UPLC-MS/MS測定獼猴桃中氯吡脲的不確定度評定

羅 彬，劉正富

（1.重慶市黔江食品藥品檢驗所，重慶 409000；2.重慶市計量質(zhì)量檢測研究院，重慶 409000）

氯吡脲，又稱氯吡苯脲，是具有細(xì)胞分裂素活性的植物生長調(diào)節(jié)劑，能夠促進(jìn)細(xì)胞的分裂、分化以及器官形成，防止花和果實脫落，進(jìn)而促進(jìn)產(chǎn)量增加，其生物活性較強，是6-芐氨基嘌呤的數(shù)十倍，被廣泛用于農(nóng)業(yè)種植[1-4]。獼猴桃含有多種人體所需氨基酸、富含維生素C、多種微量元素[5]，是一種人們喜愛的水果。本文通過建立不確定度評定的數(shù)學(xué)模型，確定不確定度的來源，計算液質(zhì)法測定獼猴桃中氯吡脲含量的不確定度，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料

乙腈、甲酸、娃哈哈純凈水、無水硫酸鎂、氯化鈉、QuEChERS（50 mgPSA、150 mg無水硫酸鎂，2 mL），氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 儀器

Waters Xevo TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國沃特世）、XPE204電子天平（梅特勒-托利多）、高速冷凍離心機(jī)（貝克曼庫爾特）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制：準(zhǔn)確移取氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為100 μg/mL）100 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容配制成濃度為1 μg/mL氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)中間液。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：分別準(zhǔn)確移取1 μg/mL氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)中間液 50 μL、100 μL、200 μL、500 μL 和 1000 μL 于5 mL容量瓶中，用空白樣品基質(zhì)溶液配制成濃度為10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、100 ng/mL 和 200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.4 試樣制備

制樣：取代表性樣品按GB 2763要求，切碎混勻勻漿，放入潔凈容器。

提取：稱取樣品10 g于離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋3 min；加入4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉，渦旋，離心。

凈化：取1.5 mL上清液放入裝有50 mg PSA和150 mg無水硫酸鎂的2 mL離心管中；渦旋，離心，上清液過濾膜后待測。

1.5 儀器條件

色 譜 柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C181.7 μm 2.1×50 mm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；流動相：0.1%甲酸水、乙腈；流速：0.2 mL/min；氯吡脲保留時間為：3.27 min；離子源：ESI；電離模式：正離子；掃描模式：MRM；毛細(xì)管電壓：2.0 kV；離子對：定量248＞129，定性248＞93；錐孔電壓：36 V；碰撞能量：15 V、35 V。

2 數(shù)學(xué)模型

式中：X為試樣中氯吡脲的含量，mg/kg；C為樣品溶液中氯吡脲的濃度，ng/mL；V為樣品溶液的體積，mL；m為試樣的質(zhì)量，g。

3 標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定

3.1 測量過程中不確定度的來源

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定獼猴桃中氯吡脲含量，測量過程中不確定度的來源主要有：重復(fù)性測定，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量，標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，標(biāo)準(zhǔn)系列溶液線性擬合，天平、液質(zhì)聯(lián)用儀等儀器，試樣制備過程中定容體積，加標(biāo)回收。

3.2 重復(fù)性測定引入的不確定度

通過6次測量（p=6），計算出獼猴桃中氯吡脲的含量（X）分別為：0.027 2 mg/kg、0.028 1 mg/kg、0.026 8 mg/kg、0.029 8 mg/kg、0.027 2 mg/kg和0.030 8 mg/kg，平均值（）為 0.028 2 mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差為重復(fù)性測定試樣引入的不確定度為

3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量引入的不確定度

由北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司提供的濃度為100 μg/mL的氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)溶液，相對擴(kuò)展不確定度為3%（k=2），標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量引入的不確定度為

3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

根據(jù)JJG 196—2006、JJG 646—2006，按均勻分布k=，5 mL A級單標(biāo)線吸取管、10 mL A級單標(biāo)線吸取管、100 μL 移液槍取 50 μL、100 μL 移液槍取 100 μL、200 μL移液槍取 200 μL、1 000 μL 移液槍取 500 μL、1 000 μL 移液槍取1 000 μL的容量允差分別為±0.020 mL、±0.020 mL、±3.0%、±2.0%、±1.5%、±1.0%、±1.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為0.002 31、0.001 15、0.017 32、0.011 55、0.008 66、0.005 77、0.005 77，使用次數(shù)分別為6、1、1、2、1、1、1。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制體積引入的不確定度為：ur(R1)= 0.027 3容量瓶與移液槍的檢定溫度為20 ℃，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的環(huán)境溫度為（20±2） ℃，乙腈的體積膨脹系數(shù)為 1.37×10-3℃-1，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制溫度引入的不確定度為：標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制引入的不確定度為：

3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度為：ur(B)=

3.4 線性擬合引入的不確定度

測量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，標(biāo)液濃度cj為：10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、100 ng/mL和200 ng/mL，峰面積yj為：1 603、3 098、6 492、15 974、32 974，標(biāo)液濃度的平均值=74 ng/mL，通過最小二乘法擬合得到線性方程y=165.03c-183.7，斜率a=165.03，截距b=-183.7，r2=0.999 8。平行測量6次樣品（p=6），由線性方程求出的樣品溶液中氯吡脲的濃度分別為27.415 ng/mL、28.191 ng/mL、26.913 ng/mL、29.807 ng/mL、27.402 ng/mL 和 30.893 ng/mL，樣品溶液中氯吡脲的平均濃度c樣=28.437 ng/mL。線性擬合引入的不確定度為：

其中：峰面積測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差S(y)=標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的方差Sx=n為測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的次數(shù)（n=5）。

3.5 天平稱樣引入的不確定度

稱取樣品所用的電子天平，檢定證書給出的允差為±0.2 mg，按均勻分布稱樣量為10.041 1 g，稱樣引入的不確定度為

3.6 試樣制備過程中定容體積引入的不確定度

試樣制備過程加入10 mL乙腈，根據(jù)JJG 196—2006，10 mL A級單標(biāo)線吸取管的容量允差為±0.020 mL，按均勻分布吸取管引入的不確定度為溫度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.7 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀引入的不確定度

使用液質(zhì)聯(lián)用儀測定獼猴桃中氯吡脲含量，檢定證書給出的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為4.2%（k=2），超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀引入的不確定度為

3.8 加標(biāo)回收引入的不確定度

在獼猴桃樣品中加入氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)中間液，氯吡脲添加量為0.028 mg/kg。平行測量6次（z=6），測得的回收率f分別為：97.2%、95.8%、91.0%、93.4%、95.3%、91.5%，平均回收率為94.0%，回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差S（f）=0.024 8，加標(biāo)回收引入的不確定度為

3.9 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

獼猴桃中氯吡脲含量的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

獼猴桃中氯吡脲含量為0.028 2 mg/kg，合成不確定度為u=0.048 3×0.028 2=0.001 36 mg/kg。

3.10 擴(kuò)展不確定度

置信水平為95%時，k=2，擴(kuò)展不確定度為：U=0.001 36×2=0.002 72 mg/kg。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字，獼猴桃中氯吡脲含量報告的表示，結(jié)果為：X=（0.028±0.003） mg/kg，k=2。

4 結(jié)論

通過不確定度分析，天平稱取樣品對不確定度的影響很小，不確定度主要來源于重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)溶液制備、線性擬合、儀器穩(wěn)定性。在今后的檢測中，相關(guān)人員需要關(guān)注以上幾個方面，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性、科學(xué)性。