半夏SSR分子標(biāo)記開發(fā)與遺傳多樣性

張景，李曉東，宗慶波，何貝貝，拉基，景納良，王柯月，鐘淑梅，舒少華

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070; 2.湖北省果茶辦公室，武漢 430070;3.九州通醫(yī)藥集團(tuán)九信中藥研究院，武漢 430051

半夏(Pinelliaternata(Thunb.) Breit.)是天南星科多年生草本植物，其藥用部位為干燥塊莖，具有燥濕化痰、消痞散結(jié)的功效[1]，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)半夏具有鎮(zhèn)咳、止嘔、抗炎抗病毒等作用[2]。半夏作為藥材使用歷史悠久，以野生資源為主，主要分布于四川、湖北、安徽、江蘇、河南和浙江等地。近年來，由于半夏生長環(huán)境的不斷惡化、人為過度采集，使半夏野生資源急劇減少[3]，因此，有必要開展半夏資源的保護(hù)和種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究[4]。同時(shí)，半夏分布廣泛，種質(zhì)資源比較豐富，藥用品質(zhì)也存在不同[5]，并且難以從形態(tài)上識(shí)別。目前生產(chǎn)中，發(fā)現(xiàn)極少數(shù)塊莖為紅色的半夏品種具有高產(chǎn)、高抗性等特點(diǎn)，但是卻沒有一套完整的選育方法。

SSR(simple sequence repeats，SSR)標(biāo)記因其多態(tài)性高、重復(fù)性好、覆蓋面廣等優(yōu)點(diǎn)，廣泛運(yùn)用于QTL圖譜繪制、遺傳多樣性分析和分子標(biāo)記輔助育種等方面[6-7]。Bernadette等[8]利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建了四倍體苜蓿的遺傳圖譜；李磊等[9]從50對(duì)ISSR引物中篩選到5對(duì)多態(tài)性高的引物，從而實(shí)現(xiàn)在分子水平對(duì)5種葉型半夏的鑒定與區(qū)分；徐敏等[10]通過開發(fā)9對(duì)SSR引物發(fā)現(xiàn)五味子居群間有一定的基因流，居群內(nèi)存在著豐富的遺傳多樣性；Feng等[11]研究結(jié)果表明，SSR標(biāo)記具有很高的重復(fù)性和信息量，可用于評(píng)價(jià)藥用菊科植物的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。

目前對(duì)半夏的栽培[12]、藥理作用[13-14]等方面已有一些研究，但關(guān)于半夏種質(zhì)資源遺傳多樣性和分子標(biāo)記輔助育種等方面的研究相對(duì)較少。由于采用高通量測(cè)序方法開發(fā)SSR標(biāo)記在植物中被廣泛應(yīng)用[15-17]，本研究基于半夏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)開發(fā)SSR引物，對(duì)不同居群半夏之間的種群結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性進(jìn)行分析，旨在為半夏資源保護(hù)、遺傳多樣性研究和分子輔助育種提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

半夏材料共17份，包括從全國收集的14份材料以及從湖北省江漢平原地區(qū)野生半夏資源中選育的3份材料，所有收集到的材料經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)陳科力教授鑒定為天南星科植物半夏(P.ternata)，收集到的材料種植于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物資源圃。詳見表1。

表1 半夏試驗(yàn)材料 Table 1 P. ternata germplasm

1.2 DNA提取

選取幼嫩的半夏葉片置于液氮中速凍帶回，采用改良的 CTAB法進(jìn)行半夏基因組DNA的提取，利用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度與質(zhì)量，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR引物開發(fā)

半夏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)楊生超教授提供。針對(duì)不同的Unigene設(shè)計(jì)SSR引物共2 000對(duì)。利用生物信息學(xué)軟件(Primer-blast)對(duì)引物進(jìn)行比對(duì)，篩選出266對(duì)引物并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 多態(tài)性SSR引物篩選

利用2個(gè)不同居群半夏的葉片DNA(HTX1、HBLK)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過2%瓊脂糖凝膠電泳篩選能夠擴(kuò)增出目的產(chǎn)物大小且條帶清晰明亮的引物。利用初篩的引物分別對(duì)17份不同居群的半夏DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測(cè)初篩引物的多態(tài)性。

1.5 PCR擴(kuò)增

采用20 μL體系：PCR Buffer 2 μL,dNTP0.6 μL,Mg2+1.2 μL,Primer F 0.6 μL,Primer R 0.6 μL,TaqDNA聚合酶0.2 μL,模板DNA 2.0 μL,ddH2O 12.8 μL。

PCR反應(yīng)程序： 94 ℃預(yù)熱5 min；94 ℃變性45 s，退火45 s，72 ℃模板延伸45 s， 35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。利用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，在120 V電壓下電泳90 min，硝酸銀染色，顯色液及蒸餾水洗凈，觀察并統(tǒng)計(jì)條帶，拍照保存圖像。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

統(tǒng)計(jì)17份半夏樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，在同一遷移位置上有條帶的記作“1”,無條帶的記作“0”，利用Excel表格建立1/0矩陣，利用PowerMarkerV3.25軟件計(jì)算引物多態(tài)信息含量(polymorpism index contet，PIC)、多態(tài)性頻率(frequency of polymorphism，F(xiàn)P)、等位基因數(shù)(allele number，AN)。利用POPGENE Version1.32、GenAIEX6.502軟件對(duì)不同居群半夏的遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，包括Shannon信息指數(shù)(I)、有效等位基因數(shù)(effective allele number,Ne)、居群間基因流(interpopulation gene flow,Nm)、居群間遺傳分化系數(shù)(coefficient of genetic differentiation between populations,Gst)。利用NTsys2.10軟件中的UPGMA(非加權(quán)算術(shù)平均值聚類法)進(jìn)行聚類分析，繪制親緣關(guān)系樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性SSR引物篩選

本試驗(yàn)從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選得到266對(duì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，篩選出75對(duì)能成功擴(kuò)增出目的片段大小且條帶清晰明亮的引物。利用篩選得到的75對(duì)引物對(duì)17份半夏材料的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行多態(tài)性分析，篩選出19對(duì)多態(tài)性好的引物(表2)，部分引物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖見圖1。

M為600 bp marker；A、B分別為引物Unigene23904和Unigene49309擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖；編號(hào)1～17為17個(gè)半夏居群DNA。M is 600 bp marker; A and B were primers Unigene23904 and Unigene49309 amplification products gel electrophoresis map,respectively.17 Pinellia ternata strains DNA were numbered 1-17.

表2 19對(duì)SSR引物信息 Table 2 The information of 19 pairs of SSR primers

2.2 半夏遺傳多樣性分析

利用篩選出的19對(duì)多態(tài)性高的引物，進(jìn)行遺傳系數(shù)分析，由表3可知，19對(duì)SSR引物在17份半夏材料中共檢測(cè)到多態(tài)性位點(diǎn)49個(gè)，平均每對(duì)引物有2.5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)；等位基因數(shù)(Ne)一共有76個(gè)，平均值為3.8；Nei基因多樣性指數(shù)(He)范圍為0.606～1.762，PIC范圍為0.40～0.96，平均為0.60。多態(tài)性頻率FP的變幅為0.44～0.85，平均值為0.64。結(jié)果表明篩選出的引物多態(tài)性高，所選半夏材料遺傳多樣性豐富。

表3 半夏居群遺傳多樣性 Table 3 Genetic diversity of P. ternata populations

根據(jù)遺傳相似系數(shù)聚類分析結(jié)果將對(duì)應(yīng)的SSR分子標(biāo)記的帶型結(jié)果導(dǎo)入GenAIEX6.502軟件中，由分子方差分析(AMOVA)可知，88%的變異來源于個(gè)體間，12%的變異來源于群體間(P<0.001)(表4)，這說明群體與群體間的差異相對(duì)較小，但群體內(nèi)的遺傳多樣性水平較高，而遺傳變異主要來源于個(gè)體間[18]。

表4 半夏居群分子方差分析 Table 4 Analysis of molecular variance(AMOVA) in P. ternata populations

另外居群間平均分化系數(shù)Gst為0.124，小于0.15(Wright)，說明居群間遺傳分化較小?？偟幕蛄鞴浪阒礜m為1.765，大于1(Wright)，表明居群間能正常地進(jìn)行基因交流，且居群間遺傳分化受基因流的影響較大。

2.3 半夏群體聚類分析

將19對(duì)多態(tài)性高的引物的讀帶結(jié)果按0/1矩陣格式在Excel中排版，通過NTSYSpc 2.10軟件中的Similarity計(jì)算遺傳相似度。相似度結(jié)果(表5)表明，不同居群半夏的遺傳相似度有差異，其中HNJS(湖南吉首)與HNSX(河南嵩縣)的遺傳相似度最高，為0.906。以遺傳相似系數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，利用UPGMA法構(gòu)建聚類圖。由圖2可知，17個(gè)半夏居群間遺傳相似度為0.63～0.91，以遺傳相似系數(shù)0.70為標(biāo)準(zhǔn)，將17個(gè)居群分成5個(gè)類群，其中1個(gè)類群較大，其他4個(gè)類群較小。各類群內(nèi)又可做亞類群分類，從下至上分類情況如下：

圖2 半夏遺傳相似度聚類圖Fig.2 Genetic similarity clustering map of P. ternata populations

表5 不同居群半夏遺傳相似度 Table 5 Genetic similarity of different P. ternata populations

第1類為云南文山和湖北荊州，第2類和第3類分別為重慶萬州和HTX1(選育材料)，第4類為江蘇鹽城和江西(JXJX)，第5類為湖北(HBWS)、HTX2(選育材料)、湖南常德、河南嵩縣、湖南吉首、湖北荊州、安徽宿松、貴州凱里、湖北(HBLK)、HTX3(選育材料)、湖北天門聚成一大類。聚類分析結(jié)果表明，不同居群的半夏遺傳結(jié)構(gòu)不嚴(yán)格按照產(chǎn)地劃分，表明不同居群半夏有較大的基因交流程度，具有較近的親緣關(guān)系。

3 討 論

本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)開發(fā)SSR引物，利用多態(tài)性SSR引物進(jìn)行半夏遺傳多樣性分析，結(jié)果表明：所開發(fā)的19對(duì)SSR引物多態(tài)性高，能將17份半夏材料明確區(qū)分。通過分子方差分析(AMOVA)發(fā)現(xiàn)半夏的遺傳變異主要來源于居群內(nèi)。由遺傳多樣性分析可知，不同產(chǎn)地的半夏具有豐富的遺傳多樣性；由遺傳距離與聚類結(jié)果可知，不同居群的半夏遺傳結(jié)構(gòu)非嚴(yán)格按照產(chǎn)地劃分。

3.1 SSR引物多態(tài)性

Botstein等[19]認(rèn)為PIC<0.25、0.250.50分別表示引物多態(tài)性為較低、中等、較高。本試驗(yàn)共篩選了76對(duì)SSR引物，其中篩選的19對(duì)引物的PIC范圍為0.40～0.96，平均為0.60，高于Du等[20]、陸歡等[21]的研究結(jié)果，說明本試驗(yàn)所篩選的SSR引物多態(tài)性高。同時(shí)19對(duì)引物的Ne、PIC、FP均大于平均值，說明這19對(duì)引物整體的均一性較好，在一定程度上反映出這19對(duì)引物多態(tài)性比較豐富，對(duì)17份材料的區(qū)分能力較好，為下一步的遺傳多樣性分析提供了依據(jù)。

3.2 半夏遺傳多樣性

利用19對(duì)多態(tài)性較高的SSR引物對(duì)17個(gè)半夏居群進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示每對(duì)引物的多態(tài)性位點(diǎn)平均為2.4個(gè),多態(tài)性位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)平均為92.2%,等位基因數(shù)的平均值為3.8個(gè),Nei基因多樣性指數(shù)平均為1.03，表明本研究收集的17份半夏材料蘊(yùn)含了比較豐富的遺傳變化信息，顯示了較高水平的基因多樣性。而張君毅[22]采用SRAP分子標(biāo)記方法對(duì)24個(gè)居群半夏進(jìn)行遺傳多樣性分析，從中篩選出29對(duì)引物，共檢測(cè)到286個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)占48.3%；Nei’s基因多樣性指數(shù)平均值為0.198，同樣也證明了半夏居群存在豐富的遺傳多樣性。

研究遺傳多樣性有助于分析生物多樣性的起源和進(jìn)化，并為植物分類提供有益的資料，進(jìn)而為植物育種和保護(hù)策略制定基礎(chǔ)[23]，因此，遺傳育種的前提是做好天然居群及居群間遺傳多樣性和遺傳變異的研究。鄭丹書[24]對(duì)半夏居群間、居群內(nèi)的分化程度進(jìn)行分析，結(jié)果表明半夏居群內(nèi)部存在較大變異，占67.18%；而居群間的變異程度較小，為32.82%;由POPGENE3.2計(jì)算得出Gst=0.411 2，Nm=0.715 9，結(jié)果也闡明了半夏居群大部分的變異(58.88%)存在于居群內(nèi)部，而導(dǎo)致居群存在較高分化水平的主要原因可能是基因流。本研究發(fā)現(xiàn)半夏居群間分化系數(shù)Fst為0.124，說明居群間遺傳分化較小。而通過分子方差分析(AMOVA)發(fā)現(xiàn)居群內(nèi)的變異達(dá)到88%，也驗(yàn)證了半夏的遺傳變異主要來源于居群內(nèi)。而Nm值為1.765，表明居群間能正常地進(jìn)行基因交流，且居群間遺傳分化受基因流的影響較大。由遺傳多樣性分析可知，不同居群的半夏具有豐富的遺傳多樣性；根據(jù)聚類結(jié)果分析可知，不同居群的半夏遺傳結(jié)構(gòu)不嚴(yán)格按照產(chǎn)地劃分，表明不同居群半夏有較大的基因交流程度，具有較近的親緣關(guān)系，造成這種現(xiàn)象的原因可能是：①由于栽培材料在長期的馴化過程中出現(xiàn)了遺傳分化以及部分材料的來源混亂導(dǎo)致的[25]；②也可能是因?yàn)槿藶榈陌胂囊N栽培干擾較大，加之多地區(qū)品種遺傳背景高度復(fù)雜，而半夏常以無性繁殖為主，且世代交替頻繁，從而導(dǎo)致種質(zhì)一致性差[26]。