不突出。通過文獻(xiàn)調(diào)研和研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿的粗蛋白含量在植物中最為突出，而蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)作為其中的模式植物，基因組小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，并且已經(jīng)完成測(cè)序，加之生長(zhǎng)周期短，所以是最佳的外源轉(zhuǎn)化基因的選取材料[12]。在外源轉(zhuǎn)化基因選取上，選取調(diào)控蛋白和氨基酸含量的基因天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate Transaminase，AAT)的表達(dá)基因作為目的基因，其在高等植物中廣泛存在，主要參與調(diào)控著植物氮素的代謝。植物對(duì)氮素的吸收主要以吸收氨態(tài)氮(NH4+或NH3)為主，一部分植物還可以吸收硝態(tài)氮(NO3-)。作物種類不同，吸收氨態(tài)氮和硝態(tài)氮的比例不同。氮的運(yùn)輸形式主要是有機(jī)物——氨基酸(主要是天冬氨酸，還有少量丙氨酸、蛋氨酸、緞氨酸)和酰胺(主要是天冬酰胺和谷氨酰胺)，還有少量以硝酸形式向上運(yùn)輸[13]。AAT基因有多種同工酶形式，它們?cè)谥参锏母鱾€(gè)組織都有發(fā)現(xiàn)[14]，通過亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)、線粒體、葉綠體、核糖體和高爾基體中都有存在AAT基因的亞細(xì)胞定位，說(shuō)明不同種的同工酶在植物的新陳代謝中發(fā)揮了不同的作用[15]。有研究表明，控制蛋白質(zhì)和氨基酸含量的QTL與編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的AAT基因有對(duì)應(yīng)的關(guān)系[16]。有研究報(bào)道超量表達(dá)OsAAT1基因的陽(yáng)性植株的種子中的氨基酸總含量比其對(duì)應(yīng)的陰性植株的含量提高了16.1%，蛋白質(zhì)含量提高了22.2%；超量表達(dá)OsAAT2基因的陽(yáng)性植株的種子中的氨基酸總含量比其對(duì)應(yīng)的陰性植株的含量提高了12.0%，蛋白質(zhì)含量提高了21.1%[17]。

本研究克隆目的基因，構(gòu)建表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法[18]將目的載體轉(zhuǎn)入雜交構(gòu)樹組培葉片中，優(yōu)化葉片前期消毒體系、愈傷期激素配比、抑制農(nóng)桿菌的Cef濃度，以及Hyg對(duì)重組植株的篩選濃度。首次建立以雜交構(gòu)樹葉片為研究對(duì)象的遺傳轉(zhuǎn)化組培及篩選方法，并且對(duì)轉(zhuǎn)化蒺藜苜蓿的AAT基因到雜交構(gòu)樹中，從而提高雜交構(gòu)樹的粗蛋白含量的前期轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行了研究，為接下來(lái)雜交構(gòu)樹遺傳轉(zhuǎn)化深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

1.1.1 雜交構(gòu)樹來(lái)源和培養(yǎng)

雜交構(gòu)樹(科構(gòu)101)，取自蘭考中科華構(gòu)生物科技有限公司。葉片組織培養(yǎng)基：MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(100 mL含鹽0.442 g、蔗糖3 g、瓊脂粉0.8 g，pH 5.8)，并與多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合使用。將各培養(yǎng)基分別用1 mol/L KOH或1 mol/L HCl調(diào)至pH 5.8，0.8%固體瓊脂，121 ℃高壓滅菌20 min。光照時(shí)間：16 h光照培養(yǎng)，8 h暗培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度：25 ℃。

1.1.2 遺傳轉(zhuǎn)化材料來(lái)源

蒺藜苜蓿(R108)材料取自中國(guó)農(nóng)科院；表達(dá)載體ps1300，內(nèi)參基因Actin2取自河南大學(xué)植物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀S1000，美國(guó)伯樂；電泳系統(tǒng)MINI-PROTEAN3，美國(guó)伯樂；定量PCR儀Lightcycler 480，美國(guó)ROCHE；電泳儀JY5000，北京君意；高速離心機(jī)PICO 21，美國(guó)熱電；高速冷凍離心機(jī)5804R，德國(guó)艾本德；超低溫冰箱MDF-U5411，日本三洋；精密天平BP310S-OCE，塞多利斯；精密pH計(jì)PHS-3C，上海雷磁；高壓高溫滅菌器LDZF-75L-II，上海申安；金屬加熱器HB-031，上海申能；制冰機(jī)FM50，北京長(zhǎng)流；恒溫振蕩器HZQ-QX，東聯(lián)電子技術(shù)；生化培養(yǎng)箱HPS-250，東聯(lián)電子技術(shù)；智能恒溫振蕩器DZP-102，東聯(lián)電子技術(shù)；紫外可見光分光光度計(jì)T10，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；人工氣候培養(yǎng)箱 RXZ-280B，寧波江南儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 遺傳轉(zhuǎn)化篩選優(yōu)化方法

(1)生物信息學(xué)分析 通過Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中的在線功能進(jìn)行生物信息學(xué)分析；通過NCBI CDD 數(shù)據(jù)庫(kù)(Conserved Domain Databases)，進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的分析。

(2)AAT基因克隆及重組表達(dá)載體構(gòu)建AAT基因序列查詢于Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。通過ps1300表達(dá)載體設(shè)計(jì)引物兩端酶切位點(diǎn)。利用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)具有針對(duì)性的引物。引物為Sense(XbaI)GCTCTAGAATGGCCACCAACATG，Antisense(KpnI)GGGGTACCCTAAACAAGTCCAGCTG。 PCR程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 25 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min；4 ℃保溫。提取蒺藜苜蓿葉片總RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增CDS全長(zhǎng)序列。用雙酶切(XbaI和KpnI)獲得目的片段。將回收產(chǎn)物與同樣酶切的ps1300質(zhì)粒在16 ℃相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)過夜培養(yǎng)長(zhǎng)出的菌落做菌落PCR，將陽(yáng)性菌落搖菌并做質(zhì)粒PCR，雙酶切重組質(zhì)粒進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果。回收雙酶切得到的CDS，測(cè)序證實(shí)重組載體構(gòu)建成功。

(3)目的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌株 采用液氮凍融法[19]將目的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，-80 ℃保存。

(4)農(nóng)桿菌株侵染液制備 搖菌培養(yǎng)農(nóng)桿菌涂抹在添加有50 mg/L卡那霉素(Kan)的YEB培養(yǎng)基上，并挑取單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)中，28～30 ℃震蕩培養(yǎng)。將1 mL過夜培養(yǎng)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)接到添加有50 mg/L Kan，20 mg/L過濾滅菌的乙酰丁香酮(AS)的25 mL LB液體培養(yǎng)基中。檢測(cè)過夜培養(yǎng)的菌液OD600的值。25 ℃，5 000 rpm，15 min集菌，用MS重懸液重懸菌體，使得最終OD600的0.4～0.6。輕柔地加入20 mg/L過濾滅菌的AS混勻，為雜交構(gòu)樹葉片的侵染做準(zhǔn)備。

(5)農(nóng)桿菌侵染雜交構(gòu)樹葉片及共培養(yǎng) 取用壯苗的葉片植株葉片切成0.5 cm×0.5 cm(作為葉片外植體)，接種于20 mL含有農(nóng)桿菌菌懸液，并添加20 mg/L AS的MS培養(yǎng)基中，28 ℃，處理50 min。隨后，將葉片外植體貼敷于無(wú)菌濾紙上，除去大部分液體培養(yǎng)基，移入添加20 mg/L AS的MS固體(0.8% w/v)培養(yǎng)基共培養(yǎng)。24 h后，用含有Cef的無(wú)菌水快速?zèng)_洗外植體，抑制農(nóng)桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)。無(wú)菌濾紙吸掉多余水分備用。

(6)Cef對(duì)農(nóng)桿菌的抑制效果 以0.8% MS的固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入不同濃度的Cef：0、100、200、300、400 mg/L；共5個(gè)水平。將共培養(yǎng)后的植株葉片接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每個(gè)水平10瓶，每瓶4片葉片。光照培養(yǎng)7 d，觀察并記錄Cef對(duì)農(nóng)桿菌的抑制情況。

(7)Hyg對(duì)重組植株的篩選 由于表達(dá)載體帶有Hyg抗性，所以通過Hyg進(jìn)行重組篩選。以0.8% MS的固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加優(yōu)化后的激素濃度配比和Cef濃度，再加入不同濃度的Hyg：0、2.5、5、7.5、10、20 mg/L，共6個(gè)水平。將共培養(yǎng)后的植株葉片接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每個(gè)水平10瓶，每瓶4片葉片。進(jìn)行耐Hyg的重組植株的篩選。觀察并記錄重組植株的生長(zhǎng)情況。

(8)通過RT-PCR對(duì)雜交構(gòu)樹重組植株進(jìn)行測(cè)定 提取雜交構(gòu)樹重組植株葉片以及未轉(zhuǎn)化的雜交構(gòu)樹葉片的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA，以AAT基因?yàn)槟０?，通過Primer 6設(shè)計(jì)RT-PCR引物:Sense:5′-TATAACCGATCAAGCAACC-3′； Antisense:5′-CATTAATCCCAGCCTGAG-3′。

選取Actin2為內(nèi)參基因。Sense:′-CCTCCGTCTTGACCTTGC-3′；Antisense:5′-TCCTGGACCTGCCTCATC-3′。PCR 程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，用以驗(yàn)證雜交構(gòu)樹重組植株。

(9)通過熒光定量PCR對(duì)雜交構(gòu)樹重組植株AAT基因表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定 提取雜交構(gòu)樹重組植株葉片以及未轉(zhuǎn)化的雜交構(gòu)樹葉片的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA，以AAT基因?yàn)槟０?，通過Primer 6設(shè)計(jì)RT-PCR引物:Sense:5′-CTCAAACCATGGCTTACACAAA-3′； Antisense:5′-GACAAGCAAGCAACAGTGAATA-3′。

選取Actin2為內(nèi)參基因。Sense:5′-CCTCCGTCTTGACCTTGC-3′ ；Antisense:5'-TCCTGGACCTGCCTCATC-3′。PCR 程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；4 ℃ 終止反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，用以驗(yàn)證反應(yīng)結(jié)果。

1.3.2 激素配比及消毒優(yōu)化方法

(1)雜交構(gòu)樹試驗(yàn)材料消毒 選取生長(zhǎng)健康，無(wú)病害的雜交構(gòu)樹葉片，預(yù)處理(洗潔精泡洗，自來(lái)水沖洗30 min，75%乙醇消毒20 s，無(wú)菌水沖洗2～3次，濾紙吸干)。然后放入消毒液中消毒，設(shè)置滅菌的雙蒸水(ddH2O)為空白對(duì)照。消毒液分別為： 5% NaClO、0.3% HgCl2、10% H2O2,消毒時(shí)間分別為5、10、15 min。而后用無(wú)菌ddH2O沖洗5～6次，無(wú)菌濾紙吸干，接入0.8% MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每瓶接種4個(gè)，每組做10瓶。光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)7 d，記錄污染率、死亡率、成活率。

(2)愈傷組織及叢苗的誘導(dǎo)和篩選 以0.8% MS的固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入不同濃度的6-BA：1、1.5、2、2.5 mg/L；NAA：0.05、0.1、0.15、0.2 mg/L各4個(gè)水平。將消毒后的植株葉片切成0.5 cm×0.5 cm接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每個(gè)水平10瓶，每瓶4片葉片。在黑暗中放置25 d，觀察并記錄愈傷組織及叢苗的生長(zhǎng)情況。

(3)壯苗培養(yǎng)基的篩選 以0.8% MS的固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入不同濃度的6-BA：1.5、2、2.5 mg/L；NAA：0.1、0.15、0.2 mg/L各3個(gè)水平。將消毒后的植株葉片切成0.5 cm×0.5 cm接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每個(gè)水平10瓶，每瓶4片葉片。光照培養(yǎng)30 d，觀察并記錄壯苗期的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 AAT基因的生物信息學(xué)分析

AAT基因位于蒺藜苜蓿第七條染色體上，表達(dá)分析表明，該基因主要在葉片、根節(jié)、根中表達(dá)，其中根、葉中的表達(dá)較為豐富。作為天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，該基因參與到NH4+代謝通路中，調(diào)控蛋白和氨基酸含量[20]。圖1-A為蛋白功能域，蛋白序列全長(zhǎng)473 aa，黃色區(qū)為天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)區(qū)。圖1-B為基因組序列，CDS全長(zhǎng)1 422 bp，粉色區(qū)域?yàn)榫幋a區(qū)。圖1-C發(fā)現(xiàn)本研究克隆的基因編碼的蛋白是天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶超家族成員，該基因編碼的蛋白具有一個(gè)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶家族保守區(qū)(PRK05764)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶超家族保守結(jié)構(gòu)域(AAT-I superfamily)。圖1-D蒺藜苜蓿中該基因序列與擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻、衣藻科(Chlamydomonas)相比較，同源率高達(dá)85%以上。

圖1 AAT的基因及蛋白分析注：A為蛋白功能域，B為基因組序列，C為保守序列預(yù)測(cè)，D為基因組序列同源對(duì)比。Fig.1 Analysis of AAT

2.2 AAT::ps1300重組載體驗(yàn)證

根據(jù)特異引物擴(kuò)增出1 422 bp目的條帶，構(gòu)建出AAT::ps1300重組載體后，通過XbaI,KpnI雙酶切，以及提質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，并通過測(cè)序得到目的基因CDS。證實(shí)重組載體構(gòu)建成功(圖2)。

圖2 AAT::ps1300重組載體的構(gòu)建Fig.2 Construction of AAT::ps1300 vector

2.3 不同消毒方法之間的對(duì)比

通過不同消毒方法7 d后處理可以看出(表1)，消毒效果最理想的是75%乙醇溶液處理20 s后，再用0.3%的HgCl2處理15 min，除菌率可以達(dá)到71.5%，植株外植體的成活率可以達(dá)到47.3%。

表1 不同消毒方法對(duì)雜交構(gòu)樹葉片消毒效果的比較Tab.1 Comparison of disinfection effects of different disinfection methods on leaves of hybrid B.papyrifera

2.4 愈傷組織及叢苗的誘導(dǎo)和篩選

雜交構(gòu)樹葉片在愈傷組織培養(yǎng)基上黑暗誘導(dǎo)培養(yǎng)25 d后，觀察不同的濃度激素配比中雜交構(gòu)樹葉片的出芽數(shù)和幼苗的生長(zhǎng)情況，見表2。

表2 不同激素配比對(duì)雜交構(gòu)樹葉片愈傷組織及叢苗的誘導(dǎo)和篩選的比較Tab.2 Comparison of induction and screening of callus and cluster seedlings in leaves of hybrid B.papyrifera with different ratio of hormones

從表2中發(fā)現(xiàn)，在愈傷期，細(xì)胞分裂激素6-BA起到主導(dǎo)作用。較之NAA濃度增加，隨著6-BA的濃度增加，雜交構(gòu)樹葉片愈傷期出芽數(shù)增加明顯，而當(dāng)6-BA濃度增加到3 mg/L時(shí)，出芽數(shù)和長(zhǎng)勢(shì)都明顯變差。 從圖3中也直觀看到優(yōu)化后植株愈傷長(zhǎng)勢(shì)好于優(yōu)化前。所以，當(dāng)6-BA濃度為2.5 mg/L，NAA濃度為0.15 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)出芽數(shù)效果最顯著。而當(dāng)6-BA濃度為2.5 mg/L，NAA濃度為0.2 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)愈傷率效果最顯著。

圖3 愈傷期植株注：A為優(yōu)化前，B為優(yōu)化后。Fig.3 Callus plants

2.5 繼代壯苗培養(yǎng)基的篩選

雜交構(gòu)樹叢苗在壯苗培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)30 d后，觀察不同的濃度激素配比中雜交構(gòu)樹叢苗的生長(zhǎng)情況。從表3中發(fā)現(xiàn)，隨著6-BA的濃度增加，會(huì)抑制植株高度增加。 6-BA濃度為1.5 mg/L，NAA濃度為0.2 mg/L時(shí)，植株高度達(dá)到3.8 cm，從圖4也可以看到這個(gè)結(jié)果，在這個(gè)參數(shù)下壯苗效果最明顯。

表3 不同激素比對(duì)雜交構(gòu)樹繼代壯苗的比較Tab.3 Comparison of different ratio of hormones on the subculture robusts seedlings of hybrid B.papyrifera

圖4 壯苗期植株注：A為優(yōu)化前，B為優(yōu)化后。Fig.4 Seedling stage plants

2.6 抗生素Cef對(duì)農(nóng)桿菌的抑制效果對(duì)比

雜交構(gòu)樹葉片在共培養(yǎng)后，接入帶有不同濃度Cef的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，觀察不同濃度的Cef對(duì)農(nóng)桿菌的抑制情況。從圖5中可以看出，300 mg/L的Cef可以顯著抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。

圖5 Cef 對(duì)農(nóng)桿菌的抑制率Fig.5 Inhibition rate of Cef on agrobacterium

2.7 抗生素Hyg對(duì)重組植株的篩選效果對(duì)比

將共培養(yǎng)后植株葉片接入不同濃度Hyg的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察不同濃度的Hyg對(duì)雜交構(gòu)樹重組植株的篩選情況。從圖6中可以看出，Hyg濃度到達(dá)10 mg/L以后就完全抑制幼苗生長(zhǎng)，而在 7.5 mg/L的Hyg處理下植株成活率在5%左右。從圖7中可以直觀看到在通過優(yōu)化Hyg參數(shù)后，植株死亡率明顯上升，能夠有效篩選出重組的植株。

圖6 Hyg 篩選重組植株成活率Fig.6 Survival rate of recombinant plants in Hyg screening

圖7 Hyg篩選重組植株注：A為優(yōu)化前，B為優(yōu)化后。Fig.7 Recombinant plants screened by Hyg

2.8 RT-PCR檢測(cè)雜交構(gòu)樹重組植株

經(jīng)過Hyg 對(duì)雜交構(gòu)樹重組植株的有效篩選后，通過半定量的方法對(duì)篩選出的重組植株進(jìn)行檢測(cè)，圖8中，重組1和重組2是要檢測(cè)的雜交構(gòu)樹重組植株，CK是未轉(zhuǎn)化的對(duì)照株，Actin2為內(nèi)參基因。通過檢測(cè)得出：重組植株里帶有AAT基因，空白對(duì)照里面沒有AAT基因，初步說(shuō)明外源基因AAT轉(zhuǎn)入到雜交構(gòu)樹植株中。

圖8 RT-PCR檢測(cè)重組植株Fig.8 RT-PCR detection of reconstituted plants

2.9 熒光定量PCR對(duì)雜交構(gòu)樹重組植株AAT基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)

通過半定量的方法對(duì)篩選出的重組植株進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證得出外源基因AAT轉(zhuǎn)入到雜交構(gòu)樹植株中。然后本實(shí)驗(yàn)通過熒光定量PCR對(duì)雜交構(gòu)樹重組植株AAT基因表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，較之未轉(zhuǎn)化的CK型，重組1型的植株AAT基因表達(dá)量有2.5倍的顯著提高(圖9)。

圖9 熒光定量PCR檢測(cè)重組植株AAT基因表達(dá)量Fig.9 Fluorescence quantitative PCR was used to detect the AAT gene expression in the recombinant plant

3 結(jié)論與討論

中科院沈世華團(tuán)隊(duì)前期進(jìn)行了雜交構(gòu)樹的選育后，雜交構(gòu)樹的價(jià)值越來(lái)越受到重視。雜交構(gòu)樹選育主要通過扦插，而組培效率低下，其中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)激素是植物外植體培養(yǎng)組織和器官分化的關(guān)鍵因素，調(diào)節(jié)其種類、濃度及組合將導(dǎo)致再生頻率變化[21-22]，所以本研究進(jìn)行了葉片組培的相關(guān)優(yōu)化。

本研究前期優(yōu)化葉片消毒方法，葉片首先通過75%乙醇溶液處理后，再用0.3%的HgCl2處理15 min，通過優(yōu)化除菌率可以達(dá)到71.5%，植株外植體的成活率可以達(dá)到47.3%，比田瑞等[23]報(bào)道過的方法有所提高。而通過NaClO 以及H2O2的消毒方法一樣表現(xiàn)不明顯。在葉片組織培養(yǎng)中愈傷期激素配比優(yōu)化上，通過不同濃度的搭配發(fā)現(xiàn)，6-BA在愈傷期的激素中占主導(dǎo)作用。當(dāng)6-BA濃度為2.5 mg/L，NAA濃度為0.15 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)出芽數(shù)效果最顯著。隨著6-BA濃度提高到3 mg/L，愈傷明顯受到抑制。施和平等[24]報(bào)道了6-BA在3 mg/L以內(nèi)對(duì)黃瓜(Cucumissativus)毛狀根生長(zhǎng)和形態(tài)起到促進(jìn)生長(zhǎng)作用。在壯苗期，6-BA濃度為1.5 mg/L，NAA濃度為0.2 mg/L時(shí)，植株高度達(dá)到3.8 cm，壯苗效果最明顯。

Peng等[25]在構(gòu)樹遺傳轉(zhuǎn)化方面進(jìn)行了研究，Li等[26-27]在構(gòu)樹抗逆方面進(jìn)行了深入研究，而本文研究了外源基因轉(zhuǎn)化雜交構(gòu)樹的可行性。本研究選取雜交構(gòu)樹(科構(gòu)101)為轉(zhuǎn)化目的植株，蒺藜苜蓿(R108)為外源基因取材植株，對(duì)AAT基因進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析。AAT基因位于蒺藜苜蓿第七條染色體上，表達(dá)分析表明，該基因主要在葉片、根節(jié)、根中表達(dá)，其中根、葉中的表達(dá)較為豐富?；蚪M序列與擬南芥、水稻、衣藻科的同源率達(dá)到85%以上。通過克隆基因構(gòu)建了AAT::ps1300重組表達(dá)載體，采用Chen等[19]優(yōu)化的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，利用農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化雜交構(gòu)樹葉片。

本研究在重組植株篩選方面，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化葉片共培養(yǎng)后，300 mg/L的Cef可以顯著抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。由于表達(dá)載體具有抗Hyg的基因，試驗(yàn)中通過不同濃度的Hyg處理，發(fā)現(xiàn)超過10 mg/L的Hyg就會(huì)導(dǎo)致幼苗死亡。而在7.5 mg/L的Hyg處理下，能夠有效控制重組植株的成活率在5%左右，從而提高篩選的效率。在驗(yàn)證重組植株方面，通過RT-PCR驗(yàn)證篩選重組成功的植株，并通過定量PCR發(fā)現(xiàn)重組植株比未轉(zhuǎn)化的野生植株AAT基因表達(dá)量提高2.5倍。

本研究通過整合并優(yōu)化早期報(bào)道的組培及相關(guān)轉(zhuǎn)化方法，首次建立以雜交構(gòu)樹葉片為研究對(duì)象的遺傳轉(zhuǎn)化組培及篩選方法。并對(duì)雜交構(gòu)樹的粗蛋白提高的前期轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行了研究，為接下來(lái)雜交構(gòu)樹遺傳轉(zhuǎn)化深入研究奠定基礎(chǔ)。