丙泊酚對小鼠急性肺損傷NLRP3信號(hào)通路的影響

符 煒，程向陽，劉 娣，劉 剛

膿毒敗血癥會(huì)導(dǎo)致病人發(fā)生急性肺損傷，繼而引發(fā)重癥監(jiān)護(hù)室病人死亡風(fēng)險(xiǎn)增加[1-2]。丙泊酚對膿毒敗血癥誘發(fā)的急性肺損傷的保護(hù)作用已被證實(shí)[3]，但其機(jī)制還未闡明。研究[4]顯示，核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥體參與急性肺損傷的形成和進(jìn)展。氧化應(yīng)激反應(yīng)參與了急性肺損傷的形成和進(jìn)展[5]，硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)是關(guān)鍵的氧化應(yīng)激銜接蛋白，TXNIP從硫氧還蛋白解離，結(jié)合NLRP3，激活NLRP3炎癥體[6]。由于NLRP3具有促炎作用，抑制NLRP3能抑制炎癥的形成和進(jìn)展，而丙泊酚被認(rèn)為主要通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮肺保護(hù)作用[3]。本研究觀察抑制NLRP3信號(hào)通路對丙泊酚肺保護(hù)作用的影響，以探討丙泊酚肺保護(hù)作用機(jī)制。現(xiàn)作報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠40只，雄性，體質(zhì)量20～24 g，由浙江省醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由進(jìn)食水。小鼠隨機(jī)分為對照組(腹腔注射pH 7.4磷酸緩沖液)、脂多糖(LPS)組(腹腔注射30 mg/kg脂多糖)、丙泊酚組(靜脈注射40 mg/kg丙泊酚)、丙泊酚+LPS組(腹腔注射30 mg/kg LPS前20 min預(yù)靜脈注射40 mg/kg丙泊酚)，各10只。腹腔注射48 h后在七氟烷麻醉下頸椎脫位法處死小鼠。

1.2 方法

1.2.1 病理學(xué)觀察 制作小鼠肺組織石蠟切片，置于烘箱中60 ℃烤1～2 h，石蠟切片常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水，蘇木素染10 min，流水沖洗，去余色，0.7%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水沖洗，切片變藍(lán)約15 min，95%乙醇30 s，乙醇性伊紅染30 s，95%乙醇30 s(2次)，100%乙醇30 s(2次)，石碳酸二甲苯(1∶4)30 s，二甲苯30 s，中性樹膠封片。采用100倍光學(xué)顯微鏡對肺部組織進(jìn)行觀察，細(xì)胞染色呈棕色為陽性細(xì)胞。

1.2.2 小鼠肺組織丙二醛(MDA)含量與超氧化物歧化酶(SOD)活性測定 取ICR小鼠右側(cè)肺部組織與預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液(M∶M=1∶9)混合，充分勻漿，在4 ℃、1 000 r/min離心15 min，制備上清液，根據(jù)MDA、SOD試劑盒操作說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，利用分光光度計(jì)比色法測定其含量。

1.2.3 肺組織TXNIP mRNA和NLRP3 mRNA表達(dá)量 (1)總RNA提?。簩?0 mg肺組織勻漿處理，加入1 mL Trizol試劑裂解細(xì)胞，靜置10 min，每毫升 Trizol試劑中加入0.2 mL氯仿溶液，震蕩15 s，靜置3 min。在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取水樣放置于EP管中，加入相同體積的異丙醇，混勻，常溫放置50 min，在4 ℃、5 000 r/min離心3 min，吸出液體，常溫下沉淀RNA，并用Rnase-free水對RNA沉淀進(jìn)行溶解。(2)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR Premix EX Taq Ⅱ預(yù)混酶(TakaRa公司)，按下列步驟操作。預(yù)混酶10 μL，上述cDNA模板1 μL，上、下游引物各10 pmol/L，加純水至20 μL；AB 7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(AB公司)，反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，50個(gè)循環(huán)，采用溶解曲線分析程序分析產(chǎn)物的溶解曲線，以確認(rèn)引物的特異性。

1.2.4 Western blotting印跡法檢測肺組織中TXNIP和NLRP3蛋白表達(dá) 取肺部組織用液氮均勻研磨至粉末狀，加入蛋白裂解液分解40 min，在冰浴條件下勻漿15 min，在4 ℃、14 000 r/min離心20 min，吸取上清液，Bradford法進(jìn)行蛋白定量，將樣品放置于-80 ℃冰箱中保存。取30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，一抗(Nrf2和HO-1稀釋比例均為1∶ 100)在4 ℃封閉過夜；利用Tris緩沖鹽對膜進(jìn)行沖洗，約5 min，共沖洗3次，向反應(yīng)體系中加入辣根過氧化物酶對二抗IgG(1∶2 000)進(jìn)行標(biāo)記，在常溫下孵育60 min，采用Tris緩沖鹽對膜進(jìn)行沖洗，約5 min，共沖洗3次。利用β-actin作為內(nèi)參，通過化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，暗室曝光沖片，經(jīng)膠片經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)確定TXNIP 和NLRP3蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺組織病理學(xué)觀察 注射48 h后，對照組與丙泊酚組10只小鼠全部存活，LPS組4只、LPS+丙泊酚組6只存活。對照組與丙泊酚組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)較為正常，LPS組小鼠肺泡壁嚴(yán)重破壞，肺部組織毛細(xì)血管發(fā)生充血、擴(kuò)張等現(xiàn)象，肺間質(zhì)發(fā)生水腫，肺泡間隔變寬；丙泊酚+LPS組小鼠肺泡間隔輕度變寬，肺部組織損傷較LPS組減輕(見圖1)。

2.2 各組小鼠右側(cè)肺部組織SOD、MDA比較 腹腔注射48 h后，LPS組小鼠MDA明顯高于對照組，SOD活性明顯低于對照組(P<0.01)。丙泊酚組MDA、SOD與對照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。丙泊酚+LPS組MDA明顯低于LPS組(P<0.01)，與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；SOD活性明顯高于LPS組(P<0.01)，但均明顯低于對照組和丙泊酚組(P<0.01)(見表1)。

2.3 各組小鼠肺組織TXNIP mRNA和NLRP3 mRNA表達(dá)比較 丙泊酚組TXNIP mRNA和NLRP3 mRNA與對照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LPS組TXNIP mRNA 和NLRP3 mRNA表達(dá)均較對照組和丙泊酚組明顯上調(diào)(P<0.01)；丙泊酚+LPS組TXNIP mRNA 和NLRP3 mRNA表達(dá)均明顯低于LPS組(P<0.01)，但仍均明顯高于對照組和丙泊酚組(P<0.01)(見表2)。

表1 各組小鼠右側(cè)肺部組織SOD、MDA比較

表2 各組小鼠肺組織TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA表達(dá)比較

2.4 各組小鼠肺組織TXNIP和NLRP3蛋白表達(dá)比較 丙泊酚組TXNIP和NLRP3蛋白表達(dá)與對照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LPS組TXNIP 和NLRP3蛋白表達(dá)均明顯高于對照組和丙泊酚組(P<0.01)；丙泊酚+LPS組TXNIP 和NLRP3蛋白表達(dá)均明顯低于LPS組(P<0.01)(見表3)。

表3 各組小鼠肺組織TXNIP、NLRP3表達(dá)水平比較

3 討論

炎癥調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子在急性肺損傷發(fā)生和進(jìn)展中扮演著重要作用[7]，大量的肺泡巨噬細(xì)胞是肺組織天然的免疫細(xì)胞，急性呼吸窘迫綜合征病人肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過量的白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-18，應(yīng)用IL-1β和IL-18中和抗體和IL-1受體拮抗劑能顯著減弱機(jī)械通氣誘發(fā)的急性肺損傷,機(jī)械通氣激活NLRP3炎癥體，NLRP3炎癥體進(jìn)一步誘發(fā)了肺泡IL-1β和IL-18的釋放，因此NLRP3信號(hào)通路可能有助于機(jī)械通氣誘發(fā)的急性肺損傷的發(fā)生[8-9]。

在LPS誘發(fā)的急性肺損傷模型中，LPS通過激活氧化應(yīng)激反應(yīng)間接激活NLRP3信號(hào)通路，氧化應(yīng)激產(chǎn)物被證實(shí)參與了NLRP3信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[10]。本研究結(jié)果顯示，LPS明顯上調(diào)小鼠肺組織TXNIP 和NLRP3 mRNA及蛋白表達(dá)。丙泊酚是臨床常用全麻藥物，在急性肺損傷氣管插管病人鎮(zhèn)靜中的應(yīng)用較廣。丙泊酚在臨床上可顯著降低急性肺損傷發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，有學(xué)者指出丙泊酚對肺組織保護(hù)作用與氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等有關(guān)，丙泊酚可清除羥基自由基與H2O2，誘導(dǎo)HO-1表達(dá)，抑制IL-6、TNF-α等炎性因子的表達(dá)，對臟器起到保護(hù)作用[11-13]。LUO等[14]研究表明丙泊酚對原位肝移植大鼠致急性肺損傷保護(hù)與抑制NADPH氧化酶相關(guān)，丙泊酚通過降低炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激反應(yīng)實(shí)現(xiàn)肺組織保護(hù)效果。本研究結(jié)果顯示，丙泊酚能明顯減弱LPS誘發(fā)的肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，雖然對正常肺組織TXNIP和NLRP3表達(dá)沒有影響，但對LPS激活的NLRP3信號(hào)通路有顯著抑制作用，提示丙泊酚抑制LPS激活的NLRP3信號(hào)通路可能與抑制LPS誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

綜上，丙泊酚對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的保護(hù)作用可能與抑制NLRP3信號(hào)通路有關(guān)。