DOX 調(diào)控HNRNPK 穩(wěn)定下調(diào)的H1299 細(xì)胞株的構(gòu)建與研究

李夢媛楊星九張文龍李維莎曹 琳劉宏飛高 苒

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,國家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心,北京 100121)

核不均一核糖核蛋白 K (heterogeneous nuclearribonucleoprotein K,HNRNPK)是hnRNPs 家族成員之一,其基因位于人第9 號(hào)染色體q21.32 ～q21.33,序列高度保守,含有3 個(gè)K 同源區(qū)(K homologue, KH),每個(gè)K 同源區(qū)由65～70 個(gè)氨基酸組成,該區(qū)域能夠與RNA 和DNA 結(jié)合并相互作用[1-2]。 HNRNPK 還含有一個(gè)核定位信號(hào)(nuclear localization signals, NLS)以及一個(gè)核穿梭結(jié)構(gòu)域(nuclear shuttling domain, KNS)[3]； NLS 調(diào) 節(jié)HNRNPK 從胞漿到核的轉(zhuǎn)運(yùn),KNS 則通過核孔復(fù)合物調(diào)節(jié)雙向穿梭[4]。 HNRNPK 特殊的分子結(jié)構(gòu)使其能夠參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA 加工與翻譯以及轉(zhuǎn)錄后修飾等多種細(xì)胞進(jìn)程[5]。 大量研究顯示HNRNPK與目前威脅人類生命的腫瘤疾病密切相關(guān),多種腫瘤的形成和發(fā)展都與該家族蛋白有關(guān)[1]。

HNRNPK 在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性肺癌中高表達(dá)[6],而其在多種腫瘤中的高表達(dá)通常與不良預(yù)后相關(guān)[7-8]。 然而HNPNPK 在肺癌中的具體作用機(jī)制仍然未知,需要進(jìn)一步研究。 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了熒光素酶標(biāo)記的由強(qiáng)力霉素(doxycycline, DOX) 調(diào)控HNRNPK 穩(wěn)定下調(diào)的H1299 細(xì)胞株,旨在為進(jìn)一步研究HNRNPK 在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

H1299 細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.2 主要試劑與儀器

PBS、RPMI 1640 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清等購自美國Gibco 公司；D-Luciferin 購自北京泛博生物化學(xué)有限公司；TRIzol 試劑購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、購蛋白預(yù)染Marker 自Thermo Fisher 公司；SYBR green 熒光染料購自日本Toyobo公司；定量PCR 專用96 孔板購自ABI 公司；HNRNPK 抗體購自Abcam 公司；p53、p21、CCND1抗體購自CST 公司；Rb、磷酸化Rb、CDK4、Cyclin-D1 等抗體購自Santa Cruz 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購自中杉金橋生物公司；CCK-8 細(xì)胞活性檢測試劑盒、Annexin V(633)凋亡檢測試劑盒購自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司；嘌呤霉素購自Merk公司；DOX 由上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司提供。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀為BIO-RADCFX Connect Real-Time PCR System； 酶 標(biāo) 儀 為 BIORADiMarkMicroplate Reader； 流 式 細(xì) 胞 儀 為 BD FACSAria II Cell Sorter；活體光學(xué)成像系統(tǒng)為IVISLumina II。

引物合成與DNA 測序服務(wù)由英濰捷基(上海)公司提供。 HNRNPK 的siRNA 由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì),序列如表1 所示,帶有DOX 識(shí)別位點(diǎn)的干擾慢病毒載體由上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司構(gòu)建。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 病毒感染與穩(wěn)轉(zhuǎn)株的篩選

慢病毒的轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照吉?jiǎng)P基因慢病毒使用操作手冊進(jìn)行。 復(fù)蘇并培養(yǎng)H1299 細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)。 將其制備成每毫升5×104個(gè)細(xì)胞濃度的懸液,接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板。 37℃培養(yǎng)18 h 后,稀釋病毒至MOI＝10,感染細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)8 h,觀察細(xì)胞狀態(tài)并更換培養(yǎng)基。 感染病毒72 h 后,用6 μg/mL 嘌呤霉素篩選細(xì)胞48 h,在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài),將陽性細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),并用3 μg/mL嘌呤霉素維持培養(yǎng)。

1.3.2 DOX 誘導(dǎo)后H1299 細(xì)胞的生長狀態(tài)

將篩選后的細(xì)胞制備成每毫升5×104個(gè)細(xì)胞濃度的懸液,每孔100 μL 接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板。繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h,待細(xì)胞貼壁后用工作濃度為5 μg/mL 的DOX 誘導(dǎo)細(xì)胞,37℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h。 在顯微鏡下觀察DOX 誘導(dǎo)前后細(xì)胞的生長狀態(tài)。

1.3.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)株熒光素酶活性的檢測

慢病毒載體帶有熒光素酶表達(dá)序列,檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)株中熒光素酶的活性。 用無菌ddH2O 溶解DLuciferin 干粉,并用0.22 μm 濾膜過濾除去雜質(zhì),儲(chǔ)備液濃度為30 mg/mL,分裝后于-20℃冰箱保存。用37℃預(yù)熱好的完全培養(yǎng)基按體積比1 ∶200 稀釋D-Luciferin 儲(chǔ)備液,配制成終濃度為150 μg/mL 的工作液。 去除步驟1.3.2 中細(xì)胞的培養(yǎng)上清,按100 μL/孔加入D-Luciferin 工作液,避光孵育10 min后,進(jìn)行圖像分析。

1.3.4 Real-time PCR 檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)株HNRNPK 的表達(dá)效率

將細(xì)胞制備成每毫升5×104個(gè)細(xì)胞濃度的懸液,每孔1 mL 接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h,待細(xì)胞貼壁后用0 ～10 μg/mL 不同濃度的DOX 誘導(dǎo)細(xì)胞,37℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

依據(jù)TRIzol 試劑與反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟收集各孔細(xì)胞并提取獲得細(xì)胞的總RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。 應(yīng)用Real-time PCR 進(jìn)行檢測,并通過閾值循環(huán)數(shù)計(jì)算各組細(xì)胞中HNRNPK 的相對表達(dá)量。 實(shí)驗(yàn)中,GAPDH 與HNRNPK 基因的上下游引物序列如表2 所示,反應(yīng)體系的成分配制如表3 所示,設(shè)定反應(yīng)程序：95℃3 min；95℃10 s,60℃30 s,擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線為60℃～95℃升溫。 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后通過HNRNPK 的相對表達(dá)量找出DOX 誘導(dǎo)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株穩(wěn)定下調(diào)HNRNPK 的最佳濃度。

1.3.5 Western blot 檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)株HNRNPK 的表達(dá)水平

將細(xì)胞制備成每毫升5×104個(gè)細(xì)胞濃度的懸液,每孔1 mL 接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h,待細(xì)胞貼壁后用工作濃度為5 μg/mL 的DOX誘導(dǎo)細(xì)胞,37℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

收集培養(yǎng)板中各孔的細(xì)胞,通過RIPA 裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白,檢測并調(diào)整各組細(xì)胞的蛋白濃度。 配制濃度為12%的分離膠,進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。 然后,按300 mA 電流強(qiáng)度進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,將蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。 用含5%脫脂奶粉的封閉液于室溫封閉PVDF 膜1 h,以減少非特異性結(jié)合。 隨后按1 ∶1000 的比例稀釋HNRNPK 抗體,于4℃孵育PVDF 膜。 次日,用0.1%的PBST 洗膜3 次,加入稀釋比例為1 ∶10000 的HRP 標(biāo)記的IgG,于室溫孵育1 h。 再次洗膜3 次后加顯影液,觀測各組蛋白條帶的大小與位置。

1.3.6 HNRNPK 下調(diào)對H1299 細(xì)胞增殖的影響

制備細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù),按3×103個(gè)/孔將細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,37℃培養(yǎng)6 ～8 h,待細(xì)胞貼壁后用工作濃度為5 μg/mL 的DOX 溶液持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞。 接種當(dāng)天待細(xì)胞貼壁后,取一組細(xì)胞培養(yǎng)上清,按CCK-8：培養(yǎng)上清體積比為1 ∶100 的比例加入CCK-8, 在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h,觀察顯色程度,用酶標(biāo)儀測定其在450 nm 波長處的吸光度,其后每隔24 h 檢測一次培養(yǎng)上清的OD450,直至第96 h。

1.3.7 HNRNPK 下調(diào)對H1299 細(xì)胞凋亡的影響

將細(xì)胞制備成每毫升5×104個(gè)細(xì)胞濃度的懸液,每孔2 mL 接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h,待細(xì)胞貼壁后用工作濃度為5 μg/mL 的DOX誘導(dǎo)細(xì)胞,37℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

細(xì)胞凋亡的檢測嚴(yán)格按照AnnexinV(633)凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行。 收集6 孔板中的細(xì)胞,用適量的培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中,1000 r/min 離心3 min,棄去上清。 加入PBS 溶液離心洗滌細(xì)胞兩次,用100 μL 稀釋好的1×Annexin V Binding Solution 重懸細(xì)胞,分別向細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin V(APC)結(jié)合物與5 μL PI Solution(PE),室溫下避光孵育15 min。 加入400 μL 1×Annexin V Binding Solution,通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測。

1.3.8 HNRNPK 下調(diào)對H1299 細(xì)胞周期的影響

培養(yǎng)、收集細(xì)胞步驟同1.3.7。 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次,然后用70%的乙醇固定細(xì)胞。 加入PBS 離心洗滌除去乙醇后,加入含0.1%RNaseA 的PI 染液,室溫避光染色30 min,通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.3.9 HNRNPK 下調(diào)對H1299 細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)通路的影響

步驟同1.3.5,檢測p53、p21、CCND1、Rb、p-Rb、Cyclin-D1、CDK4 等蛋白的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism V.5.0 軟件,計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)以及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DOX 誘導(dǎo)HNRNPK 下調(diào)后H1299 細(xì)胞的生長狀態(tài)

細(xì)胞狀態(tài)如圖1 所示,感染病毒的H1299 細(xì)胞與對照組細(xì)胞在大小、形態(tài)上并無明顯差異。 但DOX 誘導(dǎo)48 h 后二者的生長密度明顯不同,可能在HNRNPK 下調(diào)后,H1299 細(xì)胞的增殖速度受到了影響。

2.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)株熒光素酶活性的檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示,與未感染慢病毒的H1299 細(xì)胞對比,空白對照病毒組與HNRNPK 干擾病毒組的細(xì)胞均具備熒光素酶活性,能夠發(fā)出明顯的熒光。

2.3 H1299 穩(wěn)轉(zhuǎn)株HNRNPK 的表達(dá)效率

定量PCR 結(jié)果如圖3A 所示,經(jīng)不同濃度的DOX 誘導(dǎo)48 h 后,H1299 穩(wěn)轉(zhuǎn)株中HNRNPK 的mRNA 表達(dá)水平明顯下調(diào)。 在DOX 濃度為5 μg/mL 與10 μg/mL 時(shí),HNRNPK 的mRNA 表達(dá)水平能夠下調(diào)約65%～70%,且在這兩個(gè)濃度下HNRNPK的相對表達(dá)量并無顯著差異,表明DOX 誘導(dǎo)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中HNRNPK 下調(diào)的最佳濃度為5 μg/mL。Western blot 結(jié)果如圖3B 所示,在5 μg/mL 的DOX誘導(dǎo)48 h 后,H1299 穩(wěn)轉(zhuǎn)株中HNRNPK 的蛋白表達(dá)也被下調(diào)。

2.4 HNRNPK 下調(diào)對H1299 細(xì)胞增殖的影響

通過CCK-8 細(xì)胞活性檢測試劑盒檢測細(xì)胞增殖,結(jié)果如圖4 所示,在DOX 的誘導(dǎo)下,HNRNPK穩(wěn)定下調(diào)的H1299 細(xì)胞增殖速度明顯減慢,與對照組比較,二者有顯著差異,表明HNRNPK 下調(diào)能夠抑制H1299 細(xì)胞的增殖。

2.5 HNRNPK 下調(diào)對H1299 細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)DOX 誘導(dǎo)細(xì)胞48 h 后,通過Annexin V(633)凋亡檢測試劑盒檢測凋亡細(xì)胞數(shù)量。 結(jié)果如圖5 所示,HNRNPK 穩(wěn)定下調(diào)的H1299 細(xì)胞的凋亡數(shù)量與對照組比較,并無顯著差異,表明HNRNPK下調(diào)對H1299 細(xì)胞的凋亡沒有明顯影響。

2.6 HNRNPK 下調(diào)對H1299 細(xì)胞周期的影響

通過PI 染色檢測細(xì)胞周期,結(jié)果如圖6 所示,HNRNPK 下調(diào)后,G0/G1期細(xì)胞的百分比明顯高于對照組,S 期細(xì)胞的百分比則明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；G2/M 期細(xì)胞的百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 表明HNRNPK 的下調(diào)抑制了H1299 細(xì)胞從G0/G1期向S 期發(fā)展的周期進(jìn)程。

2.7 HNRNPK 下調(diào)對H1299 細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)通路的影響

經(jīng)DOX 誘導(dǎo)細(xì)胞48 h 后,通過Western blot 檢測細(xì)胞中p53、p21 等蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果如圖7所示,H1299 作為p53 缺失的細(xì)胞株,細(xì)胞中檢測不到p53 表達(dá)；而在HNRNPK 表達(dá)下調(diào)后,p21 的表達(dá)水平上調(diào),CCND1 與Cyclin-D1 的表達(dá)水平下調(diào)；CDK4 與Rb 蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化,但Rb蛋白的磷酸化水平下調(diào)。

表1 siRNATable 1 siRNA

表2 Real-time PCR 引物序列Table 2 Primer sequences for the Real-time PCR assay

圖1 DOX 誘導(dǎo)后H1299 細(xì)胞的生長狀態(tài)Note.A, Group of LV-NC-RNAi.B,Group of LV-HNRNPK-RNAi.C, Group of LV-NC-RNAi after 48 h.D,Group of LV-HNRNPK-RNAi after 48 h.Figure 1 Cellular states of H1299 cells after DOX induction

表3 Real-time PCR 反應(yīng)體系Table 3 Real-time PCR reaction components

圖2 穩(wěn)轉(zhuǎn)株熒光素酶活性的檢測Figure 2 Detection of luciferase in stable transgenic cell line

圖3 不同劑量DOX 誘導(dǎo)HNRNPK 下調(diào)的表達(dá)效率(n＝3)Note.A, qPCR.B, Western blot.Compared with the control group, ***P＜0.001.Figure 3 HNRNPK downregulated by different doses of DOX

3 討論

圖4 HNRNPK 下調(diào)對H1299 細(xì)胞增殖的影響Note.Compared with the control group,n ＝3,**P＜0.01,***P＜0.001.Figure 4 Effects on H1299 cells proliferationof HNRNPK downregulation

目前,大量研究已證實(shí)HNRNPK 在各種腫瘤組織中高表達(dá),且與口腔鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、鼻咽癌及黑色素瘤等的預(yù)后呈負(fù)相關(guān),但其對于肺癌與肝癌的預(yù)后情況仍然未知[9-10]。 HNRNPK 的異常表達(dá)在不同腫瘤中發(fā)揮的功能也各不相同。 Gallardo 等[11]通過構(gòu)建HNRNPK 基因敲除雜合子(Hnrnpk+/-)小鼠,證實(shí)HNRNPK 在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用。 Huang 等[12]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的HNRNPK 能夠通過調(diào)節(jié)p53 相關(guān)信號(hào)通路抑制胃癌。 Li 等[13]研究發(fā)現(xiàn)HNRNPK 在神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的腫瘤中高表達(dá)并伴有不良預(yù)后。 非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung carcinom,NSCLC)是最常見的肺癌類型,是我國城市人口惡性腫瘤死亡的主要原因[14]。 陳燕等[6]發(fā)現(xiàn)HNRNPK 在肺癌原發(fā)灶及支氣管切緣組肺癌組織中高表達(dá),而在正常組織及炎性對照組中的表達(dá)率則相對較低。 同時(shí),HNRNPK 在肺癌轉(zhuǎn)移及浸潤組織中高陽性表達(dá),提示HNRNPK 的高表達(dá)可能與肺癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)。 然而,HNPNPK 在肺癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制尚不完全清楚。

圖5 HNRNPK 下調(diào)對H1299 細(xì)胞凋亡的影響Note.A, Group of LV-NC-RNAi.B, Group of LV-HNRNPK-RNAi.C, Percent of apoptotic cells.Compared with the control group,n ＝3.Figure 5 Effects on H1299 cells apoptosis of HNRNPK down regulation

圖6 HNRNPK 下調(diào)對H1299 細(xì)胞周期的影響(n＝3)Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Figure 6 Effects on cell cycle of HNRNPK downregulation in H1299 cells

圖7 HNRNPK 下調(diào)對H1299 細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)通路的影響Figure 7 Effects on proliferation relatedsignalingpathwaysof HNRNPK downregulationin H1299 cells

HNRNPK 在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中參與調(diào)控癌基因與抑癌基因的表達(dá),并參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移與侵襲等多種生物學(xué)過程[9]。Huang 等[12]研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的HNRNPK 能夠通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p53/p21/Cyclin-D1 抑制胃癌細(xì)胞增殖與腫瘤生長。 Chen 等[15]研究顯示HNRNPK 能夠通過調(diào)控Cyclin-D1 與細(xì)胞周期G0/G1期開關(guān)蛋白2 等促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖。HNRNPK 作為轉(zhuǎn)錄因子能夠與eIF4E 的啟動(dòng)子結(jié)合,同時(shí)與p21 mRNA 的3′端非翻譯區(qū)域結(jié)合,以此抑制p21 翻譯,進(jìn)而促進(jìn)翻譯起始、細(xì)胞分裂和腫瘤形成[7,16]。 此外,在多種腫瘤組織中,HNRNPK 的高表達(dá)通常伴隨著高水平的c-myc,HNRNPK 能夠通過與c-myc 啟動(dòng)子的poly(C)結(jié)合促進(jìn)c-myc 轉(zhuǎn)錄,參與腫瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控[5]。 因此,HNRNPK能夠通過多種途徑參與腫瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控。HNRNPK 也能夠通過多種途徑參與腫瘤細(xì)胞的凋亡調(diào)控。 Chen 等[17]的研究中發(fā)現(xiàn)HNRNPK 能夠通過調(diào)節(jié)下游的抗凋亡基因發(fā)揮抗凋亡活性,HNRNPK 在鼻咽癌細(xì)胞中能夠與抗凋亡基因FLIP的啟動(dòng)子結(jié)合并導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄激活。 Yang 等[18]的研究發(fā)現(xiàn)HNRNPK 第296 與299 位精氨酸的甲基化能夠抑制促凋亡激酶PKCδ 介導(dǎo)的第302 位絲氨酸磷酸化,進(jìn)而抑制DNA 損傷誘導(dǎo)的凋亡。 HNRNPK作為p53 的共激活因子對調(diào)節(jié)DNA 損傷修復(fù)起重要作用,DNA 損傷促使HNRNPK 被募集到p53 下游基因的啟動(dòng)子,促使p21、HDM2、C/EBPα 和C/EBPβ 表達(dá)；HNRNPK 的下調(diào)減少p53 轉(zhuǎn)錄,從而導(dǎo)致DNA 損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯[19]。

本實(shí)驗(yàn)中成功構(gòu)建了熒光素酶標(biāo)記的由DOX調(diào)控HNRNPK 穩(wěn)定下調(diào)的H1299 細(xì)胞株,能夠通過DOX 選擇性地誘導(dǎo)細(xì)胞在特定時(shí)間點(diǎn)下調(diào)HNRNPK 表達(dá)。 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1299 來源于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,其均一性地缺失p53 蛋白表達(dá)[20]。已有研究證實(shí)HNRNPK 能夠與p21 mRNA 的3′端非翻譯區(qū)域結(jié)合,抑制p21 翻譯,從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生[7]。 癌基因CCND1 能夠編碼G1/S-特異性周期蛋白Cyclin-D1,其能夠通過與p21 相互作用使細(xì)胞周期進(jìn)程從G1期向S 期發(fā)展。 Cyclin-D1 的主要功能是促進(jìn)細(xì)胞增殖,其過度表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞失控或癌變。 Cyclin-D1 能夠結(jié)合并激活G1期特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4,CDK4 能夠磷酸化G1期周期抑制蛋白R(shí)b,使其從所結(jié)合的E2F1 轉(zhuǎn)錄因子上解離,釋放E2F1,推動(dòng)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期,促進(jìn)細(xì)胞增殖[21]。 本實(shí)驗(yàn)中,HNRNPK 的下調(diào)使得p21 的表達(dá)升高,CCND1 與Cyclin-D1 的表達(dá)降低,從而使Rb 蛋白的磷酸化受到抑制,進(jìn)一步抑制細(xì)胞周期進(jìn)程從G1期向S 期發(fā)展。 因此,通過DOX 誘導(dǎo)HNRNPK 表達(dá)水平下調(diào),可能通過調(diào)控p21 及其相關(guān)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的信號(hào)通路,從而抑制了H1299 細(xì)胞的增殖。 本實(shí)驗(yàn)中,HNRNPK 的下調(diào)對H1299 細(xì)胞的凋亡沒有明顯影響,可能是由于H1299 細(xì)胞本身缺失p53 蛋白表達(dá), 導(dǎo)致HNRNPK 表達(dá)下調(diào)后無法通過p53 及其下游信號(hào)通路參與細(xì)胞周期調(diào)控,因而不能引發(fā)細(xì)胞凋亡。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)中HNRNPK 的下調(diào)抑制了肺癌細(xì)胞的增殖,結(jié)合以往的研究[6,11-13],證實(shí)HNRNPK在肺癌中的高表達(dá)可能發(fā)揮著促進(jìn)肺癌發(fā)展的作用,并進(jìn)一步說明HNRNPK 的異常表達(dá)可能有著雙重功能,其在不同種類的腫瘤中能夠產(chǎn)生不同的影響。 此外,H1299 細(xì)胞中插入了熒光素酶表達(dá)序列,使其能夠在生物體內(nèi)標(biāo)記并跟蹤腫瘤細(xì)胞的成瘤部位、腫瘤大小與轉(zhuǎn)移情況,通過活體成像實(shí)時(shí)觀測腫瘤在生物體內(nèi)的發(fā)展,一方面為研究HNRNPK在肺癌發(fā)生發(fā)展中的功能與機(jī)制提供了更便利的條件,同時(shí)也為抗腫瘤相關(guān)的基礎(chǔ)研究與臨床研究提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。