葫蘆素B抑制CIP2A/AKT表達抗非小細胞肺癌的作用

王菊輝 丘韶校 徐羽中 李元廣 何 臣

肺癌是全世界癌癥死亡的主要原因,其最常見的病理類型非小細胞肺癌(NSCLC),占所有病例的83%[1]。近年來肺癌治療取得了長足的發(fā)展,但肺癌死亡率仍居高不下,肺癌的整體治療效果仍較差,非小細胞肺癌5年相對存活率僅為23%[2]。探討新的肺癌治療藥物及其作用機制已成為肺癌治療的突破點。PP2A的內(nèi)源性癌性抑制劑CIP2A是一種人類癌蛋白，在多種人類惡性腫瘤的增殖和侵襲中起重要作用[3]，研究表明，CIP2A可促進不依賴貼壁的細胞生長和體內(nèi)腫瘤形成，并在結(jié)腸及頭頸部惡性腫瘤中過表達[4]。且其過表達與腫瘤侵襲，轉(zhuǎn)移和患者生存相關(guān)[5]。在肺癌標(biāo)本中及人肺癌細胞株中也被證明存在CIP2A的過表達，并且CIP2A的過表達與肺癌患者預(yù)后相關(guān)[6]。CIP2A 抑制抑癌蛋白PP2A的表達使AKT的磷酸化(pAkt)下降，從而促進了腫瘤的增殖和進展[7]。在骨肉瘤細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞等多種腫瘤細胞的研究中被證實[8]。在阿曼托雙黃酮及氯硝柳胺作為CIP2A的癌性抑制劑的實驗中發(fā)現(xiàn)其可促進非小細胞肺癌細胞凋亡[9,10]，從而發(fā)揮抗癌作用。葫蘆素B ( Cucurbitacin B )是葫蘆素家族中含量最豐富的成員，其抗腫瘤作用是近年來的研究重點，既往的多項研究顯示葫蘆素B可能通過抑制多種細胞信號傳導(dǎo)通路來抑制腫瘤生長和促進腫瘤細胞凋亡[11]，但其在不同腫瘤細胞中機制并不完全相同。在多柔比星耐藥乳腺癌細胞[12]、耐藥胃癌細胞[13]、多形性膠質(zhì)母細胞瘤[14]中發(fā)現(xiàn)葫蘆素B通過抑制CIP2A下調(diào)pAkt的表達，加速了腫瘤細胞的凋亡。綜上，葫蘆素B在多種腫瘤細胞中通過抑制CIP2A下調(diào)癌癥相關(guān)信號通路AKT的表達，促進腫瘤細胞凋亡，但葫蘆素B在非小細胞肺癌中是否存在相同機制尚需進一步研究，在本研究中我們探討了葫蘆素B通過CIP2A/AKT對非小細胞肺癌A549細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

非小細胞肺癌 A549 細胞購于中國科學(xué)院上海細胞庫；葫蘆素 B、MTS、DMSO購自美國Sigma公司；胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司；PP2A 酶活性檢測試劑盒購自 Upstate 公司；抗體購自美國Cell Signaling公司；二氧化碳恒溫細胞培養(yǎng)箱購自美國Hera-eus公司；超凈臺購自蘇州凈化設(shè)備廠；細胞計數(shù)板上海醫(yī)用儀器公司；臺式高速離心機購自上海安亭科學(xué)儀器廠；酶標(biāo)儀購自芬蘭Labsystem公司；垂直電泳儀購自美國Biorad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞傳代培養(yǎng) 參考文獻[15]進行實驗，實驗方法簡述如下：用培養(yǎng)液(10%胎牛血清+RPMI1640)培養(yǎng)肺腺癌A549細胞，將細胞置于溫度：37℃，濕度：飽和，CO2濃度5%的培養(yǎng)箱中。觀察細胞生長情況，當(dāng)細胞生長至80%融合時進行一次傳代，在本次實驗中選用生長良好的對數(shù)生長期細胞，實驗重復(fù)3次[15]。

1.2.2 MTS法檢測細胞增殖 參照文獻[15]方法進行，簡述如下：將已用胰酶消化,離心后的A549細胞制成濃度為3×104個/ml的細胞懸液，以每孔100 μl在96孔培養(yǎng)板中加入細胞懸液，觀察細胞貼壁后加入不同濃度的葫蘆素B儲存液,使其終濃度分別為0、20、40、80 nmol/l,試劑對照組及細胞對照組均設(shè)置3個復(fù)孔，并在條件為37℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24、48 h后在96孔培養(yǎng)板中加入MTS溶液，每孔10 μl，孵育4 h，在酶標(biāo)儀上490 nm處檢測OD值，計算細胞存活率[存活率=1-(對照組-實驗組)/對照組]×100%。

1.2.3 劃痕實驗檢測細胞遷移 在6孔板上平鋪細胞密度為5×105個/ml的A549細胞，每孔500 μl，同時加入含RPMI 1640培養(yǎng)液，其中含10%胎牛血清，在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h，觀察是否形成單層細胞。用marker筆在細胞呈單層生長的6孔板背后，用直尺均勻劃間隔約0.5 cm的橫線，直線橫穿過孔，用PBS清洗3次,隨后分別加入終濃度為0、20、40、80 nmol/l葫蘆素B,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，在0 h、24 h、48 h拍照取樣。取樣后圖片用Image J軟件處理，隨機在細胞邊緣劃取6條直線，計算兩直線間距離，計算均值后代表細胞遷移距離。

1.2.4 PI染色法檢測細胞周期 參照文獻[15]，取胰酶消化,離心后的A549細胞，以濃度為5×105個/ml制成細胞懸液，在6孔板中接種細胞懸液，2 ml/孔，在同上所述相同條件下培養(yǎng)24 h；更換培養(yǎng)基，加入終濃度為0、20、40、80 nmol/l及DMSO對照的葫蘆素B，繼續(xù)在相同條件分別培養(yǎng)2 h、48 h。將以上所得細胞制成細胞懸液，細胞濃度為5×105個/ml，取細胞懸液1 ml離心(2000 rpm)，棄去上清液后加入1 ml PBS液，繼續(xù)2000 rpm離心2次，每次2 min，棄去上清，加入-20 ℃70%乙醇3 ml，混勻后，4℃固定過夜，2000 rpm離心2 min，棄去上清，加入1 ml PBS液重懸細胞；再次2000 rpm離心2 min，棄上清，加入濃度為100 mg/ml的PI染液500 μl，其中含50 μg/ml RNA酶；經(jīng)30 min避光染色后上機用流式細胞儀檢測，所得結(jié)果用Multicycle軟件進行分析。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 參照文獻[15]，用不含EDTA的胰酶消化細胞后，1500 rpm，離心3 min，去除上清液后，用PBS液洗滌1遍，用PBS重懸細胞離心細胞，取含5×105個細胞的細胞懸液，離心后棄去上清后加入Binding buffer 500 μl重懸細胞，加入5 μl Annexin V-APC，混勻細胞后，加入7-AAD染液5 μl，再次混勻，在室溫避光環(huán)境下反應(yīng)10 min，置于冰上1 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測。

1.2.6 Westem blot法檢測CIP2A、P-AKT、AKT表達 取已消化離心處于對數(shù)生長期的A549細胞，配成細胞濃度為5×105個/ml的細胞懸液，在10 cm培養(yǎng)基上接種細胞懸液10 ml，觀察細胞生長至80%時，換用含40 nmol/l、80 nmol/l葫蘆素B及DMSO對照的完全培養(yǎng)基培養(yǎng),分成24 h組、48 h組，收集經(jīng)上訴處理后的細胞，加入PIRA裂解液裂解冰浴，每分鐘12000 r，4℃環(huán)境下離心10 min，取離心后上清液，BCA法測定蛋白濃度，加入同體積的SDS，混合震蕩均勻，在99 ℃環(huán)境下煮5 min，使蛋白變性。經(jīng)SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜后5%牛奶封閉，一抗在4 ℃下孵育過夜，HRP(辣根過氧化物酶)標(biāo)記后的二抗在室溫下2 h孵育，ECL發(fā)光盒顯影檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 葫蘆素B對A549細胞增殖的抑制作用

根據(jù)MTS結(jié)果可知，濃度不同的葫蘆素B處理A549細胞24 h及48 h后均對細胞的增殖存在抑制作用，且細胞存活數(shù)與藥物濃度及作用時間呈負相關(guān)。經(jīng)ANOVA方差后，P<0.05。用LSD-t檢驗后示不同試劑及不同時間分組與對照組間均存在有顯著性意義(P<0.05)，且在80 nmol/l、48 h組時存活率達最低，為54.8%(其中P<0.0001)，綜上提示葫蘆素B以劑量、時間依賴性抑制A549細胞的增殖(表1)。

表1 不同濃度葫蘆素B作用A549細胞不同時間后細胞存活率檢測

2.2 葫蘆素B對A549細胞遷移的抑制作用

濃度不同的葫蘆素B處理A549細胞24h及48h后與對照組相比對細胞的遷移能力存在抑制作用，且細胞遷移距離與藥物濃度及作用時間一定程度上呈負相關(guān)，且在48 h 80 nmol/l時達到最小遷移距離,此結(jié)果提示葫蘆素B以劑量及時間依賴性抑制A549細胞遷移，見圖1。

圖1 不同濃度葫蘆素B作用A549細胞不同時間后的遷移距離

2.3 葫蘆素B對A549細胞周期分布的影響

濃度不同的葫蘆素B處理A549細胞24h及48h后經(jīng)流式檢測：隨著濃度梯度的增大及作用時間的延長，處于G2/M期細胞的比例逐漸增加，顯示葫蘆素B導(dǎo)致A549細胞G2/M期阻滯，且與作用濃度及時間呈正相關(guān)，見圖2。

圖2 不同濃度葫蘆素B作用A549細胞不同時間后細胞周期分布

2.4 流式細胞儀檢測葫蘆素B對A549細胞凋亡的影響

濃度不同的葫蘆素B處理A549細胞24 h及48 h后經(jīng)流式檢測顯示葫蘆素B促進細胞的凋亡，且葫蘆素B的濃度及作用時間與細胞凋亡呈正相關(guān),在48 h，濃度為80 nmol/l時達到最大細胞凋亡率32.1%,與對照組相比具有顯著差異,見圖3。

圖3 不同濃度葫蘆素B作用A549細胞不同時間后細胞凋亡影響

2.5 葫蘆素B作用于A549細胞后對CIP2A、PAKT、AKT蛋白表達的影響

Western blot檢測葫蘆素B在40 nmol/l濃度下，作用A549細胞24 h及48 h后對CIP2A、PAKT、AKT表達的影響，結(jié)果顯示與對照組相比，CIP2A、PAKT表達顯著下降，且隨著作用時間的延長，CIP2A、PAKT的表達隨之下降。表明葫蘆素B可抑制CIP2A的表達，從而抑制AKT的活化，且呈現(xiàn)時間依賴性，見圖4。

圖4 Western Blot檢測40 nmol/l葫蘆素B作用A549細胞不同時間后對蛋白表達的影響

3 討論

近年來,隨著中醫(yī)藥的發(fā)展,越來越多的中藥成分用于臨床治療及輔助化療中[11]。葫蘆素B作為腫瘤藥物的研究顯示：葫蘆素B對多種類型的腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，且在不同腫瘤細胞中其作用機制并不完全相同[16]。研究發(fā)現(xiàn)，葫蘆素B對結(jié)腸癌、乳腺癌等實體腫瘤，及白血病等血液系統(tǒng)腫瘤均有抗腫瘤的效應(yīng)。葫蘆素B通過抑制腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲、誘導(dǎo)細胞凋亡及阻滯細胞周期等發(fā)揮抗腫瘤作用[17]。在本研究中使用MTS法檢測不同濃度葫蘆素B處理A549細胞不同時間后,結(jié)果顯示葫蘆素B以劑量和時間依賴性抑制A549細胞增殖。且在80 nmol/l，48 h組時存活率達最低，為(54.8±2.8)%(其中P<0.0001)。細胞遷移是癌癥轉(zhuǎn)移的重要過程，劃痕試驗結(jié)果表明葫蘆素B可抑制A549細胞遷移,且在一定程度上呈劑量、時間依賴性。流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果顯示,在不同作用時間及藥物濃度下，葫蘆素B均對A549細胞的凋亡產(chǎn)生了一定的促進作用，且細胞周期出現(xiàn)G2/M期阻滯，以上變化呈現(xiàn)出明顯的劑量及時間依賴性。流式檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，加入不同濃度葫蘆素B后與對照組相比細胞凋亡明顯增加，且這種增加表現(xiàn)為隨著藥物濃度梯度增加、作用時間延長，細胞凋亡率增加。表明在體外條件下葫蘆素B對非小細胞肺癌具有促進凋亡的作用。綜上表明,葫蘆素B抑制了A549細胞增殖及侵襲,使細胞出現(xiàn)G2/M期阻滯,促進細胞的凋亡，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。這與既往葫蘆素B在多種腫瘤細胞中的作用是一致的[11]。

CIP2A作為1個新興的癌癥治療靶標(biāo)，在多項研究中被證實，其通過抑制PP2A介導(dǎo)的Akt的去磷酸化來激活A(yù)kt從而促進腫瘤的發(fā)生[13]。Liang等在研究Rabdocoetsin B作為癌癥抑制劑的實驗中發(fā)現(xiàn)，Rabdocoetsin B可以作用于CIP2A/AKT通路來抑制腫瘤細胞的生長[18]。在研究多形性膠質(zhì)母細胞瘤中，葫蘆素B作為抑癌劑抑制了CIP2A的表達，并且通過調(diào)節(jié)其下游的AKT信號分子使多形性膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)生凋亡[14]。在本研究中,運用40nmol/l葫蘆素B分別作用A549細胞24h及48h后，western Blot結(jié)果提示A549細胞中存在CIP2A表達，且與對照組相比，葫蘆素B作用后A549細胞中CIP2A、PAKT的表達下降，且隨著作用時間延長，CIP2A、PAKT的表達下降越明顯，這與葫蘆素B通過時間依賴性抑制非小細胞肺癌細胞凋亡是同步的，提示葫蘆素B通過抑制CIP2A、PAKT的表達，抑制腫瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡。

綜上，我們的研究表明葫蘆素B通過抑制CIP2A/AKT信號途徑顯著抑制非小細胞肺癌A549細胞的增殖、遷移，阻滯細胞周期于G2/M期，促進細胞的凋亡，進而發(fā)揮其抗癌作用。