玉屏蒼耳散對實(shí)驗(yàn)性AR 大鼠維甲酸相關(guān)孤兒核受體γt 及相關(guān)因子表達(dá)的影響

張 田喻國凍顧 平金 瑩

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科,貴陽 550004)

變應(yīng)性鼻炎(AR)是耳鼻喉科常見疾病,發(fā)病率達(dá)30%左右[1-2],且發(fā)病人數(shù)逐年增加[3]。 AR 的主要臨床癥狀為鼻癢、鼻塞、噴嚏、流涕、頭疼等,嚴(yán)重影響患者的身心健康以及日常生活[4]。 然而常規(guī)的西藥或者手術(shù)治療效果不佳,且病情反復(fù),治療瓶頸長期存在[5]。 中醫(yī)認(rèn)為AR 屬“鼻鼽”范疇,中藥治療以益氣固表、宣肺通竅、補(bǔ)益脾腎為主。相關(guān)研究[6]表明：玉屏蒼耳散對于AR 具有顯著的治療效果,可以明顯改善甚至消除AR 的相關(guān)臨床癥狀。 但是關(guān)于玉屏蒼耳散對于AR 的治療作用機(jī)制尚未明確,因此本研究建立實(shí)驗(yàn)性AR 大鼠模型,進(jìn)一步驗(yàn)證了玉屏蒼耳散對實(shí)驗(yàn)性AR 大鼠的治療效果并對其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究,為該藥的應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

11 周齡的SPF 級SD 雄性大鼠,體重(266±15)g,共計(jì)40 只,由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(黔)2018-0001]；依照貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法,室溫下標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水。 飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜明暗各半循環(huán)照明,在22℃～26℃下維持恒定濕度,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物均在本實(shí)驗(yàn)室SPF 級動(dòng)物房飼養(yǎng)[SYXK(黔)2018-0001 ],動(dòng)物的使用及操作按照本院動(dòng)物管理委員會(huì)(IACUC2018-035)的規(guī)定執(zhí)行,并在不影響實(shí)驗(yàn)要求和結(jié)果基礎(chǔ)上,按照3R 原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

玉屏蒼耳散由我院中藥制劑室提供；西替利嗪(國藥準(zhǔn)字H20030191)購買于成都恒瑞制藥有限公司；氫氧化鋁購自天津江天化工試劑有限公司；卵清蛋白(OVA)購買于美國Sigma 公司； cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購買于北京索萊寶科技有限公司；戊巴比妥購買于成都嘉葉生物科技有限公司；白細(xì)胞介素(IL-17)、維甲酸相關(guān)孤兒核受體γt(RORγt)以及白細(xì)胞介素(IL-23)引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成；IL-17、IL-6、TNF-α 以及IL-23酶聯(lián)免疫試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RORγt 免疫組化試劑盒、TRIzol 試劑盒購于美國sigma 公司；RIPA 裂解液I 購于英國Abcam 公司；紫外分 光 光 度 計(jì) (Thermo, 美 國)； 倒 置 顯 微 鏡(OLYMPUS,日本)；超低溫冰箱(Siemens,德國)；高速離心機(jī)(Eppendorf,德國)；切片機(jī)(Leica,德國)；ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀( Applied Biosystems,美國)；多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher,美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及建模

本研究設(shè)置正常組,模型組,治療組,西替利嗪組,每組10 只大鼠。 除正常組外,其余各組在第0、2、4、6、8、0、12 天以及第14 天對于SD 大鼠進(jìn)行腹腔注射1 mL 由20 mg 卵清蛋白與30 mg 氫氧化鋁配置的PBS 混懸液構(gòu)建AR 大鼠模型。 正常組注射等量無菌PBS 溶液。 在第15 ～30 天時(shí)間段,正常組、模型組以5% OVA 生理鹽水100 μL 雙側(cè)滴鼻激發(fā),治療組、西替利嗪組分別以10 g/kg 及西替利嗪2 mg/kg 灌胃給藥,30 min 后以5% OVA 生理鹽水共100 μL 雙側(cè)滴鼻激發(fā),正常組大鼠給予等量的不含OVA 的PBS 溶液,每天1 次。 模型的建立通過大鼠鼻部癥狀評分進(jìn)行檢測：于第一次藥前以及末次給藥后觀察30 min 內(nèi)大鼠鼻竇炎癥狀,評分規(guī)則[7]如表1。 病理評分由2 名經(jīng)過訓(xùn)練的人員分別進(jìn)行評定,若意見不一致,則由第3 名人員進(jìn)行評判。

表1 大鼠鼻部癥狀評分表Table 1 Rating scale of nasal symptoms in rats

1.3.2 大鼠鼻腔黏膜細(xì)胞因子檢測

將各組大鼠處死后分離鼻腔黏膜,加入RIPA裂解10 min,離心5 min,收集上清,采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定各組大鼠鼻粘膜組織中IL-17、IL-23、TNF-α 以及IL-6 的濃度。 根據(jù)試劑盒說明書通過多功能酶標(biāo)儀檢測450 nm 處吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組樣本中IL-17、IL-23、TNF-α 以及IL-6 的濃度。

1.3.3 大鼠鼻黏膜組織HE 檢測

腹腔麻醉后,固定,開胸,用注射器吸取生理鹽水100 mL 進(jìn)行心臟灌注,然后灌注100 mL 4%多聚甲醛固定液,待大鼠肝、脾變色后表示灌注完成,剔除大鼠鼻面部皮膚以及周邊軟組織,取包含鼻黏膜的鼻腔組織,4%甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟切片,蘇木精-伊紅染色,顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.3.4 免疫組化法檢測各組大鼠鼻黏膜中RORγt的表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)染色法(SABC)檢測大鼠鼻黏膜組織中RORγt 的表達(dá)：首先,將標(biāo)本按常規(guī)方法制成石蠟切片,厚度為4 μm,常規(guī)脫蠟,血清封閉,抗原修復(fù)后根據(jù)RORγt 免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作。 待染色完成后,于顯微鏡下觀測并拍照記錄,以棕褐色或者棕黃色反應(yīng)產(chǎn)物為陽性,采用Image J 軟件進(jìn)行光密度分析。

1.3.5 qRT-PCR 檢測

收集各組大鼠鼻黏膜,根據(jù)TRIzol 試劑盒說明書操作,提取總RNA,采用紫外分光光度計(jì)對RNA濃度進(jìn)行檢測。 使用cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 s； 95℃變性55 s； 59℃退火45 s； 70℃延伸60 s,共40 個(gè)循環(huán)。 以β-actin 做為擴(kuò)增內(nèi)參,采用ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 引物 序 列 為, RORγt ( 正 向： 5 ' -CATCTCCAGCCTCAGCTTTGA-3', 反 向： 5 ' -TCCCCCAGAAGTCCTTAAATCC-3')；IL-23(正向：5'- ACACACACCAGTGGGACAAA -3',反向：5'-ACAACCATCACCACACTGGA-3')；IL-17(正向：5'-TCTCTGATGCTGTTGCTGCT-3 ', 反 向： 5 ' -CGTGGAACGGTTGAGGTAGT-3')； β-actin (正 向：5 '-TTCAACGGCACAGTCAAG-3 ', 反 向： 5 '-CCACGACATACTCAGCAC-3')。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用軟件SPSS 21.0、GraphPad Prism 5 進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()來表示,組間采用單因素方差分析,P＜0.05 代表數(shù)據(jù)間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠鼻部癥狀評分檢測

首次給藥前模型組和玉屏蒼耳散組以及西替利嗪組鼻部癥狀評分大于5 分,相比于正常組,鼻部評分顯著升高(P＜0.05)。 末次給藥后,模型組評分顯著高于正常組(P＜0.05),玉屏蒼耳散組以及西替利嗪組顯著低于模型組(P＜0.05),玉屏蒼耳散組與西替利嗪組在評分上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)見表2。

2.2 大鼠鼻黏膜組織炎性細(xì)胞因子檢測

與正常組比較,模型組大鼠鼻黏膜組織中細(xì)胞因子IL-17、IL-23、TNF-α 以及IL-6 明顯增加(P＜0.05)；玉屏蒼耳散組與模型組相比鼻黏膜組織中IL-17、IL-23、TNF-α 以及IL-6 表達(dá)明顯顯著降低(P＜0.05)；玉屏蒼耳散組與西替利嗪組相比,細(xì)胞因子表達(dá)無顯著差異(P＞0.05),見圖1。

表2 各組大鼠鼻部癥狀檢測(n＝10)Table 2 Nasal symptom detection of rats in each group

圖1 各組大鼠鼻黏膜組織細(xì)胞因子分泌情況Note.A, Normal group.B, Model group.C, Yu Pingcanger Powder group.D, Cetirizine group.Compared with the normal group,*P＜0.05.Compared with model group, #P＜0.05.The same as below.Figure 1 Cytokine secretion in nasal mucosa of rats in each group

2.3 大鼠鼻黏膜組織HE 染色

相比于正常組,模型組大鼠鼻黏膜組織中顯著增厚(P＜0.05)；玉屏蒼耳散組與西替利嗪組大鼠相比于模型組,鼻粘膜增厚程度顯著降低(P＜0.05),玉屏蒼耳散組與西替利嗪組相比無顯著性差異(P＞0.05)見圖2。

2.4 各組大鼠鼻粘膜組織RORγt 的表達(dá)

與正常組比較,模型組大鼠鼻粘膜組織RORγt表達(dá)明顯增加(P＜0.05)；與模型組相比,玉屏蒼耳散組與西替利嗪組大鼠鼻粘膜組織RORγt 表達(dá)顯著降低(P＜0.05),玉屏蒼耳散組與西替利嗪組相比RORγt 表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)見圖3。

2.5 qRT-PCR 檢測大鼠鼻黏膜組織RORγt、IL-23、IL-17 mRNA 的表達(dá)

與正常組比較,模型組大鼠鼻黏膜組織RORγt、IL-23 以及IL-17 mRNA 的表達(dá)明顯增加(P＜0.05)；與模型組比較,玉屏蒼耳散組與西替利嗪組大鼠鼻黏膜組織中RORγt、IL-23 以及IL-17 mRNA 的表達(dá)顯著降低(P＜0.05)；玉屏蒼耳散組與西替利嗪組相比無明顯差異(P＞0.05),見圖4。

圖2 各組大鼠鼻黏膜組織HE 染色情況Figure 2 HE staining of nasal mucosa tissues of rats in each group

圖3 各組大鼠鼻黏膜組織RORγt 的表達(dá)Figure 3 Expression of ROR T in nasal mucosa of rats in each group

圖4 各組大鼠RORγt 以及相關(guān)因子的表達(dá)水平Figure 4 Expression levels of ROR T and related factors in each group

3 討論

隨著中醫(yī)藥理論的完善,中藥應(yīng)用于AR 的研究受到眾多研究者的重視與關(guān)注[6-11]。 據(jù)報(bào)道[12],玉屏蒼耳散對于AR 具有一定的治療效果,可明顯改善AR 的臨床癥狀。 但是,玉屏蒼耳散對AR 治療的作用機(jī)制仍不清楚。 在本研究中,建立AR 大鼠模型,結(jié)果顯示模型組大鼠鼻部癥狀檢測評分以及炎性因子水平分泌顯著高于正常組,證明模型建立成功。 給予玉屏蒼耳散治療后,相比于模型組大鼠,玉屏蒼耳散組大鼠的評分以及炎性因子分泌水平顯著降低,表明玉屏蒼耳散對于AR 大鼠具有明顯的治療作用。

近年來,Th17 細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)并被廣泛研究報(bào)道,相關(guān)研究[13-15]表明Th17 細(xì)胞參與某些過敏性疾病的發(fā)生與發(fā)展。 有研究[16]發(fā)現(xiàn)在AR 鼻粘膜中Th17 明顯升高。 Th17 主要分泌細(xì)胞因子IL-17,IL-17 具有促炎作用,可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α 等的分泌,引發(fā)組織細(xì)胞的炎性浸潤,造成組織損傷[17]。 本研究中,模型組大鼠炎癥因子TNFα、IL-6 表達(dá)顯著升高,玉屏蒼耳散顯著降低鼻黏膜部位的炎癥因子IL-6、TNF-α 的水平,證明玉屏蒼耳散可改善AR 大鼠鼻部組織的炎性浸潤,發(fā)揮治療作用。 IL-23 作為IL-12 家族的一員,可促進(jìn)Th17細(xì)胞分泌IL-17 等細(xì)胞因子發(fā)揮生物學(xué)功能,IL-23參與Th17 的擴(kuò)增與存活,是維持Th17 存活的重要因子[18-19]。 模型組大鼠鼻粘膜部位的IL-23 以及IL-17 表達(dá)水平顯著高于正常大鼠,玉屏蒼耳散組表達(dá)水平明顯降低。

RORγt 是Th17 細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子,RORγt在預(yù)防免疫激活和抑制炎性病變中至關(guān)重要[20],在過敏性疾病、感染以及自身免疫病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[21-22]。 在本研究中,模型組大鼠鼻黏膜RORγt 以及相關(guān)因子IL-23 和IL-17 的mRNA 表達(dá)顯著高于正常組,說明RORγt、IL-23 和IL-17 參與過敏性鼻炎的發(fā)展。 玉屏蒼耳散中的中藥成分對于機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)已有報(bào)道,劉慧等[23]在研究治療膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠的機(jī)制中發(fā)現(xiàn),黃芪糖蛋白能夠降低RORγt 的表達(dá)水平,恢復(fù)Th17 與Treg 細(xì)胞之間的平衡。 另有報(bào)道稱[24],金銀花可通過下調(diào)鼻黏膜RORγt 表達(dá)水平,糾正其失衡,并抑制IL-17產(chǎn)生,從而緩解鼻部炎性反應(yīng)。 本研究中玉屏蒼耳散組大鼠RORγt 以及相關(guān)因子表達(dá)明顯降低,揭示了玉屏蒼耳散可以通過抑制RORγt、IL-23 的表達(dá),從而抑制TH17 細(xì)胞擴(kuò)增與存活,進(jìn)而降低IL-17 的分泌,抑制炎性的浸潤,從而發(fā)揮對AR 的治療作用。

綜上所述,本研究通過建立AR 大鼠模型驗(yàn)證了玉屏蒼耳散抑制RORγt 以及相關(guān)因子IL-17、IL-23 的表達(dá),從而發(fā)揮對AR 的治療作用。 由于AR發(fā)病因素復(fù)雜,病情發(fā)展過程受眾多因素調(diào)控。 因此玉屏蒼耳散對于AR 的作用機(jī)制有待深入研究。