一株萊氏綠僵菌的篩選及其對草地貪夜蛾的毒力

龍秀珍，高旭淵，曾憲儒，何 瞻，韋德衛(wèi)，江小冬，曾 濤，于永浩

（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所/廣西作物病蟲害生物學(xué)重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南寧作物有害生物科學(xué)觀測實驗站，南寧 530007）

草地貪夜蛾Spodoptera frugipera，鱗翅目Lepidoptera，夜蛾科Noctuidae，原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，具雜食性和遷飛性，可為害353種作物[1]、單雌平均產(chǎn)卵量436～1281粒[2]，在風(fēng)速或風(fēng)向適宜時每晚可遷飛幾百公里[3]，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織全球預(yù)警的重大農(nóng)業(yè)害蟲。截至2020年11月，草地貪夜蛾已在世界113個國家和地區(qū)發(fā)生為害[4]。在我國，自2019年1月云南省普洱市江城縣首次發(fā)現(xiàn)入侵草地貪夜蛾幼蟲為害[5]，截止到2020年7月9日，我國共有21個省（市、區(qū)）1029縣（區(qū)）發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾幼蟲[6]。草地貪夜蛾嚴(yán)重為害我國的玉米等作物，2019年該蟲為害玉米在云南曲靖市造成的直接經(jīng)濟損失達2902.67萬元[7]，預(yù)計我國每年因草地貪夜蛾為害造成的經(jīng)濟損失可達100億元人民幣[8]，草地貪夜蛾對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅。

目前，草地貪夜蛾的防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，但化學(xué)農(nóng)藥的長期使用容易使害蟲產(chǎn)生3R問題，我國已發(fā)現(xiàn)該蟲對傳統(tǒng)的有機磷類、擬除蟲菊酯類及氨基甲酸酯類農(nóng)藥化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生了抗性[9]，廣東茂名種群對甲維鹽和氯蟲苯甲酰胺的抗性達中抗水平[10]，加之化學(xué)農(nóng)藥的大量使用還會帶來一系列的環(huán)境生態(tài)問題，國家出臺了減藥行動方案，這使得化學(xué)農(nóng)藥防治受到一定制約，必須尋找替代措施。昆蟲病原真菌是一類能感染昆蟲并在昆蟲體表或體內(nèi)增殖致使昆蟲發(fā)病甚至死亡，可在昆蟲群落中自然傳播并造成流行的微生物。昆蟲病原真菌對環(huán)境友好，對害蟲具有持續(xù)的控制能力，不易導(dǎo)致害蟲抗性，因此，昆蟲病原真菌在草地貪夜蛾的防控中具有很大的應(yīng)用前景[11]。萊氏綠僵菌Metarhizium rileyi，原名萊氏野村菌Nomuraea rileyi（Farlow）Samson，是一種重要的蟲生真菌，關(guān)于利用其防治草地貪夜蛾的研究在國外已有不少報道[12-15]。國內(nèi)鄭亞強等[16]在云南省曲靖市玉米地發(fā)現(xiàn)了自然感病的草地貪夜蛾幼蟲僵蟲，經(jīng)分離鑒定為萊氏綠僵菌，1.0×108孢子/mL菌懸液處理草地貪夜蛾3齡幼蟲7 d的死亡率為100%；雷妍圓等[17]在廣東省廣州市野外采集到了自然感染萊氏綠僵菌的草地貪夜蛾幼蟲僵蟲，該菌1.0×109孢子/mL接種草地貪夜蛾2齡幼蟲7 d的校正死亡率為100%，但萊氏綠僵菌對草地貪夜蛾其他齡期幼蟲和其他蟲態(tài)的致病力有待進一步研究。

我們從廣西南寧市武鳴區(qū)的田間采集到被蟲生真菌感染的草地貪夜蛾幼蟲，經(jīng)分離純化獲得1株病原真菌，采用形態(tài)學(xué)和ITS-rDNA序列分析相結(jié)合的方法對病原真菌進行了鑒定，并采用浸蟲法研究了該菌對草地貪夜蛾的致病力，發(fā)現(xiàn)其以較低的濃度即可獲得明顯的效果，為草地貪夜蛾的微生物防治提供候選菌種資源。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

草地貪夜蛾采集于廣西南寧市武鳴區(qū)田間玉米植株上，在實驗室用玉米葉飼養(yǎng)，待其子代孵化后作為供試蟲源。室內(nèi)飼養(yǎng)條件為溫度（27±1）℃，相對濕度70%～90%，光周期14L:10D。

1.2 供試菌株

草地貪夜蛾幼蟲僵蟲采集自廣西壯族自治區(qū)南寧市武鳴區(qū)田間，將僵蟲置于5 mL離心管中帶回實驗室，在無菌條件下用接種針挑起少量孢子，采用劃線法接種于薩氏麥芽糖瓊脂酵母培養(yǎng)基（SMAY）（麥芽糖40 g、蛋白胨10 g、酵母浸膏10 g、瓊脂18 g、蒸餾水1000 mL），于溫度（26±1）℃、相對濕度（80±5）%、光周期12L:12D的人工氣候箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，挑取少量孢子至新的培養(yǎng)基單孢分離純化培養(yǎng)15 d，將分離純化的菌株分生孢子置于20%的甘油中，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，菌株編號為CDTLJ1，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏編號為CGMCC No.19608。

1.3 菌株培養(yǎng)特征觀察

將分離純化的CDTLJ1菌株在直徑為90 mm的SMAY平板培養(yǎng)基上于溫度（26±1）℃、相對濕度（80±5）%、光周期12L:12D的人工氣候箱中培養(yǎng)，每天觀察記錄菌落形態(tài)特征；4～5 d后挑取菌絲，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株的菌絲和分生孢子梗形態(tài)；10～12 d后挑取成熟分生孢子觀察分生孢子的形態(tài)與大小。

1.4 菌株分子生物學(xué)鑒定

以分離純化獲得的 CDTLJ1菌株基因組 DNA為模板，采用真菌通用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行菌株 ITS-rDNA 序列 PCR 擴增。PCR反應(yīng)體系 50 μL：2×Es Taq MasterMix（Dye）25 μL，DNA 模板 1 μL，上、下游引物各 2 μL（10 μmol/L），ddH2O 20 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行 35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送廣州擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 菌株對草地貪夜蛾不同齡期幼蟲、預(yù)蛹和蛹的毒力測定

前期的預(yù)試驗表明1×107孢子/mL濃度對各齡期幼蟲均有較好的毒力，且對預(yù)蛹、蛹也有致病力。本試驗從SMAY平板上刮取菌株CDTLJ1孢子置于滅菌的0.05%吐溫-80溶液中，用血球計數(shù)板計數(shù)得到的孢子濃度為1.20×107孢子/mL，配制成孢子懸浮液，用該濃度孢懸液進行試驗。

選取大小一致、健康的草地貪夜蛾2～6齡各齡期幼蟲、預(yù)蛹、化蛹12 h內(nèi)的新鮮蛹，放入配制好的孢子懸浮液中，浸漬5 s后取出，置于無菌濾紙上吸干蟲體表面多余水分，單頭放入皿底墊有濕潤濾紙的滅菌培養(yǎng)皿（d＝7.5 cm）中。放置幼蟲的皿內(nèi)放入新鮮玉米葉供其取食，并每天更換新鮮的玉米葉。以浸漬0.05%土溫-80無菌水溶液處理作為對照。每處理20頭試蟲，重復(fù)3次。處理后置于溫度（26±1）℃、相對濕度（80±5）%、光周期14L:10D的人工氣候箱飼養(yǎng)，每天觀察記錄死亡蟲數(shù)，并將死亡的試蟲繼續(xù)保留在培養(yǎng)皿中保濕觀察，確認是否為供試菌株感染致死。

1.6 菌株對草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力測定

從SMAY平板上刮取CDTLJ1菌株孢子置于滅菌的0.05%吐溫-80溶液中，配制成5個濃度梯度的孢子懸浮液（1×104、1×105、1×106、1×107、1×108孢子/mL）；選取大小一致、健康活潑的草地貪夜蛾3齡幼蟲，放入配制好的孢子懸浮液中，浸漬5 s后取出，置于無菌濾紙上吸干蟲體表面多余水分，單頭放入皿底墊有濕潤濾紙的滅菌培養(yǎng)皿（d＝7.5 cm）中，皿內(nèi)放入新鮮玉米葉供其取食，并每天更換新鮮的玉米葉。以浸漬0.05%土溫-80無菌水溶液處理作為對照。每處理20頭幼蟲，單頭飼養(yǎng)，重復(fù)3次。處理后置于溫度（26±1）℃、相對濕度（80±5）%、光周期12L:12D的人工氣候箱飼養(yǎng)，每天觀察記錄死亡蟲數(shù)，并將死亡的幼蟲繼續(xù)保留在培養(yǎng)皿中保濕觀察，確認是否為供試菌株感染致死。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

將CDTLJ1菌株的ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），序列經(jīng)BLAST后下載同源性較高的序列，用MEGA X進行序列處理，應(yīng)用最大似然法（ML），運行1000次bootstrap驗證，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理后，用 SPSS 17.0軟件進行處理分析，統(tǒng)計各處理試蟲的累積死亡率和累積校正死亡率。利用Duncan’s新復(fù)極差法對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，采用Probit方法計算致死中時（LT50），求回歸方程及計算致死中濃度（LC50）。死亡率（%）＝（處理死亡總蟲數(shù)/處理總蟲數(shù)）×100；校正死亡率（%）＝（處理死亡率－對照死亡率）/（100－對照死亡率）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的培養(yǎng)形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定

研究發(fā)現(xiàn)，菌株培養(yǎng)初期菌落較小，短絨毛狀凸起，邊緣呈黏液狀，無分泌物，菌落正面呈乳白色，5～6 d開始產(chǎn)孢，產(chǎn)孢后菌落為淡綠色。菌絲光滑有分隔，分生孢子呈穗狀，分生孢子梗產(chǎn)生于營養(yǎng)菌絲，每個分支上有數(shù)個分生孢子梗，分生孢子梗短圓柱形，近基部略膨大，頂部略短尖[16]；分生孢子著生于頂部，鏈生，長橢圓形，表面光滑，聚集呈淡綠色，（3～4.5）μm×（2～3）μm（圖1A）。菌落生長較緩慢，在SMAY培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d的菌落直徑為15 mm（圖1B）。

圖1 菌株CDTLJ1的菌落和分生孢子形態(tài)特征Fig. 1 Morphological characteristics of colony and conidia of M. rileyi CDTLJ1

使用PCR擴增ITS-rDNA序列片段并測序，結(jié)果顯示擴增片段為592 bp，將該序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)該菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中的Metarhizium rileyiNr Sf-1（GenBank登錄號MN602591.1）菌株的相似性為100%。下載BLAST結(jié)果中同源性較高的序列，用MEGA X進行序列處理，經(jīng)Clustal W多重對比，應(yīng)用最大似然法（ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。由圖2可知，菌株CDTLJ1與數(shù)據(jù)庫中其他萊氏綠僵菌株聚為一大支，說明該菌株與數(shù)據(jù)庫中的萊氏綠僵菌菌株具有較高的相似性。綜合形態(tài)特征鑒定和ITS序列相似性分析，將該菌株確定為萊氏綠僵菌。

圖2 基于ITS序列構(gòu)建菌株CDTLJ1的ML系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig. 2 ML phylogenetic tree of strain CDTLJ1 based on ITS sequences

2.2 草地貪夜蛾幼蟲、預(yù)蛹和蛹感染萊氏綠僵菌CDTLJ1的癥狀

草地貪夜蛾2～6齡幼蟲均可被萊氏綠僵菌CDTLJ1菌株感染。感染初期，幼蟲取食行為、取食量、蟲體外部形態(tài)與健康幼蟲無差別；在接種處理后第4 d，各齡期幼蟲均出現(xiàn)萊氏綠僵菌感染致死個體。以4齡幼蟲為例，幼蟲剛死亡時蟲體發(fā)紅、僵硬（圖3A），隨后體表逐漸長出大量白色菌絲（圖3B），死亡后第3 d，蟲體表面的菌絲開始產(chǎn)孢（圖3C），死亡后第4 d，蟲體被厚厚一層綠色分生孢子粉覆蓋（圖3D）。

部分草地貪夜蛾5齡幼蟲被菌株CDTLJ1感染后不能正?；迹▓D3E），蟲體逐漸僵硬并長出白色菌絲（圖3F～G），隨后產(chǎn)生綠色分生孢子（圖3H）?；?2 h內(nèi)的新鮮蛹也可被感染，部分6齡幼蟲和預(yù)蛹在被感染后仍能化蛹，但蛹體2～3 d后逐漸變僵硬（圖3I），保濕培養(yǎng)后菌絲從氣門、節(jié)間等部位長出，并產(chǎn)生分生孢子（圖3J～M），但被感染的預(yù)蛹和蛹體表長出的菌絲和孢子均比罹病幼蟲產(chǎn)生的少。

圖3 草地貪夜蛾幼蟲、預(yù)蛹、蛹感染萊氏綠僵菌CDTLJ1的癥狀Fig. 3 External symptoms of larvae, prepupa, pupa of S. frugiperda after infection M. rileyi strain CDTLJ1

2.3 萊氏綠僵菌CDTLJ1對草地貪夜蛾不同齡期幼蟲、預(yù)蛹和蛹的致死率

研究發(fā)現(xiàn)，萊氏綠僵菌CDTLJ1對草地貪夜蛾2～6齡幼蟲、預(yù)蛹、蛹均具有致病力。幼蟲、預(yù)蛹、蛹均在萊氏綠僵菌CDTLJ1 1.20×107孢子/mL處理后第4 d開始出現(xiàn)死亡，并隨著處理時間的延長，草地貪夜蛾幼蟲、預(yù)蛹、蛹的校正死亡率逐漸升高。處理后第4 d，2～6齡幼蟲、預(yù)蛹、蛹的校正死亡率分別為63.33%、60.00%、60.00%、55.00%、43.33%、13.33%和8.33%。處理后第6 d，2～5齡幼蟲的校正死亡率均達100%，6齡幼蟲的累積校正死亡率為98.33%，預(yù)蛹和蛹的累積校正死亡率分別為28.33%、20.00%（圖4）。

圖4 萊氏綠僵菌菌株CDTLJ1對草地貪夜蛾的毒力Fig. 4 The virulence of M. rileyi strain CDTLJ1 against S. frugiperda

2.4 萊氏綠僵菌CDTLJ1對草地貪夜蛾不同齡期幼蟲、預(yù)蛹和蛹的致死中時

在1.20×107孢子/mL濃度下，隨著草地貪夜蛾蟲齡的增加，草地貪夜蛾的致死中時（LT50）逐漸延長，即蟲齡越大，試蟲的LT50值越大。2～6齡幼蟲的LT50值從3.91 d升至4.24 d；預(yù)蛹和蛹的累積死亡率均低于50%，因此無LT50值（表1）。

表1 萊氏綠僵菌菌株CDTLJ1對草地貪夜蛾不同齡期幼蟲、預(yù)蛹和蛹的致死中時Table 1 The median lethal time of M. rileyi strain CDTLJ1 to S. frugiperda larvae, prepupa, and pupa

2.5 萊氏綠僵菌CDTLJ1不同孢子濃度對草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力

萊氏綠僵菌CDTLJ1對草地貪夜蛾3齡幼蟲具有的致病力較高，隨著孢子濃度的增加和處理后時間的推移，草地貪夜蛾3齡幼蟲的累積校正死亡率逐漸升高。孢子濃度1×105、1×106、1×107、1×108孢子/mL處理的3齡幼蟲在處理后第4 d開始出現(xiàn)死亡，1×104孢子/mL處理的幼蟲在處理后第5 d開始出現(xiàn)死亡，隨后校正死亡率迅速升高，1×107、1×108孢子/mL處理的幼蟲累積校正死亡率在處理后第6 d達到100%，1×105、1×106孢子/mL處理的幼蟲累積校正死亡率在處理后第7 d達到100%，1×104孢子/mL處理的幼蟲累積校正死亡率在處理后第8 d最高，為96.67%。應(yīng)用Probit模型，得到萊氏綠僵菌CDTLJ1菌株處理草地貪夜蛾3齡幼蟲后第6 d的致病力回歸方程y＝-3.73＋0.92x（χ2＝0.056，P＝0.91），LC50為1.12×104孢子/mL，95%置信區(qū)間為4.48×103～2.06×104孢子/mL（圖5）。

圖5 萊氏綠僵菌CDTLJ1不同孢子濃度對草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力Fig. 5 The pathogenicity of strain CDTLJ1 with different conidia concentrations against 3rd instar larvae of S. frugiperda

隨著萊氏綠僵菌CDTLJ1孢子濃度的增加，草地貪夜蛾3齡幼蟲的致死中時（LT50）逐漸縮短，孢子濃度在1×104～1×108孢子/mL范圍內(nèi)，LT50從5.93 d降至4.10 d（表2）。

表2 不同孢子濃度下萊氏綠僵菌CDTLJ1對草地貪夜蛾3齡幼蟲的致死時間效應(yīng)Table 2 The median lethal time of M. rileyi strain CDTLJ1 to 3rd instar larvae of S. frugiperda under different conidia concentrations

3 討論

報道的大部分感染草地貪夜蛾的病原真菌菌株僅對草地貪夜蛾卵和低齡幼蟲有較好的防效[16-18]，而對3 齡以上的高齡幼蟲及其他蟲態(tài)的防效不顯著[19,20]。雷妍圓等[19]研究發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌GZSL-1菌株1×108孢子/mL孢子懸浮液對草地貪夜蛾4～6齡幼蟲的死亡率僅分別為57.47%、55.06%和25.28%。Visalakshi等[21]在印度從自然感染的草地貪夜蛾幼蟲僵蟲中分離到1株萊氏綠僵菌，2×108孢子/mL孢子懸浮液處理草地貪夜蛾3齡幼蟲一周后的死亡率為90%。本研究分離到的萊氏綠僵菌CDTLJ1菌株對草地貪夜蛾2～6齡幼蟲均表現(xiàn)出較好的致病力，對預(yù)蛹和蛹也具有一定的致病力，1.2×107孢子/mL處理后第 6 d，2～5齡幼蟲的累積校正死亡率均達100%，6齡幼蟲的累積校正死亡率為98.33%，預(yù)蛹和蛹的累積校正死亡率分別為 28.33%、20.00%。萊氏綠僵菌侵染寄主昆蟲的過程與其他蟲生真菌的相似，包括附著、萌發(fā)、穿透寄主表皮、體內(nèi)增殖發(fā)育并產(chǎn)生毒素，最終導(dǎo)致寄主死亡，菌絲從罹病死亡的蟲體內(nèi)穿透寄主體表產(chǎn)生分生孢子[20,22]。萊氏綠僵菌CDTLJ1菌株對草地貪夜蛾2～6齡幼蟲和預(yù)蛹、蛹表現(xiàn)出不同的致病力，原因可能是預(yù)蛹和蛹的體壁結(jié)構(gòu)或成分影響了病原真菌的侵染和穿透能力[23]。本研究發(fā)現(xiàn)被感染的預(yù)蛹和蛹體表長出的菌絲和孢子均比罹病幼蟲產(chǎn)生的少，原因可能是菌絲難以從體內(nèi)穿透較厚的體壁和蛹殼，僅能從氣門、節(jié)間等部位穿出。彭國雄等[24]研究發(fā)現(xiàn)，金龜子綠僵菌CQMa421和球孢白僵菌ZJU435處理后第5 d，部分蛹體發(fā)黑，菌株ZJU435處理組在保濕培養(yǎng)3～5 d后部分蛹腹節(jié)處有少量菌絲出現(xiàn)，與本研究結(jié)果類似。終上所述，本研究獲得的萊氏綠僵菌CDTLJ1菌株對防控草地貪夜蛾具有良好的應(yīng)用前景，但仍需要進一步開展田間試驗。

萊氏綠僵菌原名萊氏野村菌Nomuraea rileyi[25]，直至2014年，Kepler等[26]經(jīng)過多基因系統(tǒng)分析，并分析綠僵菌屬及相關(guān)近緣屬種的形態(tài)學(xué)特征及寄主的差異，認為野村菌屬Nomuraea應(yīng)歸于綠僵菌屬，因此N. rileyi相應(yīng)改名為M. rileyi。因此，文中構(gòu)建CDTLJ1菌株的系統(tǒng)進化樹中，CDTLJ1菌株與M. rileyi和N. rileyi都在同一進化位置。萊氏綠僵菌的生長及產(chǎn)孢條件較為苛刻，在PDA培養(yǎng)基中生長較為緩慢[16]，且產(chǎn)孢量較少[17]。唐維媛等[27]研究表明，增加光照有利于萊氏綠僵菌產(chǎn)孢，楊淑儀等[28]研究表明蠶蛹粉與酵母提取物聯(lián)合使用對產(chǎn)孢能力有增效作用，且雷妍圓等[17]在 PDA培養(yǎng)基中添加草地貪夜蛾蛹殼可顯著提高菌落生長速度和產(chǎn)孢量。本研究獲得的萊氏綠僵菌CDTLJ1菌株在SMAY培養(yǎng)基上的生長速度也較慢，培養(yǎng)10 d后的菌落直徑也僅為15 mm。因此，要開發(fā)利用該菌，還需對其營養(yǎng)特異性和培養(yǎng)條件等開展相關(guān)的研究。