雙核釕配合物與c-myc G-四鏈體DNA的鍵合性能

嚴(yán)雙美，米雅萱，崔玥，鄭澤寶，趙曉瓏

(1. 河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071002；2. 泰山學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，山東 泰安 271021)

近年來(lái)，人們對(duì)能夠識(shí)別G-四鏈體的新藥物產(chǎn)生了濃厚的興趣[1]. G-四鏈體是由富含鳥嘌呤(G堿基)的核酸序列形成的鳥嘌呤四分體組合構(gòu)成[2-3]. 有證據(jù)表明，在人類的基因組[4]和mRNA[5]中都發(fā)現(xiàn)了G-四鏈體的存在，特別是在原癌基因啟動(dòng)子區(qū)域和端粒中. 原癌基因c-myc在高達(dá)80%的實(shí)體瘤中過(guò)表達(dá)，但在正常細(xì)胞中表達(dá)較低，并且與細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)[6].c-myc的過(guò)表達(dá)會(huì)引發(fā)一些癌癥，如結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌和肺癌、骨肉瘤和白血病等[7-9]. 而c-myc中也含有富G序列，可以通過(guò)Hoogesten氫鍵形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而來(lái)抑制c-myc的復(fù)制和翻譯[10-11]. 因此，G-四鏈體已成為癌癥研究中的生物學(xué)靶標(biāo)，并且有可能成為基于DNA靶向治療的新目標(biāo)[1]. 同時(shí)，金屬配合物與G-四鏈體的相互作用成為了新的研究方向，金屬抗癌藥物受到研究者們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注[2-3].

順鉑是治療癌癥的金屬藥物之一[12]，但因其有嚴(yán)重的副作用和耐藥性，迫使人們?nèi)ふ夷軌蛱娲慕饘偎幬? 其中，釕配合物因具有較多優(yōu)點(diǎn)而受到重視，如它對(duì)健康組織有較低的毒性，具有良好的光化學(xué)、光物理性能和豐富的光譜學(xué)性質(zhì)等[3,13-17]. 據(jù)文獻(xiàn)[18]報(bào)道，劉杰課題組發(fā)現(xiàn)配合物[Ru(phen)2(dhipH3)]2+對(duì)c-mycPu27 G-四鏈體有很強(qiáng)的結(jié)合力，而且可以通過(guò)誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，進(jìn)而使線粒體膜電位去極化導(dǎo)致細(xì)胞凋亡. 在對(duì)釕配合物研究的過(guò)程中，人們發(fā)現(xiàn)一些雙核或者多核配合物的中心金屬能夠提供更多的正電荷，它們與單核配合物相比，更具有優(yōu)勢(shì)[19]. 計(jì)亮年課題組[20]合成的雙核釕配合物[(bpy)2Ru(ebipcH2)Ru(bpy)2]4+、[(bpy)2Ru(mbpibH2)Ru(bpy)2]4+和[(bpy)2Ru(hbpibH2)Ru(bpy)2]4+都能誘導(dǎo)端粒序列AG3(T2AG3)3形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，并且對(duì)G-四鏈體有較強(qiáng)的穩(wěn)定作用和較高的選擇性，其中雙核釕配合物[(bpy)2Ru(ebipcH2)Ru(bpy)2]4+能有效地抑制端粒酶活性以及HaLa細(xì)胞的增殖. Thomas課題組[21]合成了2個(gè)雙核釕配合物[(phen)2Ru(tpphz)Ru(phen)2]4+和[(TAP)2Ru(tpphz)Ru(TAP)2]4+，它們對(duì)雙鏈DNA和G-四鏈DNA都有很好的鍵合作用， 其中，配合物[(phen)2Ru(tpphz)Ru(phen)2]4+主要定位于人黑色素瘤細(xì)胞的線粒體中，而配合物[(TAP)2Ru(tpphz)Ru(TAP)2]4+主要定位于人黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中，且[(TAP)2Ru(tpphz)Ru(TAP)2]4+在黑暗條件下沒(méi)有毒性，一旦被光敏化，就會(huì)對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生顯著的毒性. 張丹課題組合[22]成了一個(gè)含有非環(huán)冠醚的雙核釕配合物，其具有顯著穩(wěn)定G-四鏈體的能力，并且與G-四鏈體作用后的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)約15倍，但與雙鏈DNA結(jié)合后熒光強(qiáng)度不變，說(shuō)明配合物能選擇性結(jié)合G-四鏈體，可以作為G-四鏈體的熒光探針.

基于雙核或多核釕配合物在與G-四鏈體作用中的優(yōu)勢(shì)，本文合成了一個(gè)含有苯酚基的雙核釕配合物，并通過(guò)紫外可見(jiàn)吸收光譜和熒光光譜滴定、Job plot、圓二色光譜、PCR擴(kuò)增反應(yīng)、顯色反應(yīng)、FRET實(shí)驗(yàn)研究了其與c-mycG-四鏈體DNA (c-mycPu27和c-mycPu22)之間的相互作用.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 釕配合物的合成與表征

釕配合物參考文獻(xiàn)[23]的方法合成，其表征結(jié)果與參考文獻(xiàn)一致，該配合物結(jié)構(gòu)如圖1所示.

圖1 釕配合物的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of ruthenium complex

1.2 主要原料與試劑

c-mycPu27 DNA (5′-TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGG-3′), Pu27rev (5′-ATCGATCGCTTCTCGTCCTTCCCCA-3′),c-mycPu22 DNA (5′-GAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAG-3′), Pu22rev (5′-ATCGCTTCTCGTCTTCCCCA-3′), F27T (5′-FAM-TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGG-TAMRA-3′, FAM: carboxyfluorescein, TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine) and F22T (5′-FAM-GAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAG-TAMRA-3′)購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司. 若無(wú)特殊說(shuō)明，所有與c-mycDNA相關(guān)的實(shí)驗(yàn)均在Tris-KCl緩沖溶液 (10 mmol/L Tris, 100 mmol/L KCl, pH值為7.40±0.02)中進(jìn)行. 實(shí)驗(yàn)中緩沖溶液采用超純水配制. 其他試劑均為分析純，沒(méi)有進(jìn)一步純化處理.c-mycPu27 DNA和c-mycPu22 DNA固體樣品通過(guò)高速離心機(jī)離心20 min后，加入定量緩沖液，充分振蕩后，將樣品稀釋到一定濃度，90 ℃水浴5 min，冷卻至室溫，4 ℃過(guò)夜保存.

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外可見(jiàn)吸收光譜

紫外可見(jiàn)吸收光譜是一種用來(lái)研究配合物和DNA相互作用的普遍方法. 一般來(lái)說(shuō)，配合物在紫外可見(jiàn)光譜中會(huì)表現(xiàn)出對(duì)一定波長(zhǎng)光的吸收，但在DNA存在時(shí)，吸收峰會(huì)發(fā)生減色和紅移現(xiàn)象，并且變化強(qiáng)度取決于配合物與DNA的結(jié)合力[24].c-mycDNA加入到釕配合物溶液時(shí)的紫外光譜變化，如圖2所示. 從圖2中可以看出，配合物在286、468 nm處有2個(gè)吸收峰，分別是由配體內(nèi)的電荷轉(zhuǎn)移(IL)和金屬離子到配體的電荷躍遷(MLCT)引起. 當(dāng)增加c-mycDNA濃度時(shí)，配合物的IL吸收譜帶出現(xiàn)顯著的減色和紅移現(xiàn)象，但MLCT譜帶變化不明顯. 圖2a所示為c-mycPu27和配合物作用后的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖，當(dāng)鍵合作用達(dá)到平衡時(shí)，IL譜帶的減色率為52.3%，紅移了6 nm；圖2b所示為c-mycPu22和配合物作用后的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖，當(dāng)鍵合作用到達(dá)平衡后，IL譜帶的減色率為58.6%，紅移了4 nm，說(shuō)明配合物和c-mycPu27、c-mycPu22之間有強(qiáng)烈的π-π*堆積作用. 配合物與c-mycDNA相互作用的減色率大于文獻(xiàn)中報(bào)道的[Ru(bpy)2(p-tFMPIP)]2+(20.1%)[25]、[Ru(phen)2(p-tFMPIP)]2+(28.0%)[25]、[Ru(phen)2(TMSEPIP)]2+(42.3%)[17]、[Ru(phen)2(BEPIP)]2+(45.0%)[17]等，進(jìn)一步表明配合物與c-mycDNA有較強(qiáng)的結(jié)合作用.

a.c-myc Pu27,c(Ru)=10 μmol/L;b.c-myc Pu22,c(Ru)=6.13 μmol/L.圖2 隨著c-myc DNA的增加，釕配合物紫外可見(jiàn)吸收光譜的變化Fig.2 UV-visible spectra changes of ruthenium complex with increasing c-myc DNA

2.2 熒光光譜

熒光光譜可以進(jìn)一步闡明配合物與DNA之間的相互作用. 一般情況下，當(dāng)配合物與DNA結(jié)合時(shí)，由于受到DNA堿基疏水環(huán)境的作用，使配合物的熒光不易被淬滅，從而產(chǎn)生熒光增強(qiáng)的現(xiàn)象. 圖3為c-mycDNA與配合物作用后的熒光光譜圖. 隨著c-mycDNA濃度逐漸增加，釕配合物在550～600 nm 波長(zhǎng)內(nèi)的熒光顯著增強(qiáng)，表明配合物與c-mycDNA作用后，受到DNA堿基疏水環(huán)境的保護(hù)，避免了配合物熒光的淬滅. 當(dāng)配合物與c-mycPu27和c-mycPu22達(dá)到鍵合飽和時(shí)，熒光強(qiáng)度增大為原來(lái)的8.69倍和5.63倍，即I/I0分別為8.69和5.63，高于文獻(xiàn)中報(bào)道的一些釕配合物，如配合物[Ru(phen)2(mitatp)]2+(I/I0= 2.4)[26]、[Ru(L1)(dppz)2](PF6)4(I/I0= 4.8) {L1= 5,5′-二(1-(三甲基氨基)甲基)-2,2′-聯(lián)吡啶基陽(yáng)離子}[27]、[Ru(bpy)2(mitatp)]2+(I/I0= 6.5)[26]、[Ru(L2)(dppz)2](PF6)4(I/I0= 7.6) {L2= 5,5′-二(1-(三乙基氨基)甲基)-2,2′-聯(lián)吡啶基陽(yáng)離子}[27]等，表明配合物有良好的“G-四鏈體DNA分子光開關(guān)”的性質(zhì).

通過(guò)曲線擬合得到配合物與c-mycG-四鏈體DNA的鍵合常數(shù)分別為Kb= 6.21×107L/mol (c-mycPu27)，Kb= 2.33×106L/mol (c-mycPu22)[28]，大于已經(jīng)報(bào)道的[Ru(phen)2(tip)]2+(Kb= 1.43×106L/mol)[29]、[Ru(bpy)2(dhipH3)]2+(Kb= 2.45×106L/mol)[30]、[Ru(bpy)2(p-BEPIP)]2+(Kb= 1.09×107L/mol)[16]，再一次表明配合物與c-mycDNA之間存在較強(qiáng)的鍵合作用.

a.c-myc Pu27,c(Ru)=3.43 μmol/L;b.c-myc Pu22,c(Ru)=2.45 μmol/L.圖3 隨著c-myc DNA的增加，釕配合物熒光光譜的變化(插圖：曲線擬合法求鍵合常數(shù))Fig.3 Emission spectra of ruthenium complex in the presence of increasing amounts of c-myc DNA, (the nonlinear fitting for calculation of binding constant)

2.3 Job plot

配合物與c-mycG-四鏈體DNA鍵合的物質(zhì)的量比可以通過(guò)Job plot實(shí)驗(yàn)來(lái)確定. 通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化ΔI對(duì)配合物的摩爾分?jǐn)?shù)X作圖，圖4中所示拐點(diǎn)即為配合物與c-mycDNA的物質(zhì)的量比. 如圖4所示，當(dāng)配合物的摩爾分?jǐn)?shù)增大時(shí)，熒光強(qiáng)度變化呈先上升再下降的趨勢(shì)，圖4中的最高點(diǎn)分別為X=0.64 (c-mycPu27)和X=0.66 (c-mycPu22)，表明配合物與c-mycPu27和c-mycPu22 G-四鏈體的鍵合物質(zhì)的量比都為2∶1，即每一個(gè)c-mycG-四鏈體DNA分子可以結(jié)合2個(gè)配合物. 已報(bào)道的配合物也有相

釕配合物與c-myc G-四鏈體DNA總濃度恒定(10 μmol/L).圖4 隨著釕配合物摩爾分?jǐn)?shù)的增加，配合物熒光強(qiáng)度的變化曲線Fig.4 Job plot constructed from mixing the ruthenium complex and c-myc G-quadruplex DNA together in variable ratios

同的計(jì)量比，如[Ru(phen)2dpq-df]2+和[Ru(bpy)2dpq-df]2+[31]與22AG G-四鏈體的鍵合計(jì)量比也為2∶1. 而有些配合物的鍵合物質(zhì)的量比則為1∶1，即1個(gè)配合物結(jié)合1個(gè)G-四鏈體DNA分子，如[Ru(bpy)2(dppz)]2+與22AG G-四鏈體[32]、[Ru(bpy)2(p-BEPIP)]2+和[Ru(bpy)2(p-TEPIP)]2+與c-mycPu22 G-四鏈體[16].

2.4 圓二色(CD)光譜

CD光譜是一種研究核酸構(gòu)像的方法，可以為生物大分子與DNA的相互作用提供一些有用的信息. 當(dāng)c-mycG-四鏈體DNA與釕配合物作用后，其CD光譜會(huì)發(fā)生變化. 圖5為配合物與c-mycG-四鏈體DNA在Tris-KCl緩沖溶液中的CD光譜圖. 圖5a為c-mycPu27與配合物作用后的變化趨勢(shì)，可以看出，c-mycPu27在241 nm處出現(xiàn)負(fù)峰，在264 nm處出現(xiàn)正峰，逐漸增加配合物的濃度，264 nm處的正峰強(qiáng)度(ICD)出現(xiàn)下降趨勢(shì)，強(qiáng)度降低了70.2%，并在300 nm處誘導(dǎo)出新的負(fù)峰；圖5b為c-mycPu22與配合物反應(yīng)后的譜圖，觀察到c-mycPu22在264 nm處的峰強(qiáng)度隨著配合物的增加而逐漸降低，強(qiáng)度降低了70.9%，在295 nm處誘導(dǎo)出現(xiàn)新的負(fù)峰. 這些現(xiàn)象與文獻(xiàn)中報(bào)道的化合物[Ru(bpy)2(p-BEPIP)]2+和[Ru(bpy)2(p-TEPIP)]2+與c-mycPu22 G-四鏈體鍵合時(shí)的現(xiàn)象相同，表明配合物與c-mycPu27和c-mycPu22是溝槽結(jié)合[16].

a.c-myc Pu27,c(Ru)=70 μmol/L;b.c-myc Pu22,c(Ru)=60 μmol/L.圖5 隨著釕配合物的增加，c-myc DNA CD光譜的變化曲線 Fig.5 CD spectra changes of c-myc DNA in the presence of increasing amount of ruthenium complex

2.5 PCR (polymerase chain reaction)

通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)停止分析，可以檢測(cè)釕配合物能否誘導(dǎo)DNA形成G-四鏈體結(jié)構(gòu). 該反應(yīng)以Taq DNA聚合酶為催化劑，使DNA序列與其互補(bǔ)序列雜交，形成PCR產(chǎn)物. 如果釕配合物可以誘導(dǎo)c-mycDNA形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，則雜交會(huì)阻斷，PCR反應(yīng)終止，且檢測(cè)不到PCR產(chǎn)物[16]. 配合物與c-mycPu27和c-mycPu22 DNA反應(yīng)的PCR結(jié)果如圖6所示. 從圖6可以看出，隨著配合物的加入，雜交被抑制，并且配合物濃度越大時(shí)，檢測(cè)到的PCR產(chǎn)物越少，出現(xiàn)條帶變暗的現(xiàn)象. 當(dāng)配合物濃度分別達(dá)到4 μmol/L G-四鏈(c-mycPu27)、6 μmol/L (c-mycPu22)時(shí)，幾乎檢測(cè)不到PCR產(chǎn)物，表明配合物可以誘導(dǎo)c-mycDNA形成G-四鏈體結(jié)構(gòu). 在報(bào)道的文獻(xiàn)中，許多配合物完全抑制PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度略大，如[(η6-HC6H5)Ru(m-MOPIP)Cl]+[33]、[(η6-CH3C6H5)Ru(m-MOPIP)Cl]+[33]、Λ-[Ru(bpy)2(H2iip)]2+[24]的抑制PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度分別為12、9、8 μmol/L，進(jìn)一步說(shuō)明了配合物是有效的G-四鏈體誘導(dǎo)劑.

a.c-myc Pu27;b.c-myc Pu22.圖6 釕配合物對(duì)c-myc DNA作用的PCR擴(kuò)增Fig.6 Effect of ruthenium complex on the hybridization of c-myc Pu27 and c-myc Pu22 DNA in PCR-stop assay

2.6 顯色反應(yīng)

為了進(jìn)一步證明配合物能否誘導(dǎo)c-mycDNA形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，筆者采用了一種肉眼可見(jiàn)的視覺(jué)方法. 因?yàn)镵+或者配合物可以促使G-四鏈體有效形成，并且G-四鏈體可與氯化血紅素結(jié)合形成一種過(guò)氧化物脫氧核酶[11]；在這種酶的存在下，過(guò)氧化氫介導(dǎo)的TMB (3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺)的氧化過(guò)程急劇加速，形成肉眼可見(jiàn)的藍(lán)色，而且顏色變化非常敏感，易于鑒定，所以用這種視覺(jué)方法來(lái)鑒別G-四鏈體的形成. 圖7是配合物的顯色反應(yīng)結(jié)果，從圖7中可以看到，對(duì)照組和加入了ct-DNA的釕配合物溶液顏色沒(méi)有變化，但加入K+和釕配合物的c-mycDNA溶液從無(wú)色變?yōu)樗{(lán)色. 此結(jié)果表明，配合物和K+都能誘導(dǎo)c-mycPu27和c-mycPu22形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，而不能誘導(dǎo)雙鏈DNA形成G-四鏈體結(jié)構(gòu).

a. c-myc Pu27;b.c-myc Pu22.c(K+)=500 nmol/L,c(Ru)=500 nmol/L.圖7 在TMB-H2O2體系中，加入配合物或K+后c-myc DNA的酶功能表征Fig.7 Characterizations of the DNAzyme functions of c-myc DNA and ct-DNA in the presence of K+ and ruthenium complex in the TMB-H2O2 system.

2.7 FRET (Fluorescence resonance energy transfer)

通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移熔煉法可以測(cè)定配合物對(duì)c-mycG-四鏈體DNA的穩(wěn)定作用. 圖8為F27T和F22T的熔解曲線. 在Tris-KCl (10 mmol/L Tris, 60 mmol/L KCl, pH = 7.40 ± 0.02)溶液中，F(xiàn)27T的

圖8 釕配合物與F27T(a)和F22T(b)作用的FRET熔解曲線Fig.8 Normalized FRET melting curves of F27T(a) and F22T(b) with increasing concentrations of ruthenium complex

圖9 釕配合物對(duì)F27T(a)、F22T(b)的FRET競(jìng)爭(zhēng)曲線Fig.9 Competition FRET melting curves of F27T(a) and F22T(b) with increasing concentrations of duplex ct-DNA

3 結(jié)論

本文合成并表征了一個(gè)含有苯酚基的雙核釕配合物. 通過(guò)紫外可見(jiàn)吸收光譜、熒光光譜、Job plot和圓二色光譜研究表明，配合物與c-mycPu27和c-mycPu22 DNA均有較強(qiáng)的鍵合力，鍵合常數(shù)為6.21×107L/mol (c-mycPu27)和2.33×106L/mol (c-mycPu22)，鍵和模式為溝槽結(jié)合，鍵合物質(zhì)的量比也都為2∶1，并且配合物與c-mycPu27和c-mycPu22 DNA相互作用后，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)為原來(lái)的8.69倍和5.63倍，表現(xiàn)出良好的“分子光開關(guān)”性質(zhì).PCR實(shí)驗(yàn)和顯色反應(yīng)表明，配合物可以將c-mycPu27和c-mycPu22誘導(dǎo)形成G-四鏈體結(jié)構(gòu). FRET及其競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)表明，配合物對(duì)c-mycPu27和c-mycPu22都有較強(qiáng)的穩(wěn)定作用，并且在雙鏈DNA存在條件下都能選擇性結(jié)合c-mycPu27和c-mycPu22 G-四鏈體.