沙門(mén)菌噬菌體T139基因組分析及其裂解酶LysT40的異源表達(dá)和活性鑒定

丁一峰，聶若男，朱文娟，王吉，王佳，王小紅

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070

沙門(mén)菌是引起食源性疾病的主要原因之一，包括2 600多個(gè)血清型，其中鼠傷寒沙門(mén)菌是關(guān)系到食品安全的最主要血清型[1]。感染沙門(mén)菌的癥狀包括惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、發(fā)燒和頭痛等，其在工業(yè)化國(guó)家和不發(fā)達(dá)國(guó)家每年造成9 380萬(wàn)例食源性疾病和15.5萬(wàn)人死亡[2]。在中國(guó)，從2008年到2012年，大約有70例沙門(mén)菌病的報(bào)告，4 151例住院病例和4例死亡[2-4]。常規(guī)使用抗菌藥物一直被認(rèn)為是消除沙門(mén)菌污染最有效的干預(yù)策略。然而，最近多重耐藥沙門(mén)菌的流行加重了其對(duì)公共健康的威脅，因此，減少食品中的沙門(mén)菌污染對(duì)預(yù)防人類(lèi)沙門(mén)菌病至關(guān)重要。在過(guò)去10年中，出現(xiàn)各種基于化學(xué)、物理或生物制劑的策略來(lái)滅活食品中的沙門(mén)菌，如臭氧[5]、電解氧化水[6]、高壓二氧化碳[7]和噬菌體[1]。然而，這些技術(shù)在食品行業(yè)的應(yīng)用仍有一些局限性，如商業(yè)應(yīng)用的成本高(臭氧)、功效低(電解氧化水)、嚴(yán)格的安全要求(高壓二氧化碳)和細(xì)菌抗性(噬菌體)[1,5-8]等。因此，開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物替代品勢(shì)在必行。

噬菌體是一類(lèi)能夠特異性侵染特定細(xì)菌的天然病毒，能夠?qū)ｉT(mén)識(shí)別并有效殺死它們的目標(biāo)細(xì)胞[9]。然而，細(xì)菌為了對(duì)抗噬菌體的侵染，已經(jīng)進(jìn)化出來(lái)抵抗噬菌體“入侵”的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生細(xì)菌抗性。因此，具有宿主特異性和宿主裂解活性的噬菌體細(xì)胞內(nèi)溶素可能比噬菌體更值得進(jìn)一步研究應(yīng)用[10-11]。

細(xì)胞內(nèi)溶素(endolysins)是由噬菌體編碼的酶，又稱(chēng)為裂解酶，在復(fù)制周期結(jié)束時(shí)通過(guò)降解細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分(肽聚糖，PG)，從而裂解宿主細(xì)菌細(xì)胞，釋放新組裝的子代噬菌體。裂解酶是一種新型的生物控制劑，當(dāng)它在大腸桿菌中以重組蛋白的形式外源表達(dá)時(shí)，可以殺死目標(biāo)細(xì)菌[12]。裂解酶已被證實(shí)其在控制食品中的細(xì)菌污染[13]和防治醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的細(xì)菌感染方面的功效[14]。因此，裂解酶作為針對(duì)感染性病原體的有效抗菌劑具有很大的潛力。與抗菌藥物相比，裂解酶有多種優(yōu)勢(shì)。首先，裂解酶專(zhuān)門(mén)針對(duì)細(xì)菌中的肽聚糖層，截至目前，還未出現(xiàn)耐藥性的報(bào)道[15]；其次，裂解酶可以通過(guò)基因工程改造，以改變其宿主范圍和殺滅效率[16-17]；再次，由于裂解酶的蛋白質(zhì)性質(zhì)，可以克隆到表達(dá)載體中進(jìn)行大規(guī)模的合成[18]。感染革蘭陽(yáng)性菌的噬菌體裂解酶已被充分研究，但感染革蘭陰性菌的噬菌體裂解酶的應(yīng)用仍處于初級(jí)階段。這是由于革蘭陰性菌細(xì)胞壁的特殊結(jié)構(gòu)，其外膜阻止裂解酶從外部進(jìn)入肽聚糖層[19-20]。然而，外膜透過(guò)劑(outer membrane permeabilizers,OMPs)和噬菌體裂解酶可以一起作用于革蘭陰性菌，如假單胞菌、大腸桿菌和沙門(mén)菌[21]。為了利用裂解酶的這一優(yōu)勢(shì)，需要進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)基于噬菌體裂解酶的新型生物控制劑，以對(duì)抗食源性致病菌。

本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的1株裂解性沙門(mén)菌噬菌體T139[22]及其裂解酶LysT40進(jìn)行生物信息學(xué)分析和蛋白裂解活性分析，旨在為開(kāi)發(fā)噬菌體裂解酶這一新型抗菌劑用于沙門(mén)菌的防控奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌 株

噬菌體T139由實(shí)驗(yàn)室前期以鼠傷寒沙門(mén)菌(SalmonellaTyphimurium)ATCC 13311為宿主菌從污水樣品中分離并保存，為1株裂解性、短尾噬菌體科(Podoviridae)的鼠傷寒沙門(mén)菌噬菌體。

1.2 儀器與試劑

5417R小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；BSO-130011A2超凈臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HNY-2102C全溫振蕩培養(yǎng)箱，武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；M200 PRO酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；Optima L-90K超速離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司；Odyssey Fc化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，美國(guó)LI-COR；POWER/PAC300小型蛋白電泳系統(tǒng)、Universal Hood Ⅱ凝膠掃描成像儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、15 kb DNA Marker，TaKaRa公司；質(zhì)粒pET28b和E.coliBL21(DE)感受態(tài)細(xì)胞，美國(guó)Addgene公司；DNase Ⅰ、RNase A、HisPur Ni-NTA Resin蛋白純化、6x-His Tag Monoclonal Antibody、Super Signal West Pico、Goat anti-Mouse IgG Cross-Adsorbed Secondary Antibody，美國(guó)Thermofisher公司；BCA蛋白定量試劑盒、10 ku 超濾管，默克生命科學(xué)；30%丙烯酰胺、TMEMD，廣州 Bio-Foxx；中分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、DAB 顯色液、Western 封閉液，碧云天生物；透析袋，廣州健陽(yáng)生物有限公司；鼠抗組氨酸抗體、山羊抗鼠抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；QIAquick Gel Extraction Kit，美國(guó)QI公司；AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit 250-prep，愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；酶標(biāo)板，型號(hào)9018，美國(guó)康寧公司。

根據(jù)噬菌體T139基因組注釋結(jié)果，設(shè)計(jì)上下游引物擴(kuò)增orf40基因序列，引物序列如下：F：CCGCTCGAGCCATGGGCTACAACCACGGT；R：CATGCCATGGCTCGAGTTGCTGCATCTCTT(下劃線分別代表XhoⅠ和NcoⅠ酶切位點(diǎn))，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 噬菌體T139顆粒的富集

參照文獻(xiàn)[23]中λ噬菌體顆粒提取方法，簡(jiǎn)述如下：LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)對(duì)數(shù)期的宿主菌液加入噬菌體T139懸液，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)液由渾濁變至澄清。加入氯仿，37 ℃振蕩培養(yǎng)。加入DNaseⅠ和RNase A消化宿主菌的DNA和RNA。向溶液中加入固體NaCl(終濃度為1 mol/L)，冰浴1 h后離心，收集上清液。在上清中加入固體PEG 8000沉淀噬菌體顆粒，于4 ℃冰箱過(guò)夜沉淀。低溫離心，回收沉降的噬菌體，去上清。將沉淀重懸于TE緩沖液中，使用氯仿抽提噬菌體懸液中的PEG和細(xì)胞碎片離心，分離有機(jī)相和親水相，回收含噬菌體顆粒的親水相，4 ℃保存。

1.4 噬菌體T139基因組提取與測(cè)序

用DNase Ⅰ(1 U/ml)和RNase A(10 μg/mL)處理如前所述富集得到的噬菌體T139，以消化細(xì)菌核酸?；旌衔镌?7 ℃下孵育40 min。然后加熱到95 ℃使酶失活，再孵育10 min。用噬菌體DNA分離試劑盒(NORGRN BIOTEK CORP,Thorold,ON,Canada)提取和純化噬菌體T139的基因組DNA，按照說(shuō)明書(shū)將噬菌體基因組與HindⅢ和EcoRⅤ混合，37 ℃水浴4 h，樣品采用瓊脂糖凝膠電泳分析酶切圖譜。噬菌體T139的基因組使用全基因組鳥(niǎo)槍法(whole genome shotgun,WGS)策略和Illumina Hiseq DNA測(cè)序平臺(tái)(Illumina,San Diego,CA,USA)進(jìn)行測(cè)序。使用軟件SPAdes 3.14.0對(duì)合格的序列進(jìn)行重新組裝，得到T139的完整基因組序列。

1.5 噬菌體T139基因組生物信息學(xué)分析

使用GeneMarkS(http://topaz.gatech.edu/GeneMark/)、ORF finder(https://indra.mullins.microbiol.washington.edu/sms2/orf_find.html)和RAST(https://rast.nmpdr.org/rast.cgi)對(duì)所有開(kāi)放閱讀框架(Open reading frames,ORFs)進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用BLASTp與蛋白域數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋和功能分析。編碼tRNA的基因用tRNAScan-SE(http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/)進(jìn)行篩選?；蚪M圖是用軟件BRIG(0.95)生成的。推測(cè)的毒力因子和抗生素抗性基因由毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)(VFDB,http://www.mgc.ac.cn/VFs/)和綜合抗生素抗性數(shù)據(jù)庫(kù)(CARD,https://card.mcmaster.ca/analyze/rgi)進(jìn)行篩選。

根據(jù)ICTV(The International Committee on Taxonomy of Viruses)的病毒分類(lèi)和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，選擇相似度較高的噬菌體。使用MEGA 7軟件，以末端酶大亞基的蛋白序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(Tree method：Neighbor-Joining)。

1.6 LysT40生物信息學(xué)分析

通過(guò)在線工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)LysT40序列的理化性質(zhì)，包括等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)和親水系數(shù)；使用NCBI CDD和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)序列保守結(jié)構(gòu)域；通過(guò)在線工具PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)預(yù)測(cè)gp38序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用BLASTp搜索非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)(non-redundant database，nr database)，找到與LysT40相似的氨基酸序列。同時(shí)，用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)和Jalview 2.11.0軟件對(duì)沙門(mén)菌噬菌體裂解酶的序列(來(lái)自BLASTp)進(jìn)行比較。然后，通過(guò)NCBI保守域數(shù)據(jù)庫(kù)和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)保守域進(jìn)行預(yù)測(cè)。LysT40序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)是由Jalview 2.11.0軟件中的在線工具JPred在線服務(wù)器預(yù)測(cè)的。

1.7 裂解酶基因orf 40的克隆以及重組表達(dá)載體的構(gòu)建

噬菌體T139基因組經(jīng)過(guò)功能注釋后預(yù)測(cè)到orf40是編碼噬菌體裂解酶中內(nèi)肽酶的基因。以噬菌體T139的基因組為模板，設(shè)計(jì)引物F：CCGCTCGAGCCATGGGCTACAACCACGGT；R：CATGCCATGGCTCGAGTTGCTGCATCTCTT(下劃線分別代表XhoⅠ和NcoⅠ酶切位點(diǎn))擴(kuò)增目的基因orf40。參照TaKaRa公司的XhoⅠ和NcoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶說(shuō)明書(shū)，使用限制酶XhoⅠ和NcoⅠ酶切擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET28b，37 ℃過(guò)夜酶切。按照QIAquick Gel Extraction Kit操作說(shuō)明書(shū)對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收，并進(jìn)行瓊脂凝膠電泳檢測(cè)。根據(jù)T4 DNA連接酶說(shuō)明書(shū)，將裂解酶基因與pET28b的雙酶切產(chǎn)物連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28b-orf40。將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。

1.8 重組蛋白LysT40的表達(dá)和純化

挑取含重組質(zhì)粒的單菌落接種于含卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。吸取未經(jīng)誘導(dǎo)的菌液作為陰性對(duì)照，在剩余的菌液中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，終濃度1 mmol/L)，將加入IPTG后的菌液與未誘導(dǎo)的對(duì)照均分別按下列不同條件進(jìn)行培養(yǎng)：16 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)4 h，37 ℃培養(yǎng)4 h。收集不同表達(dá)條件的樣品，12 000 r/min 離心15 min收集菌體。用200 μL的PBS重懸菌體，超聲破碎細(xì)胞，超聲時(shí)間2 s，間隔2 s，總計(jì)4 min，離心分離上清和沉淀。分別取10 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證表達(dá)情況。

將陽(yáng)性單菌落轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)。加入IPTG至終濃度1 mmol/L，16 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，離心收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，加入PBS緩沖液，超聲處理(超聲時(shí)間2 s，間隔2 s，總計(jì)30 min)，離心后收集上清。采用HisPur Ni-NTA樹(shù)脂親和層析純化目的蛋白。將蛋白樣品分裝置于-20 ℃保存，取2.5 μL進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)。采用BCA蛋白定量試劑盒繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的蛋白濃度。

1.9 裂解酶 LysT40 裂解活性驗(yàn)證

參照Mikoulinskaia等[24]和Lim等[25]的方法，步驟如下：接種宿主菌鼠傷寒沙門(mén)菌ATCC 13311于LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜生長(zhǎng)，按1∶100(V/V)轉(zhuǎn)接于25 mL 培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3 h，使用含氯仿(0.5%，V/V)或是100 mmol/L EDTA的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.2)重懸菌體，溫和震蕩后靜置20 min，采用無(wú)菌去離子水離心洗滌3次，將沉淀重懸于含有0.1%Triton X-100的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.2)緩沖液中，并調(diào)整OD600為 0.8～1.0，將50 μL裂解酶(終濃度 2 μmol/L)添加至200 μL細(xì)菌重懸液中，使用相同體積的含0.1% Triton X-100 的Tris-HCl 緩沖液代替裂解酶作為對(duì)照，觀察并測(cè)定OD600值。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)平行。運(yùn)用GraphPad Prism軟件進(jìn)行繪圖和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體T139基因組酶切圖譜分析

噬菌體T139的基因組酶切電泳圖如圖1所示。由圖1可知，噬菌體T139的基因組無(wú)蛋白及RNA污染，經(jīng)過(guò)4 h水浴酶切，噬菌體T139基因組成功被EcoRⅤ酶切，證實(shí)噬菌體T139的基因組為雙鏈DNA。

1:15 000 bp DNA marker; 2:噬菌體T139基因組； 3：基因組經(jīng)HindⅢ酶切； 4：基因組經(jīng)EcoRⅤ酶切。1:15 000 bp DNA marker; 2:Complete genome of phage T139; 3:Nucleic acid digested by HindⅢ; 4:Nucleic acid digested by EcoRⅤ.

2.2 噬菌體T139功能基因組學(xué)分析

經(jīng)測(cè)序后分析發(fā)現(xiàn)，噬菌體T139的基因組長(zhǎng)度為38 854 bp，堿基分布情況為A(24.39%)、T(26.51%)、C(26.17%)、G(22.93%)，C+G平均含量為49.10%。噬菌體T139全基因組序列BLASTn分析比較的結(jié)果顯示，噬菌體T139與某些噬菌體基因組的同源性較高。首先，與沙門(mén)菌噬菌體BP12A(索引號(hào)：KM366096.1)全基因組相似性最高，覆蓋范圍為95%，相似性為98.2%；另外，與大腸桿菌噬菌體BA14(索引號(hào)：EU734171.1)相似性較高，覆蓋范圍為89%，相似性為85.46%。

噬菌體T139基因組共有43個(gè)ORF，最長(zhǎng)ORF為3 948 bp，最短的僅150 bp，平均長(zhǎng)度為813 bp。ORF總長(zhǎng)為34 977 bp，占全長(zhǎng)的90.02%。經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)，推測(cè)出的43個(gè)ORF中有23個(gè)ORF已確定功能，注釋見(jiàn)表1。按照功能的不同，被分類(lèi)為核酸代謝與DNA包裝、除尾部之外的結(jié)構(gòu)蛋白基因、裂解相關(guān)基因、尾部相關(guān)蛋白及未知蛋白五大類(lèi)，其基因組圖譜如圖2A所示。噬菌體T139的基因注釋中共注釋到3個(gè)與裂解宿主細(xì)胞相關(guān)的基因，包括細(xì)胞內(nèi)溶素(ORF24，endolysin)、內(nèi)肽酶(ORF40，endopeptidase)和穿孔素(ORF42，holin)，進(jìn)一步證明噬菌體T139是1株裂解性噬菌體。利用MEGA軟件構(gòu)建的噬菌體T139進(jìn)化樹(shù)如圖2B所示，基于保守的末端酶大亞基序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，由圖3B可知，噬菌體T139與噬菌體Escherichiaphage P483 形成一簇，二者親緣關(guān)系最近，屬于短尾噬菌體科T7型噬菌體屬。采用tRNAscan-SE預(yù)測(cè)全基因組中的tRNA基因，結(jié)果顯示無(wú)tRNA。利用Res Finder預(yù)測(cè)噬菌體T139基因組中無(wú)抗生素抗性基因，利用Virulence Finder預(yù)測(cè)噬菌體T139 基因組中不存在毒力基因。因此，該結(jié)果從遺傳背景上證實(shí)噬菌體T139應(yīng)用于食品中病原菌防控及噬菌體治療的安全性。

表1 噬菌體T139的開(kāi)放讀框及其功能預(yù)測(cè) Table 1 ORF and its function prediction of phage T139

A:噬菌體T139基因組圖譜。每一圈代表的含義(由內(nèi)向外)依次為：以bp為單位的基因刻度； GC含量； GC偏移，偏移值大于零為綠色，小于零為紫紅色；基因組基因注釋。B：噬菌體T139的進(jìn)化關(guān)系(以末端酶大亞基序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù))。A： Genome map of phage T139. The meaning of each circle (from the inside) sequentially represented:the gene scale of bp; GC content; GC skew,values greater than zero are in green and the smaller are in magenta; genomic gene annotation. B：Evolutionary relationships of phage T139 (construction of an evolutionary tree with terminal enzyme large subunit sequences).

2.3 裂解酶LysT40生物信息學(xué)分析

根據(jù)對(duì)噬菌體T139功能基因組的分析，選取基因功能注釋的內(nèi)肽酶(ORF40,endopeptidase)的序列(表1)作為研究對(duì)象。利用ProtParam工具對(duì)LysT40序列理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LysT40由126個(gè)氨基酸組成，等電點(diǎn)為5.46，不穩(wěn)定系數(shù)為25.66，親水系數(shù)為-0.887。一般而言，不穩(wěn)定系數(shù)小于40表明該蛋白較為穩(wěn)定，親水系數(shù)為負(fù)值表明該蛋白具有一定的親水性。通過(guò)BLASTp對(duì)LysT40進(jìn)行序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)LysT40與噬菌體內(nèi)肽酶有很高的相似度。選擇BLASTp結(jié)果中的內(nèi)肽酶序列進(jìn)行多序列比對(duì)，它們是沙門(mén)菌噬菌體LPST144(相似度98.39%，E值9e-84)，BP12A(相似度98.39%，E值1e-83)，歐桿菌噬菌體FE44(相似度94.31%，E值6e-79)，埃希菌噬菌體P694(相似度93.05%，E值3e-78)和P483(相似度90.24%，E值3e-76)，果膠桿菌屬噬菌體PcCB251(相似度90.32%，E值7e-76),耶爾森菌噬菌體fPS-53(相似度65.62%，E值4e-50)。LysT40序列是保守的，與其他噬菌體內(nèi)肽酶有很高的同源性。隨后，通過(guò)NCBI CDD和Pfam 32.0對(duì)LysT40的保守域進(jìn)行分析。根據(jù)NCBI CDD和Pfam預(yù)測(cè)，它屬于Phage_lysis Superfamily (Accession cl22701)中的Phage lambda Rz-like lysis protein(Accession PHA00276)，介于2～124 AA。分析表明，LysT40參與宿主的裂解，表明它是一種內(nèi)肽酶(endopeptidases)。LysT40的二級(jí)結(jié)構(gòu)以螺旋結(jié)構(gòu)為主，占氨基酸全長(zhǎng)為70.63%，片狀結(jié)構(gòu)較少(5.56%)，說(shuō)明該裂解酶具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)(圖3)。

2.4 裂解酶基因orf 40的克隆及重組表達(dá)載體pET28b- LysT40的構(gòu)建

以噬菌體T139的基因組序列為模板，設(shè)計(jì)上下游引物擴(kuò)增目的基因，將裂解酶基因克隆到原核表達(dá)載體pET28b中(目的基因插入位點(diǎn)為酶切位點(diǎn)XhoⅠ和NcoⅠ處)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28b-LysT40。為了便于觀察目標(biāo)條帶，采用MluⅠ和XhoⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示酶切產(chǎn)物包括載體條帶(約4 400 bp)和包含目的基因的條帶(約1 300 bp)(圖4)。同時(shí)，重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果表明，內(nèi)肽酶的基因已正確地插入到載體pET28b中，表明重組質(zhì)粒pET28b-LysT40構(gòu)建成功。

A：裂解酶LysT40結(jié)構(gòu)域分析；B：多序列比對(duì)結(jié)果與LysT40二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，圖中藍(lán)色的深淺代表序列之間的相似度，顏色越深代表相似度越高，紅色箭頭代表LysT40序列，紅色線條代表螺旋結(jié)構(gòu)，綠色箭頭表示片層結(jié)構(gòu)。A：Endolysin LysT40 structural domain analysis; B：Multiple sequence comparison results with LysT40 secondary structure analysis,the shades of blue in the graph represent the similarity between sequences,the darker the color represents the higher similarity,red arrows represent LysT40 sequences,red lines represent helical structures,green arrows represent sheet structures.

1:重組質(zhì)粒pET28b-LysT40雙酶切 Recombinant plasmid pET28b-LysT40 double digestion； 2：Marker.

2.5 重組蛋白的表達(dá)和純化

重組表達(dá)載體pET28b-LysT40轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)后，使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并探究在不同誘導(dǎo)條件下的表達(dá)效果。預(yù)測(cè)的內(nèi)肽酶融合蛋白分子質(zhì)量理論值約14 ku，從圖5A可知，BL21(DE3)表達(dá)的蛋白大小與預(yù)測(cè)值相符。目的蛋白多以包涵體的形式存在于破碎沉淀中，在破碎上清中濃度較低。為了便于純化，選擇直接純化上清液。另外，目標(biāo)蛋白在上清中的表達(dá)量于16 ℃下過(guò)夜誘導(dǎo)濃度較高，因此選擇16 ℃下過(guò)夜誘導(dǎo)為最佳條件。裂解酶LysT40經(jīng)純化后(圖5B)，可在10～15 ku獲得目的蛋白條帶，但是純

A：不同誘導(dǎo)條件對(duì)LysT40表達(dá)影響的SDS-PAGE(1：40 ku Marker； 2：誘導(dǎo)前菌體； 3：16 ℃ 誘導(dǎo)過(guò)夜上清蛋白； 4：30 ℃誘導(dǎo) 4 h上清蛋白； 5：37 ℃誘導(dǎo) 4 h 上清蛋白； 6：16 ℃誘導(dǎo)過(guò)夜沉淀蛋白； 7：30 ℃誘導(dǎo) 4 h 沉淀蛋白； 8：37 ℃誘導(dǎo) 4 h 沉淀蛋白)；B：重組蛋白的純化(1：180 ku Marker；2：純化后的蛋白)； C：蛋白印跡(1：純化后的蛋白；2：180 ku Marker)。A：SDS-PAGE of different induction conditions on LysT40 expression(1:40 ku Marker; 2:Strain before induction; 3:Supernatant protein induction overnight at 16 ℃; 4:Supernatant protein induction 4 h at 30 ℃; 5:Supernatant protein induction 4 h at 37 ℃; 6:Sediment protein induction overnight at 16 ℃; 7:Sediment protein induction 4 h at 30 ℃; 8:Sediment protein induction 4 h at 37 ℃);B：Lysin protein SDS-PAGE (1:Marker; 2:Protein after purification); C:Western blot(1:Purified protein; 2:180 ku Marker).

度較低，純化后蛋白經(jīng)BCA 試劑盒定量測(cè)定，其質(zhì)量濃度為 280 μg/mL。用Western blot分析(圖5C)，結(jié)果顯示在10～15 ku有單一條帶，即獲得目的蛋白LysT40。

2.6 裂解酶LysT40對(duì)細(xì)菌的裂解活性

將鼠傷寒沙門(mén)菌的細(xì)胞壁經(jīng)過(guò)氯仿或EDTA處理后，利用濁度法檢測(cè)裂解酶LysT40對(duì)于細(xì)菌的裂解活性，結(jié)果如圖6所示。氯仿預(yù)處理的菌液中加入裂解酶之后，實(shí)驗(yàn)組的OD600值相比于對(duì)照組大約從5 min時(shí)開(kāi)始下降，直至30 min時(shí)相比于對(duì)照組下降0.18，下降約21%(圖6A)。EDTA預(yù)處理的菌液中加入裂解酶之后，實(shí)驗(yàn)組的OD600值相比于對(duì)照組從0 min開(kāi)始下降，直至30 min時(shí)相比于對(duì)照組下降0.31，下降約42%(圖6B)。相比之下，EDTA預(yù)處理的裂解效果優(yōu)于氯仿預(yù)處理的裂解效果。

由于外膜的保護(hù)，革蘭陰性菌在很大程度上對(duì)外源添加的裂解酶具有抵抗力。然而，用氯仿/EDTA去除細(xì)胞外膜可以顯著提高LysT40對(duì)宿主細(xì)胞的裂解活性。在本研究中，使用2 μmol/L的LysT40作用于外膜透過(guò)劑預(yù)處理的鼠傷寒沙門(mén)菌(ATCC13311)，其OD600下降了約42%，表現(xiàn)出較好的裂解活性，具有作為食品中抗沙門(mén)菌制劑的潛力。

A:氯仿預(yù)處理鼠傷寒沙門(mén)菌 ATCC 13311; B:EDTA預(yù)處理鼠傷寒沙門(mén)菌 ATCC 13311。A:Chloroform-treated Salmonella Typhimurium ATCC 13311; B:EDTA-treated Salmonella Typhimurium ATCC 13311.

3 討 論

噬菌體基因組學(xué)的研究意義重大，主要體現(xiàn)在2個(gè)方面，一是噬菌體種群的豐度為噬菌體基因組如何與宿主聯(lián)系以及種群的進(jìn)化機(jī)制提供解釋?zhuān)欢腔蚪M學(xué)推進(jìn)噬菌體用于遺傳、生物技術(shù)和臨床工具開(kāi)發(fā)的用途[26]。目前已有300多株沙門(mén)菌噬菌體完成全基因組學(xué)研究工作。不同的噬菌體基因組大小也不盡相同，另外，截至2008年噬菌體基因組大小在10 kb以下的占20%，基因組大小在30～50 kb的占50%，基因組大小在100～200 kb的占6%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果雖不能完全真實(shí)地反映環(huán)境中噬菌體基因組大小的分布，但在一定程度上能夠反映當(dāng)時(shí)噬菌體的分離方法及可用的測(cè)序技術(shù)等[27]。噬菌體T139基因組經(jīng)過(guò)軟件分析發(fā)現(xiàn)不包含tRNA，tRNA存在多種病毒的基因組中，其中在大的雙鏈DNA基因組的原核生物中最常見(jiàn)，對(duì)于噬菌體來(lái)說(shuō)，編碼的tRNA在肌尾噬菌體科和長(zhǎng)尾噬菌體科中是常見(jiàn)的，最多每個(gè)基因組中編碼41個(gè)tRNA[28]。存在于噬菌體中的tRNA對(duì)應(yīng)于被噬菌體基因高度使用的密碼子，烈性噬菌體比溫和噬菌體含有更多的tRNA，推測(cè)tRNA可能有助于噬菌體獲取更高的裂解性[29]。

本研究所用噬菌體T139為短尾噬菌體科，全基因組分析其基因組大小為38 854 bp。Blast分析結(jié)果顯示T139與T7噬菌體屬的沙門(mén)菌噬菌體BP12A全基因組相似性最高，相似性為98.2%。進(jìn)化樹(shù)分析表明該噬菌體與同屬于短尾噬菌體科的T7型噬菌體屬的噬菌體P483親緣關(guān)系最近。根據(jù)國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)噬菌體基因組序列相似性超過(guò)50%的可認(rèn)定為同一屬，故噬菌體T139屬于T7型噬菌體屬[30]。噬菌體T139基因組功能注釋將其功能基因大致分為核酸代謝與DNA包裝、除尾部之外的結(jié)構(gòu)蛋白基因、裂解相關(guān)基因、尾部相關(guān)蛋白及未知蛋白五大類(lèi)，其中有3個(gè)與細(xì)胞裂解相關(guān)的功能基因，證明該噬菌體的裂解性能。基因組序列比對(duì)分析表明噬菌體T139不含有毒力基因和抗生素抗性基因，從遺傳背景上證實(shí)噬菌體T139應(yīng)用于食品中生物防控及噬菌體治療的安全性。噬菌體T139的基因注釋中共注釋到3個(gè)與裂解宿主細(xì)胞相關(guān)的基因，包括細(xì)胞內(nèi)溶素(ORF24，endolysin)、內(nèi)肽酶(ORF40，endopeptidase)和穿孔素(ORF42，holin)，本研究選取裂解酶之一的內(nèi)肽酶(ORF40，endopeptidase)作為研究對(duì)象，驗(yàn)證其裂解能力，為今后開(kāi)發(fā)基于裂解酶的抗菌劑奠定研究基礎(chǔ)。

本研究異源表達(dá)、純化得到噬菌體T139中與裂解相關(guān)的內(nèi)肽酶LysT40，并證實(shí)其對(duì)氯仿或EDTA處理后的沙門(mén)菌具有裂解活性。一般情況下，噬菌體裂解酶作用于革蘭陰性菌細(xì)胞壁上的肽聚糖靶點(diǎn)，而由于革蘭陰性菌細(xì)胞壁表面有一層外膜作為屏障，會(huì)阻止裂解酶直接作用于肽聚糖，因此，需要首先采用透膜劑(如氯仿和EDTA)對(duì)菌體進(jìn)行預(yù)處理，再采用濁度法研究裂解酶的裂解活性[27,31-32]。本研究在透膜劑的協(xié)助下，該內(nèi)肽酶能夠有效裂解宿主菌，30 min后細(xì)菌的吸光值OD600相比于未加裂解酶的對(duì)照組分別下降0.18和0.31，下降幅度約21%和42%，有較好的裂解活性。在Henry等[33]的研究中，加入重組裂解酶gp29 1 h后大腸桿菌吸光值OD600下降約30%；Lim等[25]的研究中，不加透膜劑EDTA時(shí)，裂解酶SPN1S不影響細(xì)胞懸液中菌量，當(dāng)加入EDTA時(shí)，裂解酶導(dǎo)致細(xì)菌活力顯著降低。裂解酶殺菌的機(jī)制在于裂解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)構(gòu)。肽聚糖結(jié)果中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的糖苷鍵及N-乙酰胞壁酸和寡肽之間的連接鍵在細(xì)菌種屬之間通常是保守的，因此，裂解酶通常能夠表現(xiàn)出較廣的裂解效果[34]。裂解酶SPN1S能夠在10 min內(nèi)裂解所有測(cè)試的21株EDTA處理的革蘭陰性菌株，對(duì)大腸桿菌具有最高活性，但沒(méi)有檢測(cè)到針對(duì)革蘭陽(yáng)性菌株的活性[25]。作為一種有前途的替代物，裂解酶有許多優(yōu)點(diǎn)，如快速裂解細(xì)胞、特定的宿主范圍[35]、無(wú)特異性抗藥性[14,36-38]等。由于這些優(yōu)點(diǎn)，裂解酶被認(rèn)為是一種替代性的抗菌劑，在食品工業(yè)中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究對(duì)噬菌體T139的基因組進(jìn)行分析，并對(duì)裂解酶LysT40進(jìn)行裂解活性驗(yàn)證，將其與外膜透過(guò)劑作用于沙門(mén)菌，使得菌體裂解，表明其具有作為抗菌劑的潛力。在未來(lái)的研究中，將在裂解酶LysT40的穩(wěn)定性、裂解譜等方面開(kāi)展相關(guān)研究。另一方面，該裂解酶的裂解效果較弱，利用分子改造等手段改造裂解酶LysT40的氨基酸組成，提高裂解酶的酶解能力。

由于噬菌體對(duì)細(xì)菌的特異性裂解使得噬菌體成為一種天然的抗菌劑，然而國(guó)內(nèi)利用噬菌體進(jìn)行食品抑菌處理仍處于初步階段，且并沒(méi)有獲得批準(zhǔn)的商業(yè)噬菌體制劑，仍需要進(jìn)一步的探索和研究。本研究在對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌噬菌體T139基因組進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，發(fā)掘到一個(gè)編碼裂解酶中內(nèi)肽酶的基因序列，采用蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和異源表達(dá)純化，成功驗(yàn)證該內(nèi)肽酶基因orf40的表達(dá)產(chǎn)物L(fēng)ysT40對(duì)沙門(mén)菌具有裂解活性，具有潛在的應(yīng)用前景，可為構(gòu)建新型抗菌劑提供技術(shù)支撐。