電噴霧多級(jí)質(zhì)譜研究功能小分子與蛋白質(zhì)的非共價(jià)相互作用
——推薦一個(gè)化學(xué)生物學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)

張于錳，陳語嫣，劉艷

廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建省化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廈門大學(xué))，福建 廈門 361005

在功能小分子與蛋白質(zhì)的非共價(jià)相互作用研究方面，酶的抑制劑篩選是重要的應(yīng)用領(lǐng)域之一，在藥物研發(fā)方面具有極其重要的科學(xué)意義及社會(huì)價(jià)值。質(zhì)譜技術(shù)因其高靈敏、快速、高效、樣品消耗量小(pmol-fmol)等特點(diǎn)，在非共價(jià)復(fù)合物研究方面顯示出巨大的應(yīng)用潛力，與H/D交換技術(shù)相聯(lián)合還可以描述蛋白折疊動(dòng)力學(xué)過程[1]。通過“Intensity-Fading”間接的質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)也可以有效獲得蛋白質(zhì)與配體相互作用位點(diǎn)及作用本質(zhì)信息[2]。

1 質(zhì)譜技術(shù)研究功能小分子與蛋白質(zhì)相互作用的基本策略

電噴霧電離(Electrospray Ionization，ESI)及基質(zhì)輔助激光解吸電離(Matrix Assisted Laser Dissociation Ionization，MALDI)是研究功能小分子與蛋白質(zhì)的非共價(jià)相互作用常用的軟電離質(zhì)譜離子源。

質(zhì)譜研究功能小分子與蛋白質(zhì)的非共價(jià)相互作用成功的關(guān)鍵是保證蛋白質(zhì)是在“天然”狀態(tài)下進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)試。通?？梢允褂脺睾偷碾妷?例如，錐孔電壓Cone Voltage)、毛細(xì)管溫度等儀器測(cè)試參數(shù)和采取溫和的樣品制備策略，來實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)在“天然”狀態(tài)下的質(zhì)譜測(cè)試。蛋白質(zhì)、多肽的分子量較大，在質(zhì)譜中的離子化效率較低。因此，為了提高蛋白質(zhì)、多肽在質(zhì)譜中的離子化效率及檢測(cè)靈敏度，往往在樣品制備過程中，將蛋白、多肽溶于含0.1% HCOOH或0.1% HOAc并含一定比例乙腈或甲醇的水溶液中。然而，這樣的樣品溶液配制方法對(duì)蛋白質(zhì)非共價(jià)復(fù)合物的檢測(cè)非常不利，強(qiáng)酸環(huán)境、有機(jī)溶劑的使用，會(huì)降低非共價(jià)復(fù)合物的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致復(fù)合物結(jié)構(gòu)解離。具體來說，pH越低，有機(jī)溶劑含量越高，蛋白質(zhì)與功能小分子的非共價(jià)復(fù)合物越容易解離[3]。除了蛋白樣品緩沖溶液pH、有機(jī)溶劑外，所有能夠?qū)е碌鞍踪|(zhì)變性的因素都不利于蛋白質(zhì)非共價(jià)復(fù)合物的穩(wěn)定存在。因此，質(zhì)譜毛細(xì)管溫度和工作電壓在研究蛋白質(zhì)非共價(jià)復(fù)合物時(shí)也是需要考慮優(yōu)化的重要因素。

肌紅蛋白(Myoglobin)，是組成骨骼肌和心肌的主要蛋白質(zhì)。當(dāng)肌肉損傷時(shí)，肌紅蛋白就從肌肉組織中漏到循環(huán)血液中，使血清肌紅蛋白濃度增加。臨床上常用該指標(biāo)來判斷是否發(fā)生肌肉損傷。由于肌紅蛋白自身就是通過血紅素輔基鐵卟啉與蛋白質(zhì)的非共價(jià)相互作用而形成的蛋白復(fù)合物，常常用其來衡量非共價(jià)蛋白復(fù)合物的質(zhì)譜測(cè)試參數(shù)的有效性。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

功能小分子與蛋白質(zhì)的相互作用研究最為典型的應(yīng)用就是酶的抑制劑篩選?；谫|(zhì)譜技術(shù)的酶抑制劑篩選方法可分為直接篩選法(圖1A，1B)和間接篩選法(圖1C)[4]。圖1A中，通過直接檢測(cè)酶-抑制劑復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)小分子酶抑制劑的直接篩選；圖1B中，先利用質(zhì)譜“釣”到酶-抑制劑復(fù)合物后，通過測(cè)試條件的改變，實(shí)現(xiàn)復(fù)合物的解離，再利用質(zhì)譜直接檢測(cè)、鑒定小分子抑制劑；圖1C中，則以酶底物的酶解產(chǎn)物為“報(bào)告分子”，利用質(zhì)譜檢測(cè)“報(bào)告分子”間接實(shí)現(xiàn)抑制劑的篩選。

圖1 基于質(zhì)譜技術(shù)的酶抑制劑篩選策略[4]

本實(shí)驗(yàn)選擇以肌紅蛋白為模型蛋白，來模擬酶抑制劑的直接篩選方法(圖1B)，通過測(cè)試樣品溶液條件的改變，考查pH環(huán)境及有機(jī)溶劑對(duì)肌紅蛋白復(fù)合物的電噴霧質(zhì)譜全掃描譜的差異，讓學(xué)生觀察肌紅蛋白的測(cè)試條件對(duì)其復(fù)合物測(cè)定的影響。此外，通過待測(cè)樣品中酸或有機(jī)溶劑的增加，實(shí)現(xiàn)復(fù)合物的完全解離釋放出小分子配體——血紅素輔基，即鐵卟啉環(huán)，計(jì)算蛋白復(fù)合物與蛋白質(zhì)的質(zhì)量差值，確定小分子配體鐵卟啉環(huán)輔基的分子離子峰，并對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜解析，以獲得相應(yīng)的結(jié)構(gòu)信息。

該實(shí)驗(yàn)是在廈門大學(xué)化學(xué)生物學(xué)系早期的“化學(xué)生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)”[5]基礎(chǔ)上的進(jìn)一步拓展。早期教學(xué)實(shí)驗(yàn)僅進(jìn)行了測(cè)試樣品溶液條件的改變對(duì)復(fù)合物質(zhì)譜測(cè)定的影響考查，沒有引入酶抑制直接篩選應(yīng)用策略的介紹以及二級(jí)質(zhì)譜對(duì)小分子配體的定性分析。改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)更有利于學(xué)生利用簡單的模型蛋白復(fù)合物，全面理解基于電噴霧多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)的功能小分子與蛋白質(zhì)的非共價(jià)相互作用研究的實(shí)際應(yīng)用。

選擇肌紅蛋白作為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象有三個(gè)根本設(shè)計(jì)原因。其一，肌紅蛋白是一種常規(guī)的商品化的蛋白質(zhì)，并且其本身就是蛋白質(zhì)與血紅素輔基的非共價(jià)相互作用復(fù)合物，可以有效模擬酶-抑制劑復(fù)合物，樣品來源方便，便宜易得，有利于在大學(xué)本科基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中推廣使用；其二，以甲醇、醋酸作為蛋白質(zhì)復(fù)合物的變性劑以及互作破壞劑，考查這兩種常用的生物質(zhì)譜測(cè)試輔助試劑對(duì)血紅素輔基(抑制劑)與肌紅蛋白(酶)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的影響，并在線解離血紅素輔基，利用二級(jí)質(zhì)譜分析技術(shù)完成血紅素輔基定性分析過程，幫助學(xué)生利用簡單的模型更好地體會(huì)并了解實(shí)驗(yàn)核心意義；其三，肌紅蛋白是被普遍認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用來評(píng)價(jià)維系非共價(jià)蛋白質(zhì)復(fù)合物“天然”狀態(tài)的質(zhì)譜測(cè)試條件的有效性，直接選擇肌紅蛋白進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)試，有利于學(xué)生更好地了解其在質(zhì)譜上的譜學(xué)特性。

3 實(shí)驗(yàn)操作

3.1 儀器與試劑

3.1.1 儀器

德國布魯克道爾頓公司AmaZon SL電噴霧離子阱質(zhì)譜；精密分析天平：賽多利斯精密天平(型號(hào)：BT224S，精確讀數(shù)0.1 mg)；漩渦混勻器：北京大龍MX-S可調(diào)式混勻儀。

3.1.2 試劑

馬心肌紅蛋白(Myoglobin,Mw≈ 17500)購自上海生工，市售的馬心肌紅蛋白本身含有血紅素輔基，或者稱為鐵卟啉輔基，為了便于討論，文中用“肌紅蛋白復(fù)合物”表示肌紅蛋白與鐵卟啉輔基之間存在弱相互作用的復(fù)合物形式；超純水Milli-Q純化(Millipore，Bedford，MA，USA，18.2 MΩ·cm)；甲醇(HPLC級(jí))，Merck Co.(Darmstadt，德國)；醋酸(MS純)，Sigma Co.。

3.2 實(shí)驗(yàn)步驟

3.2.1 樣品配制

Solution A：稱取1 mg馬心肌紅蛋白于1.5 mL離心管，加入1 mL超純水(此時(shí)肌紅蛋白水溶液的pH ≈ 9)，渦旋混勻器中混勻，國產(chǎn)0.22 μm聚醚砜樹脂(PES)針式過濾頭過濾，得到濃度為5.715 ×10-5mol·L-1的馬心肌紅蛋白儲(chǔ)備液。

Solution B1-B5：分別取100 μL Solution A于5個(gè)1.5 mL離心管中，再分別加入0、100、200、300、400 μL甲醇，以及400、300、200、100、0 μL超純水，混勻，備用。

Solution B6-B10：分別取100 μL Solution A、10 μL 0.1%醋酸水溶液于5個(gè)1.5 mL離心管中，再分別加入0、100、200、300、400 μL甲醇，400、300、200、100、0 μL超純水，混勻，備用。

Solution B1-B10的馬心肌紅蛋白的測(cè)試終濃度為1.143 × 10-5mol·L-1。

3.2.2 儀器操作

質(zhì)譜條件設(shè)置：

1) 全掃描質(zhì)譜：正離子模式；用流動(dòng)注射泵進(jìn)樣，流速為40 μL·min-1；掃描范圍600-2200m/z；Target mass 1200；Dry temperature 220 °C；nebulizer 7 Psi；Dry gas: 4.5 L·min-1; average: 5；Rolling Average: 15。

2) MS/MS質(zhì)譜：正離子模式；用流動(dòng)注射泵進(jìn)樣，流速為40 μL·min-1；掃描范圍200-1200m/z；Target mass 616；Dry temperature 220 °C；nebulizer 7 Psi；Dry gas: 4.5 L·min-1；average: 5；Rolling Average: 5。

3.2.3 數(shù)據(jù)分析

分別對(duì)Solution B1-B10待測(cè)溶液進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，待總離子流穩(wěn)定后，保存此時(shí)掃描譜圖。利用儀器自帶的數(shù)據(jù)分析軟件(Compass DataAnalysis)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，具體質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果如圖2及圖3所示。圖2中，甲醇含量為0時(shí)(圖2a)，在上述質(zhì)譜檢測(cè)條件下，既觀察到肌紅蛋白復(fù)合物的質(zhì)譜多電荷信號(hào)峰，也檢測(cè)到了解離的蛋白質(zhì)的質(zhì)譜信號(hào)峰，說明該質(zhì)譜檢測(cè)儀器參數(shù)還可以進(jìn)一步優(yōu)化，以完全消除蛋白復(fù)合物的解離。隨著甲醇含量的逐步增加(圖2b和2c)，肌紅蛋白復(fù)合物的質(zhì)譜多電荷信號(hào)峰逐漸減弱，蛋白質(zhì)的質(zhì)譜信號(hào)逐漸增強(qiáng)，說明多數(shù)的蛋白以單體形式存在，當(dāng)甲醇含量達(dá)到60%時(shí)，復(fù)合物基本都發(fā)生了解離，以蛋白質(zhì)單體形式存在，表現(xiàn)出多電荷的近似正態(tài)分布峰型(圖2d)，復(fù)合物自身的多電荷峰極弱(對(duì)應(yīng)圖2d中，帶15個(gè)電荷的分子離子峰1172.21m/z)。當(dāng)甲醇濃度達(dá)到80%時(shí)(圖2e)，蛋白質(zhì)復(fù)合物離子化效率大大降低，蛋白質(zhì)單體多電荷峰不顯著。

圖2 不同甲醇比例下肌紅蛋白與其鐵卟啉環(huán)輔基弱相互作用電噴霧質(zhì)譜圖

另外，加入醋酸的組別(圖3)與不加醋酸的組別(圖2)相比，特別是圖3e與圖2e相比較，同樣是在80%的甲醇溶液中，酸的引入可以大大提升蛋白質(zhì)的離子化效率，表現(xiàn)出良好的質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)峰(圖3e)。這也說明了在蛋白質(zhì)、多肽的質(zhì)譜檢測(cè)過程中，加有機(jī)酸提高其離子化效率的重要性。另外，10 μL 0.1%醋酸的使用，甲醇含量為0時(shí)(圖3a)，完整的肌紅蛋白復(fù)合物以及解離蛋白質(zhì)可以同時(shí)檢測(cè)到，當(dāng)甲醇含量提高到40%時(shí)，鐵卟啉環(huán)輔基與肌紅蛋白仍保持較為強(qiáng)烈的相互作用，除了部分解離的蛋白質(zhì)外，復(fù)合物的多電荷峰也可以顯著地檢測(cè)到，在質(zhì)譜圖上呈現(xiàn)較為良好的近似正態(tài)分布的多電荷峰型(圖3c)。但是，當(dāng)甲醇含量提高到60%時(shí)，肌紅蛋白復(fù)合物完全解離，釋放出鐵卟啉環(huán)輔基，在質(zhì)譜設(shè)定的掃描范圍中呈現(xiàn)出蛋白質(zhì)的近似正態(tài)分布的多電荷峰型(圖3d)。

圖3 10 μL 0.1%醋酸環(huán)境不同甲醇比例肌紅蛋白與其鐵卟啉環(huán)輔基弱相互作用電噴霧質(zhì)譜圖

利用Compass DataAnalysis軟件中Deconvolution功能，對(duì)譜圖進(jìn)行去卷積分析，可以獲得質(zhì)譜圖2、圖3上蛋白質(zhì)峰所帶電荷數(shù)的指認(rèn)。通過多電荷峰的質(zhì)荷比，以及相應(yīng)的電荷數(shù)，可以推算出原蛋白質(zhì)的分子量。以圖3b為例，經(jīng)去卷積計(jì)算分析，圖中肌紅蛋白復(fù)合物平均分子量為17570.00 Da，鐵卟啉輔基解離后的肌紅蛋白平均分子量為16954.73 Da，兩者之間分子量相差615.27 Da，該丟失的分子量可能對(duì)應(yīng)肌紅蛋白復(fù)合物解離下來的相互作用的功能小分子鐵卟啉環(huán)輔基。

為探究該中性丟失小分子的結(jié)構(gòu)特征，對(duì)質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)且肌紅蛋白復(fù)合物完全解離的圖3e樣品進(jìn)行二次測(cè)試，調(diào)節(jié)質(zhì)譜測(cè)試的掃描范圍為200-1200m/z，在該質(zhì)譜掃描范圍內(nèi)，尋找[615 + H]+峰，即616m/z質(zhì)譜信號(hào)峰。研究結(jié)果表明，圖3e樣品在掃描范圍200-1200m/z中，確實(shí)檢測(cè)到極強(qiáng)的616m/z質(zhì)譜信號(hào)峰，對(duì)該分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜碎裂分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 分子量616.27捕獲的二級(jí)碎裂電噴霧質(zhì)譜峰

從圖4中可以觀察到，所捕獲的分子離子峰616.27m/z，經(jīng)二級(jí)質(zhì)譜碰撞誘導(dǎo)解離(Collision-Induced Dissociation，CID)后，最典型的碎裂特征是：中性丟失59 Da，產(chǎn)生碎片峰557.28m/z。中性丟失59 Da，可以通過C―C鍵的均裂，以乙酸自由基形式(·CH2COOH)離去而實(shí)現(xiàn)，因此，分析輔基結(jié)構(gòu)中可能含有乙酸基團(tuán)，與鐵卟啉環(huán)輔基結(jié)構(gòu)特征一致(圖5)。

圖5 鐵卟啉環(huán)輔基結(jié)構(gòu)式

4 結(jié)語

質(zhì)譜測(cè)試之前的樣品前處理是質(zhì)譜測(cè)試結(jié)果好壞的關(guān)鍵。學(xué)生在大學(xué)四年級(jí)之前的儀器分析等理論課上對(duì)質(zhì)譜分析的基本原理等都有所了解，但是質(zhì)譜測(cè)試前的樣品前期準(zhǔn)備的相關(guān)知識(shí)缺少培訓(xùn)。另外，廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院“化學(xué)生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)”安排在大四秋季學(xué)期，學(xué)生正好都處于進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行本科畢業(yè)論文設(shè)計(jì)實(shí)踐階段，有利用質(zhì)譜分析樣品的潛在需求。因此，在做實(shí)驗(yàn)之前，結(jié)合PPT將背景知識(shí)以及常規(guī)質(zhì)譜配樣、上機(jī)操作的基本注意事項(xiàng)對(duì)學(xué)生進(jìn)行詳細(xì)講解。引導(dǎo)學(xué)生掌握基本的質(zhì)譜分析、樣品制備的基本常識(shí)(如質(zhì)譜正負(fù)離子檢測(cè)模式選擇的依據(jù)、二級(jí)質(zhì)譜的測(cè)試意義、樣品脫鹽處理的基本方法、質(zhì)譜圖軟件分析方法等)。引導(dǎo)學(xué)生觀察、思考不同樣品測(cè)試條件下，肌紅蛋白復(fù)合物在電噴霧質(zhì)譜全掃描中的表現(xiàn)形式的差異形式是什么，差異產(chǎn)生原因是什么。蛋白樣品的稱量由助教完成。所有蛋白樣品溶液的配制由學(xué)生現(xiàn)場(chǎng)完成，現(xiàn)用現(xiàn)配。建議分組進(jìn)行教學(xué)實(shí)驗(yàn)，1組安排5-6名同學(xué)。每次實(shí)驗(yàn)安排1組同學(xué)，可以統(tǒng)一配制一組Solution B1-10的待測(cè)樣品，小班教學(xué)實(shí)驗(yàn)過程中可以保證每位同學(xué)都可以獨(dú)立進(jìn)行實(shí)際的上機(jī)操作。整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)長約3-4小時(shí)(包括PPT講解時(shí)間)。

最后，需要說明的是，本教學(xué)實(shí)驗(yàn)提供了一種利用簡單的蛋白質(zhì)復(fù)合物模型來模擬酶抑制劑直接篩選過程的策略，適合于沒有現(xiàn)成“目標(biāo)酶及潛在抑制劑”篩選體系的學(xué)校開展相關(guān)教學(xué)工作。如果原有教學(xué)平臺(tái)已具有“目標(biāo)酶及潛在抑制劑”的篩選體系，可以將該質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理直接用于自身的篩選體系。另外，為了讓學(xué)生在一次樣品測(cè)試中能同時(shí)觀察到肌紅蛋白復(fù)合物和解離的蛋白質(zhì)的多電荷質(zhì)譜信號(hào)峰，以及兩組多電荷質(zhì)譜峰的變化趨勢(shì)，不必讓學(xué)生過于刻意地、耗時(shí)地現(xiàn)場(chǎng)優(yōu)化出只有蛋白復(fù)合物而沒有解離峰的質(zhì)譜測(cè)試條件。此外，由于卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在CID二級(jí)質(zhì)譜碎裂模式下不容易碎裂，因此在探究其結(jié)構(gòu)的過程中，我們僅僅進(jìn)行了二級(jí)質(zhì)譜裂解。對(duì)于其他實(shí)際樣品而言，若其小分子配體結(jié)構(gòu)在CID模式下容易解離為分子量不同的各種碎片離子，則可以進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行三級(jí)及以上的多級(jí)分析，對(duì)每一級(jí)碎裂下來的碎片峰進(jìn)行多級(jí)分析可以更好地獲知并了解該配體更為詳盡的結(jié)構(gòu)信息，這也是多級(jí)質(zhì)譜在研究化合物結(jié)構(gòu)特征的優(yōu)勢(shì)和獨(dú)特作用。