構(gòu)建腫瘤免疫治療PD-L1靶向PET分子探針68Ga-NOTA-WL12及生物學(xué)觀察

蔣金泉，李 丹，劉特立，夏 雷，徐曉霞，郭曉軼，朱 華*，楊 志

(1.德陽市人民醫(yī)院放射科，四川 德陽 618000；2.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所核醫(yī)學(xué)科，惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100142)

抗程序性細(xì)胞死亡受體1(programmed death 1, PD-1)及其配體(programmed death ligand 1, PD-L1)信號(hào)通路的免疫阻斷治療可明顯提高部分黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、腎癌等多種實(shí)體腫瘤的客觀緩解率[1-9]。腫瘤細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)量與患者能否從抗PD-1/PD-L1信號(hào)通路治療中獲益存在一定相關(guān)性[10-12]，故準(zhǔn)確評(píng)估腫瘤患者體內(nèi)PD-L1表達(dá)具有重要意義。目前臨床主要通過免疫組織化學(xué)[13]方法檢測腫瘤患者PD-L1表達(dá)情況并篩選適應(yīng)證，但受限于PD-L1在腫瘤組織內(nèi)表達(dá)的異質(zhì)性及動(dòng)態(tài)變化性[14-15]等因素，僅約30%經(jīng)此法篩選出的PD-L1表達(dá)陽性腫瘤患者獲益[16]。本研究以雙功能螯合劑NOTA(2-[4,7-bis-(carboxymethyl)-[1,4,7]triazonan-1-yl]acetic acid)對(duì)WL12進(jìn)行耦聯(lián)，以68Ga標(biāo)記，獲得分子探針68Ga-NOTA-WL12，觀察生物分布，評(píng)價(jià)其檢測腫瘤PD-L1能力。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 NOTA-WL12(上海強(qiáng)耀生物科技有限公司)，醋酸鈉、三氟乙酸(中國國藥集團(tuán)有限公司)，乙腈(Merck)，生理鹽水(北京原子高科股份有限公司)，濃鹽酸、乙醇、正辛醇(北京化學(xué)試劑有限公司)，異氟烷(河北一品制藥股份有限公司)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%人血清白蛋白(HSA，成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司)，均為分析純。

1.2 主要儀器 鍺鎵發(fā)生器(Isotope Technologies Garching)，Hypersil BDS C-18反向色譜柱5 μm，250.0 mm×4.6 mm(YMC)，C-18柱(Waters公司)，放射性薄層色譜掃描儀(默克Radio-TLC)，高效液相色譜儀(安捷倫)，放射性測量活度計(jì)(Capintec)，多探頭全自動(dòng)伽瑪計(jì)數(shù)儀(Wiz-ard2)，MatrxVIP 3000小動(dòng)物麻醉系統(tǒng)(Mismark)，小動(dòng)物PET/CT(平生醫(yī)療科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 正常雌性昆明鼠、非肥胖型糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷鼠(NOD/SCID)及BALB/c裸鼠均購自北京維通利華生物科技股份有限公司，6～8周齡,體質(zhì)量18～20 g。遵照北京腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作規(guī)范完成實(shí)驗(yàn)，倫理批準(zhǔn)號(hào)：2019KT62。中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)均來自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。穩(wěn)定高表達(dá)人PD-L1的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO-hPD-L1)及小鼠模型來源于本實(shí)驗(yàn)室。

1.468Ga-NOTA-WL12制備及純化 將4 ml 0.05 mol/L HCl緩慢推注至鍺鎵發(fā)生器，量取 3 000 μl68Ga淋洗液至EP管中，以1.0 mol/L NaAc將pH調(diào)至4.5，隨后加入10 μl濃度為2 mg/ml的NOTA-WL12于上述EP管中，將反應(yīng)體系置于孵育器60℃條件下反應(yīng)15 min。待體系溫度降至室溫后，以2 ml注射器取出反應(yīng)體系，加至已活化的C-18柱，用3 ml超純水淋洗柱子，最后用0.7 ml 80%乙醇淋洗C-18柱，獲得純化后的標(biāo)記產(chǎn)物68Ga-NOTA-WL12。

1.568Ga-NOTA-WL12質(zhì)控 將反應(yīng)后產(chǎn)物及純化后產(chǎn)物各2 μl滴至TLC-SG試紙(寬度為1)下端1 cm處，并將試紙置于展開體系[1 ml生理鹽水加20 μl飽和乙二胺四乙酸(EDTA)]中，待體系展開至距下端10 cm處時(shí)將其取出并晾干，行Radio-TLC掃描分析，并計(jì)算保留值。

采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)，Hypersil BDS C-18反向色譜柱(5 μm，250.0 mm×4.6 mm)，溫度25℃，以體積分?jǐn)?shù)0.1%的三氟乙酸水溶液為A相，體積分?jǐn)?shù)0.1%的三氟乙酸乙腈溶液為B相，針對(duì)梯度流動(dòng)相進(jìn)行分析，使10～15 min B相由5%增加至80%、流速1.0 ml/min，觀察放射性峰保留時(shí)間。

1.6 體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取3.7 MBq68Ga-NOTA-WL12分子探針溶液，分別加至1 ml生理鹽水和5% HSA溶液中，置于37℃條件下孵育，分別于10、30、60、120及240 min 后取200 μl標(biāo)記產(chǎn)物，行Radio-HPLC分析。

1.7 脂水分布 取50 ml 0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液和50 ml正辛醇，混合均勻后靜置24 h；以5個(gè)2.5 ml EP管分別取1.0 ml飽和后上層正辛醇和0.9 ml下層磷酸緩沖鹽溶液，再加入0.1 ml含0.74 MBq68Ga-NOTA-WL12 的0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液，振蕩混勻后3 000 r/min離心5 min，最后分別取100 μl上層正辛醇和下層磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行計(jì)數(shù)，以logP±SD表示脂水分布值。

1.8 生物分布 將15只體質(zhì)量18～20 g雌性昆明小鼠隨機(jī)分為5組，經(jīng)尾靜脈注射1.85 MBq68Ga-NOTA-WL12，分別于注射后15、30、60、120、240 min處死，解剖獲得小鼠血、肺、心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肌肉、股骨及腦組織，分別稱重并進(jìn)行γ計(jì)數(shù)。以注射劑量的1%為標(biāo)準(zhǔn)樣本，同時(shí)計(jì)數(shù)，通過Excel和Prism8.0軟件計(jì)算各臟器每克組織百分注射劑量率(%ID/g)。

1.9 小動(dòng)物PET/CT顯像 對(duì)PD-L1表達(dá)陽性的CHO-hPD-L1小鼠模型及陰性對(duì)照組人乳腺癌MDA-MB-231小鼠動(dòng)物模型各3只(瘤體直徑約1.0 cm)行PET/CT顯像。經(jīng)尾靜脈注射約7.4 MBq68Ga-NOTA-WL12,分別于30、60、120 min進(jìn)行PET顯像，顯像時(shí)間為15 min。行阻斷實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證所得分子探針檢測腫瘤PD-L1的特異性，對(duì)CHO-hPD-L1小鼠經(jīng)尾靜脈同時(shí)注射7.4 MBq68Ga-NOTA-WL12和50 μg未標(biāo)記的WL12，分別于60、120 min進(jìn)行顯像，觀察分子探針在腫瘤病灶內(nèi)的攝取情況，測定并比較各時(shí)間點(diǎn)腫瘤病灶及肌肉標(biāo)準(zhǔn)攝取值(standardized uptake value, SUV)。

2 結(jié)果

2.168Ga-NOTA-WL12標(biāo)記率及放射化學(xué)純度 整個(gè)標(biāo)記及純化過程可于30 min內(nèi)完成。對(duì)純化前反應(yīng)體系行Radio-TLC分析，得到68Ga對(duì)NOTA-WL12放射標(biāo)記率為(98.68±0.06)%(n=3)；對(duì)純化后產(chǎn)物68Ga-NOTA-WL12分別行Radio-TLC和Radio-HPLC分析，結(jié)果顯示純化后標(biāo)記化合物68Ga-NOTA-WL12放射化學(xué)純度>99%，見圖1。68Ga-NOTA-WL12終產(chǎn)物為無色透明溶液,pH 4.0～4.5。Radio-HPLC分析顯示目標(biāo)化合物68Ga-NOTA-WL12的保留時(shí)間為10.38 min。

圖1 68Ga-NOTA-WL12 Radio-TLC及Radio-HPLC分析 A.純化前產(chǎn)物的Radio-TLC結(jié)果； B.純化后產(chǎn)物的Radio-TLC結(jié)果； C.純化后產(chǎn)物的Radio-HPLC結(jié)果

2.268Ga-NOTA-WL12的體外穩(wěn)定性 標(biāo)記物68Ga-NOTA-WL12穩(wěn)定性良好，在生理鹽水體系中放置240 min，放射化學(xué)純度仍高達(dá)99%；5% HSA體系中放置240 min 后放射化學(xué)純?yōu)?7%，見圖2。脂水分布值為-0.191±0.046，表明該分子具有相對(duì)良好的水溶性。

圖2 68Ga-NOTA-WL12體外穩(wěn)定性分析結(jié)果 圖3 68Ga-NOTA-WL12在正常昆明小鼠體內(nèi)生物分布情況

2.368Ga-NOTA-WL12體內(nèi)分布 經(jīng)尾靜脈對(duì)正常昆明小鼠注射1.85 MBq68Ga-NOTA-WL12后不同時(shí)間點(diǎn)各臟器生物分布見圖3，肝腎攝取水平較高。

2.4 PET/CT顯像68Ga-NOTA-WL12主要分布于肝臟、腎臟及膀胱，且在PD-L1表達(dá)陽性腫瘤病灶中濃聚；阻斷實(shí)驗(yàn)小鼠腫瘤病灶對(duì)分子探針攝取明顯降低，對(duì)照小鼠各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)腫瘤病灶內(nèi)未見明顯分子探針攝取，腫瘤病灶與肌肉SUV比值均小于1.5。

3 討論

多項(xiàng)研究[17-20]表明，以放射性核素標(biāo)記對(duì)PD-1/PD-L1信號(hào)通路有特異靶向性的單克隆抗體、納米、多肽分子作為分子探針并進(jìn)行PET顯像，有望實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、準(zhǔn)確評(píng)估腫瘤患者體內(nèi)PD-L1表達(dá)及變化情況，并用以篩選可自治療中獲益的腫瘤患者。WL12是對(duì)PD-L1具有特異靶向性的環(huán)狀多肽[21]。本研究制備分子探針68Ga-NOTA-WL12，并觀察其生物學(xué)特性。

本研究利用雙功能螯合劑NOTA對(duì)PD-L1特異靶向的環(huán)狀多肽分子進(jìn)行耦聯(lián)和68Ga標(biāo)記，成功獲得了分子探針68Ga-NOTA-WL12。通過NOTA分子耦聯(lián)，在60℃、pH 4.5條件下，68Ga對(duì)NOTA-WL12可于15 min內(nèi)獲得98%標(biāo)記率；體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該分子探針4 h內(nèi)在生理鹽水及HSA中均有良好穩(wěn)定性，為進(jìn)一步體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)；脂水分布值為-0.191±0.046，表明該分子具有相對(duì)良好的水溶性，這可能是生物分布和小動(dòng)物PET顯像中肝臟較高攝取的原因。注射后4 h內(nèi)該分子探針在小鼠體內(nèi)各臟器中呈現(xiàn)逐漸上升、之后降低趨勢，2 h后主要分布于肝、腎及腸道中，與小動(dòng)物PET顯像結(jié)果基本相符。肝臟高攝取可能與該分子探針的脂溶性及代謝相關(guān)，腎臟高攝取可能與其代謝相關(guān)。2 h內(nèi)腫瘤內(nèi)分子探針逐漸濃聚，通過共注射方式可明顯阻斷腫瘤病灶攝取分子探針，而肝腎等攝取未見明顯降低；該分子探針在PD-L1表達(dá)陰性腫瘤病灶中未見明顯攝取，證實(shí)其可用于特異性檢測腫瘤病灶內(nèi)PD-L1表達(dá)。

本研究所制備的68Ga-NOTA-WL12為標(biāo)記率高、穩(wěn)定性良好且對(duì)腫瘤內(nèi)PD-L1具有特異靶向性的分子探針，但在肝腎內(nèi)的非特異性濃聚較高，需要進(jìn)一步改進(jìn)。

圖4 小動(dòng)物PET/CT顯像 A.CHO-hPD-L1小鼠模型各時(shí)間點(diǎn)PET/CT顯像及其阻斷實(shí)驗(yàn)顯像； B.CHO-hPD-L1小鼠模型各時(shí)間點(diǎn)腫瘤病灶與肌肉SUV比值(*：P<0.001)； C.陰性對(duì)照MDA-MB-231小鼠模型各時(shí)間點(diǎn)PET/CT顯像； D.陰性對(duì)照組MDA-MB-231小鼠模型各時(shí)間點(diǎn)腫瘤病灶與肌肉SUV比值