載硫化鉍及阿霉素靶向相變型納米粒多模態(tài)顯像及聯(lián)合治療卵巢癌體外實(shí)驗(yàn)

趙佳雯，張 亮，周 頔, 王志剛，楊心怡，文 明*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射科，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科，重慶 400010)

卵巢癌是女性死于生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的主要病因[1]，化學(xué)治療(簡稱化療)仍為臨床常用，但存在嚴(yán)重藥物毒副作用[2]，藥物對腫瘤的低選擇性及腫瘤耐藥性是主要因素[3]。光熱治療(photothermal therapy, PTT)可利用近紅外激光照射產(chǎn)生熱量殺滅腫瘤細(xì)胞，提高藥物對腫瘤組織細(xì)胞的滲透性，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性[4]；但其產(chǎn)熱分布不均可致腫瘤消融不徹底，引起復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[5]。本研究擬制備聚乳酸羥基乙酸共聚物聚乙二醇葉酸[poly(lactic co glycolic acid)-poly(ethylene glycol) -folic acid, PLGA-PEG-FA]包裹硫化鉍(bismuth sulfide, Bi2S3)、阿霉素(doxorubicin hydrochloride, DOX)及全氟己烷(perfluoropentance, PFP)的葉酸靶向相變型納米粒(FBS-PFP-PLGA@DOX)，用于CT/超聲/光聲多模態(tài)顯像及可視化引導(dǎo)下光熱聯(lián)合體外治療卵巢癌。

1 材料與方法

1.1 材料 DOX(美侖生物技術(shù)有限公司)，Bi2S3、PLGA-PEG-FA(西安瑞禧生物科技有限公司)，全氟己烷PFP(Strem Chemicals)，二氯甲烷(CH2Cl2)，異丙醇，聚乙烯醇(PVA，美國Sigma公司)，二甲基亞砜(DMSO，上海Sigma-Vetec公司)。

1.2 儀器 聲振儀(XL2020，美國Heat System)，磁力攪拌器(GL-3250C，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，電子分析天平(XS104，上海精密科學(xué)儀器有限公司)，低溫離心機(jī)(Centrifuge 5804 R，德國Eppendorf)，倒置熒光顯微鏡(IX53，日本Olympus)，激光粒徑及電位測量儀(Zetasizer Nano ZS90，美國Malvern)，紫外分光光度計(jì)(UV2600，日本Shimadzu)，電感耦合等離子質(zhì)譜(inductively coupled plasma massspectrometry, ICP-MS)，透射電鏡(H7500,日本Hitachi)，激光共聚焦顯微鏡(德國Leica)，酶標(biāo)儀(ELX800，美國伯騰)，808 nm激光儀(西安中川光電科技有限公司)，光聲成像儀(Vevo? LAZR，加拿大Visual Sonics公司)；Esaote MyLab 90超聲成像儀，GE 64排螺旋CT。

1.3 制備FBS-PFP-PLGA@DOX納米粒 采用雙乳化法[6]，稱取50 mg PLGA-PEG-FA溶于3 ml CH2Cl2，再加入200 μl Bi2S3及400 μl PFP溶液，充分混勻后加入含10 mg DOX的水溶液200 μl，冰浴避光條件下聲振3 min后加入4% PVA溶液8 ml進(jìn)行二次聲振，再加入2%異丙醇溶液10 ml，以磁力攪拌2 h至有機(jī)溶劑完全揮發(fā)，以雙蒸水洗滌離心2次(10 000 r/min，4℃，5 min)，獲得FBS-PFP-PLGA@DOX。同法分別制備FA-PFP-PLGA及BS-PFP-PLGA@DOX，4℃保存。

1.4 觀察FBS-PFP-PLGA@DOX基本特征 以光鏡及透射電鏡觀察FBS-PFP-PLGA@DOX形態(tài)，以激光儀測量其粒徑及平均電位，紫外分光光度計(jì)和電感耦合等離子質(zhì)譜分別測量DOX和Bi2S3包封率和載藥量。

1.5 細(xì)胞尋靶實(shí)驗(yàn) 選擇對數(shù)期生長的卵巢癌SKOV-3細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔密度接種于共聚焦皿中，孵育24 h。實(shí)驗(yàn)分為靶向組及非靶向組，分別加入100 μl紅色熒光染料DiI標(biāo)記的FBS-PFP-PLGA@DOX及BS-PFP-PLGA@DOX。繼續(xù)孵育3 h后加入10 μl藍(lán)色熒光染料DAPI染色15 min，再以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)洗滌。將共聚焦皿置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.6 體外多模態(tài)顯像

1.6.1 CT 配置不同濃度(0、1、2、3、4、5 mg/ml)FBS-PFP-PLGA@DOX溶液進(jìn)行CT掃描。掃描參數(shù)：管電壓80 kV，管電流170 mA，層厚0.625 mm。采用Horos軟件測量各EP管中溶液CT值。

1.6.2 光聲顯像 將不同濃度(0、1、2、3、4、5 mg/ml)FBS-PFP-PLGA@DOX溶液加入凝膠模型中，置于光聲成像儀上，以一定波長激光輻照各組樣品，采集各組樣品的光聲圖，并利用儀器自帶軟件測量光聲信號強(qiáng)度。

1.6.3 超聲 將FBS-PFP-PLGA@DOX配置為不同濃度(0、1、2、3、4、5 mg/ml)，加入1 ml凝膠模型中，以808 nm近紅外激光(1 W/cm2)輻照5 min后用進(jìn)行超聲掃查，采集FBS-PFP-PLGA@DOX相變前后二維聲像圖及造影模式圖像，以DFY定量分析軟件測量回聲強(qiáng)度變化。

1.7 光熱成像及光致相變實(shí)驗(yàn) ①將FBS-PFP-PLGA@DOX稀釋為不同濃度(0、2、4、6、8、10 mg/ml)加于96孔板內(nèi)，用808 nm近紅外激光(1 W/cm2)輻照5 min并記錄其溫度變化。②光熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，將100 μl的10 mg/ml FBS-PFP-PLGA@DOX加入96孔板，以808 nm近紅外激光輻照5 min后關(guān)閉激光，待溫度降至室溫后再度開啟激光，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，全程記錄溫度變化。③FBS-PFP-PLGA@DOX光致相變實(shí)驗(yàn)，將FBS-PFP-PLGA@DOX稀釋后滴加于載玻片上，放于倒置熒光顯微鏡，開啟激光輻照，記錄其輻照前后變化情況。

1.8 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 選擇處于對數(shù)生長期的SKOV-3細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔密度接種于96孔板內(nèi)，孵育24 h。實(shí)驗(yàn)分為7組：①對照組；②激光輻照組；③FA-PFP-PLGA(100 μl，1 mg/ml)+激光輻照組(808 nm，5 min)；④BS-PFP-PLGA@DOX組(100 μl，1 mg/ml)；⑤BS-PFP-PLGA@DOX(100 μl，1 mg/ml)+激光輻照組(808 nm，5 min)；⑥FBS-PFP-PLGA@DOX(100 μl，1 mg/ml)；⑦FBS-PFP-PLGA@DOX(100 μl，1 mg/ml)+激光輻照組(808 nm，5 min)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加入100 μl細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)溶液后繼續(xù)孵育1 h，以酶標(biāo)儀測量各孔在450 nm波長處的吸光度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)；生存率兩兩比較采用t檢驗(yàn)，兩變量之間關(guān)系采用線性相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FBS-PFP-PLGA@DOX基本性能 制備的FBS-PFP-PLGA@DOX呈球形，透射電鏡可見其具有殼核結(jié)構(gòu)(圖1A)，Bi2S3分布于PLGA外殼上(圖1B)；經(jīng)Malvern激光粒徑儀檢測，平均粒徑為(255.00±90.82)nm(圖1C)，Zeta電位為(-7.07±4.33)mV(圖1D)；紫外分光光度計(jì)測得DOX標(biāo)曲(R2=0.994)，DOX的包封率為(26.77±0.46)%，載藥量為(2.34±0.04)%；ICP-MS測得Bi2S3的包封率為(87.57±0.12)%，載藥量為(3.38±0.01)%。

圖1 FBS-PFP-PLGA@DOX表征 A、B.透射電鏡圖； C.粒徑分布圖； D.Zeta電位圖

2.2 細(xì)胞尋靶實(shí)驗(yàn) 激光共聚焦顯微鏡見DiI標(biāo)記的納米粒呈紅色，DAPI標(biāo)記的SKOV-3細(xì)胞核呈藍(lán)色。靶向組中紅染FBS-PFP-PLGA@DOX特異性結(jié)合于藍(lán)染SKOV-3細(xì)胞周圍；非靶向組未見二者明顯結(jié)合(圖2)。

圖2 激光共聚焦顯微鏡觀察靶向納米粒尋靶能力 A.藍(lán)色熒光染料DAPI標(biāo)記的SKOV-3細(xì)胞； B.紅色熒光染料DiI標(biāo)記的FBS-PFP-PLGA@DOX； C.靶向組納米粒尋靶情況； D.藍(lán)色熒光染料DAPI標(biāo)記SKOV-3細(xì)胞； E.紅色熒光染料DiI標(biāo)記的BS-PFP-PLGA@DOX； F.非靶向組納米粒尋靶情況

2.3 體外多模態(tài)顯像

2.3.1 CT FBS-PFP-PLGA@DOX的CT圖像對比度明顯高于對照組，隨Bi2S3濃度增加，F(xiàn)BS-PFP-PLGA@DOX CT圖像對比度逐漸增高，對應(yīng)CT值呈上升趨勢(圖3A、3E)。

圖3 FBS-PFP-PLGA@DOX聯(lián)合顯像 A.不同濃度FBS-PFP-PLGA@DOX的CT圖(從左到右濃度依次為0、1、2、3、4、5 mg/ml)； B.不同濃度FBS-PFP-PLGA@DOX的光聲圖(從左到右濃度依次為0、1、2、3、4、5 mg/ml)； C.不同濃度FBS-PFP-PLGA@DOX的B-mode超聲聲像圖(從左到右濃度依次為0、1、2、3、4、5 mg/ml)； D.不同濃度FBS-PFP-PLGA@DOX超聲造影圖像(從左到右濃度依次為0、1、2、3、4、5 mg/ml )； E.不同濃度FBS-PFP-PLGA@DOX的CT值； F.不同濃度FBS -PFP-PLGA@DOX的光聲值； G.不同濃度FBS-PFP-PLGA@DOX的B-mode模式超聲回聲強(qiáng)度值； H.不同濃度FBS-PFP-PLGA@DOX超聲造影模式回聲強(qiáng)度值

2.3.2 光聲顯像 FBS-PFP-PLGA@DOX光聲信號強(qiáng)度高于對照組，隨Bi2S3濃度增加，F(xiàn)BS-PFP-PLGA@DOX光聲信號逐漸增強(qiáng)，對應(yīng)光聲值也呈上升趨勢(圖3B、3F)。

2.3.3 超聲 激光輻照后，隨FBS-PFP-PLGA@DOX納米粒濃度增加， B-mode與造影模式下回聲強(qiáng)度均逐漸增加(圖3C、3D、3G、3H)。FBS-PFP-PLGA@DOX超聲回聲強(qiáng)度隨納米粒濃度增高而增加。

2.4 光熱成像及光致相 變 激光照射后，不同濃度FBS-PFP-PLGA@DOX快速升溫，150 s后逐漸趨于穩(wěn)定，且上升速度與納米粒濃度呈正相關(guān)；對照組照射5 min始終未見溫度上升(圖4A)。激光開-關(guān)循環(huán)中，F(xiàn)BS-PFP-PLGA@DOX最高溫度未見明顯下降(圖4B)。

圖4 FBS-PFP-PLGA@DOX光熱成像及光致相變實(shí)驗(yàn) A.不同濃度FBS-PFP-PLGA@DOX激光輻照升溫圖； B.FBS-PFP-PLGA@DOX激光開/關(guān)5個(gè)周期溫度曲線； C.FBS-PFP-PLGA@DOX激光照射前光鏡圖； D.FBS-PFP-PLGA@DOX激光照射后光鏡圖

光致相變實(shí)驗(yàn)中，激光照射前，顯微鏡下FBS-PFP-PLGA@DOX未見明顯變化(圖4C)；激光照射后，F(xiàn)BS-PFP-PLGA@DOX發(fā)生液-氣相變，體積明顯增大(圖4D)。

2.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) FBS-PFP-PLGA@DOX+激光組SKOV-3細(xì)胞生存率最低(12.17%)，F(xiàn)BS-PFP-PLGA@DOX組細(xì)胞生存率(31.57%)較之稍高(t=24.27，P<0.01)；FBS-PFP-PLGA@DOX組細(xì)胞生存率(31.57%)較BS-PFP-PLGA@DOX組(86.03%)低(t=96.04，P<0.01)；FA-PFP-PLGA+激光組與單純激光組細(xì)胞生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.71，P>0.05)。

3 討論

PLGA可通過水解作用分解為可代謝成分并通過檸檬酸循環(huán)從體內(nèi)清除[7]，生物安全性較好[8]。本研究以PLGA為載體制備的納米粒平均粒徑為(255.00±90.82)nm，可利用腫瘤滲透和滯留效應(yīng)穿過血管內(nèi)皮間隙而實(shí)現(xiàn)腫瘤顯像[9]。

將Bi2S3包裹于納米粒中，可用于多模態(tài)顯像。鉍元素具有較強(qiáng)吸收X線能力，可明顯提高CT對比度，同時(shí)具有低毒性、粒徑小、循環(huán)時(shí)間長及表面可修飾等優(yōu)點(diǎn)[10]。光聲效應(yīng)主要基于光吸收質(zhì)將光能轉(zhuǎn)化為熱能。Bi2S3具有強(qiáng)光吸收屬性及高光熱轉(zhuǎn)化效率，可吸收近紅外波段激光能量，對靶區(qū)組織進(jìn)行光聲顯像，是良好的光聲顯像劑[11]。FBS-PFP-PLGA@DOX包裹Bi2S3后，與周圍組織聲阻抗差異增大，在超聲波作用下發(fā)生振動(dòng)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的背向散射信號，可增強(qiáng)超聲顯像效果。激光輻照后，F(xiàn)BS-PFP-PLGA@DOX包裹的PFP升溫至沸點(diǎn)以上，可發(fā)生液氣相變而變?yōu)槲馀荩淖冎車M織聲環(huán)境而增強(qiáng)超聲對比。

隨著聯(lián)合療法問世，光熱聯(lián)合治療腫瘤成為研究熱點(diǎn)[12]。文獻(xiàn)[13]報(bào)道，41～45℃的高溫療法可與化療等傳統(tǒng)療法協(xié)同治療腫瘤。本研究發(fā)現(xiàn)，濃度為8 mg/ml及10 mg/ml的FBS-PFP-PLGA@DOX在短時(shí)間激光照射后迅速升溫至42℃以上并趨于穩(wěn)定；對FBS-PFP-PLGA@DOX進(jìn)行5次重復(fù)激光照射，最高溫度未見明顯下降，表明FBS-PFP-PLGA@DOX有良好的光熱穩(wěn)定性，可在體內(nèi)循環(huán)利用。DOX是常用的抗腫瘤藥物，但其彌散性會對腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞同時(shí)造成傷害。上皮來源腫瘤細(xì)胞可高表達(dá)葉酸受體，而正常組織幾乎不表達(dá)，故葉酸可作為特異靶向腫瘤組織的靶點(diǎn)。葉酸與腫瘤細(xì)胞上葉酸受體特異性結(jié)合，使包裹抗癌藥物的納米粒精準(zhǔn)地大量到達(dá)腫瘤組織，增強(qiáng)抗腫瘤效果[14]。本研究制備的FBS-PFP-PLGA@DOX可通過葉酸-葉酸受體靶向機(jī)制，主動(dòng)靶向高表達(dá)葉酸受體的SKOV-3細(xì)胞；與非靶向組比較，F(xiàn)BS-PFP-PLGA@DOX能更多聚集于腫瘤組織，為多模態(tài)顯像和光熱聯(lián)合化學(xué)治療卵巢癌提供保障。FBS-PFP-PLGA@DOX+激光組SKOV-3細(xì)胞存活率遠(yuǎn)低于無激光組及非靶向組，說明葉酸能特異性與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，且光熱聯(lián)合化學(xué)治療能更大程度地殺傷腫瘤細(xì)胞；而FA-PFP-PLGA+激光組、單純激光組對腫瘤細(xì)胞殺傷能力較弱，提示葉酸靶具備良好生物安全性。

綜上，本研究成功制備了FBS-PFP-PLGA@DOX，能主動(dòng)靶向高表達(dá)葉酸受體的卵巢癌SKOV-3細(xì)胞，具備良好的體外多模態(tài)顯像能力，并有望實(shí)現(xiàn)多種方法協(xié)同增效治療卵巢癌，應(yīng)用前景廣闊。目前對于納米粒在細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步探討。