2-苯乙醇生物合成的研究進展

嚴偉 ，高豪 ，蔣羽佳 ，錢秀娟 ，周杰 ，2，董維亮 ，2，章文明 ，2，信豐學 ，2，姜岷 ，2

（1 南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816；2 南京工業(yè)大學江蘇先進生物與化學制造協(xié)同創(chuàng)新中心（SICAM），江蘇 南京 211816）

1 2-苯乙醇概述

2-苯乙醇（2-PE）是一種具有玫瑰花香味的脂肪醇，因其具有溫和的、淡雅的玫瑰花般的氣味，被認為是食品和化妝品工業(yè)中的重要香料成分［1］。此外，它還可被用作合成其他香料或藥物化合物的底物，如苯乙酸、苯乙醛和乙酸苯乙酯等［2-3］。在自然界中，2-PE 主要從玫瑰、茉莉花、番茄和蕎麥等花卉和植物組織的精油中提?。?-5］。然而，由于這些植物中的2-PE 濃度非常低，因此萃取過程非常復雜，并且花卉的收獲也會受到天氣、植物病害和貿(mào)易限制等因素的影響。從玫瑰或其他植物的精油中提取天然2-PE 的成本非常高，如提取天然2-PE 的原料玫瑰精油國際市場的價格就已高達 3500～6000 美元/kg［6］。所有這些因素都是導致天然2-PE的供應不足和成本過高的主要原因［7］。

目前，全球市場上2-PE 的年產(chǎn)量已經(jīng)超過10 000 t，其主要生產(chǎn)方法是苯-環(huán)氧乙烷合成法和氧化苯乙烯加氫法，國際市場上苯-環(huán)氧乙烷合成法產(chǎn)品占40%，氧化苯乙烯加氫法產(chǎn)品占60%。苯-環(huán)氧乙烷合成法生產(chǎn)的產(chǎn)品所含微量雜質(zhì)不同，香氣差異較大，大多不能用于香料，國內(nèi)主要采用氧化苯乙烯加氫法［8］。化學合成過程一般在高溫、高壓、強酸或強堿環(huán)境等惡劣條件下操作，會產(chǎn)生許多不良副產(chǎn)物，如乙苯、苯乙烯等，這不僅增加了下游成本，而且嚴重降低了2-PE 的級別［9］。對環(huán)保工藝日益增長的需求以及消費者對“天然”產(chǎn)品的偏好極大地刺激了香料和香料生物生產(chǎn)工藝的發(fā)展［10］。許多具有2-PE 生產(chǎn)能力的野生型菌株已經(jīng)被分離并鑒定，其中大多數(shù)是真核生物，包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）等［11-19］。然而，除了葉微桿菌（Microbacterium foliorum）、變形桿菌（Proteus vulgaris）和嗜冷桿菌（Psychrobactersp.）外，很少有原核生物可以合成2-PE。生物轉(zhuǎn)化過程通常在溫和的條件下進行，產(chǎn)物選擇性高。此外，根據(jù)美國食品和藥物管理局以及相關(guān)的歐洲法規(guī)規(guī)定，如果用于生產(chǎn)過程的底物是天然的，則生物生產(chǎn)的2-PE 會被認為是“天然的”［20］。目前，利用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)2-PE 已取得重大突破。其中，合成生物學著力于構(gòu)建“非自然存在下的生化系統(tǒng)”，通過利用不同的生物元件，構(gòu)建全新的菌株代謝網(wǎng)絡，從而高效合成人類需求的代謝產(chǎn)物。通過使用有效的代謝工程策略可以調(diào)節(jié)不同酶的基因表達水平，以找到最佳平衡，進而改善代謝通量并減少代謝負擔或其他副作用，從而將廉價的葡萄糖或苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為高附加值的2-PE。本文作者全面綜述2-PE合成的各種途徑、調(diào)控機制以及提高2-PE產(chǎn)量的策略。同時，討論了農(nóng)工廢棄物作為2-PE生產(chǎn)原料的利用和原位產(chǎn)物分離（ISPR）技術(shù)的應用。

2 微生物中2-苯乙醇的生物合成路徑

目前，2-PE 的生物合成主要有3 種途徑（圖1）。其中，艾氏途徑是最重要的途徑，在氮限條件下，L-苯丙氨酸（L-Phe）通過三步酶催化反應轉(zhuǎn)化為2-PE。第2個途徑是莽草酸途徑，它是以葡萄糖等碳水化合物為底物從頭合成2-PE。然而，這種復雜的反應途徑具有強烈的反饋抑制作用，導致2-PE生產(chǎn)效率低下。最后一種是苯乙胺途徑，它與艾氏途徑類似，在植物中起著更重要的作用。

2.1 艾氏途徑

艾氏途徑廣泛存在于各種微生物中，它負責將支鏈氨基酸（亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）和含硫氨基酸（蛋氨酸）分解代謝成相應的雜酸或高級醇［21］。該途徑最初是由艾氏（Ehrlich）描述的，因此用其名字進行命名［22］。如圖1 所示，在該途徑中，L-Phe 首先被轉(zhuǎn)氨酶（ARO8，ARO9，BAT1/TWT1 和BAT2/TWT2）氨基化為苯丙酮酸，然后被苯丙酮酸脫羧酶（YDR380w/ARO10，YDL080C/THI3，PDC1，PDC5 和 PDC6）脫羧為苯乙醛，最后通過醇脫氫酶（ADH1，ADH2，ADH3，ADH4 和 ADH5）或甲醛脫氫酶（SFA1）還原為2-PE［21］。

圖1 2-苯乙醇的生物合成途徑Fig.1 2-PE synthetic pathways

在艾氏途徑中關(guān)鍵酶的表達水平會受到相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控和氮調(diào)控策略的調(diào)節(jié)。其中，Zn2CyS6家族轉(zhuǎn)錄激活因子ARO80 是2-PE 合成中最重要的調(diào)控因子之一。研究結(jié)果表明，ARO80可以與aro9和aro10的啟動子組成性結(jié)合，在芳香族氨基酸的存在下，ARO80可以激活aro9與aro10的表達。在芳香族氨基酸作為唯一氮源的條件下，芳香族氨基酸通過氨基酸通透酶Gap1 進入細胞，Aro80 接受芳香族氨基酸的誘導信號后與aro9和aro10基因啟動子上的CCG 重復序列結(jié)合，激活艾氏途徑關(guān)鍵酶基因的表達［23-24］。除ARO80 以外，與碳代謝有關(guān)的鋅簇蛋白CAT8 同樣是艾氏途徑中一個重要的激活因子，它在調(diào)節(jié)受芳香醇影響的基因（如Adh2）的差異表達中起著重要作用［25-27］。同時，CAT8 的表達還會受到具有兩個Cys2His2鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子MIG1 的調(diào)控，CAT8 的過表達或MIG1 的缺失可以有效增加aro9和aro10的轉(zhuǎn)錄，從而使更多的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為苯乙醛［28］。

此外，艾氏途徑中關(guān)鍵酶的表達水平也會受到氮源種類的影響。當培養(yǎng)基中存在優(yōu)選氮源（銨或天冬酰胺）時，氮分解代謝物阻抑（NCR）的全局氮調(diào)控會嚴重限制酵母使用非優(yōu)選氮源（亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和脯氨酸）的能力［29］。從分子生物學的角度來看，目前已經(jīng)鑒定出4 個可以影響NCR 敏感基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的GATA 因子，其中包括兩個激活因子（Gln3 和Gat1/Nil1）以及兩個阻遏因子（Dal80/Uga43 和Gzf3/Nil2/Deh1）［30］。當優(yōu)選氮源存在時，Gln3 和Gat1 被隔離在細胞質(zhì)中，無法參與靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。當無優(yōu)選氮源存在時，Gln3 和Gat1 就會轉(zhuǎn)移到細胞核中，從而激活NCR 敏感基因的表達［圖 2（a）］。另外，Gln3 還會受到 pr 病毒樣 URE2蛋白的負調(diào)控，攜帶失活URE2的細胞即使在優(yōu)選氮源存在時也能夠利用非優(yōu)選氮源［31］。此外，雷帕霉素也可以影響到氮調(diào)控，經(jīng)過雷帕霉素處理可以模擬氮饑餓環(huán)境，從而導致Gln3 和Gat1 的核定位和NCR 敏感基因的激活。研究表明，影響艾氏途徑中關(guān)鍵酶表達水平的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)和NCR調(diào)節(jié)呈現(xiàn)復雜的互補調(diào)節(jié)和部分自身調(diào)節(jié)，ARO80 是ARO80 靶啟動子招募GATA 因子所必需的，而GATA因子也可通過氨基酸通透性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控間接影響ARO80 的活性［30］，兩者之間相互協(xié)作共同調(diào)控艾氏途徑中關(guān)鍵酶的表達。此外，芳香醇的合成還會受到細胞密度的正反饋調(diào)節(jié)［32］。一般來說，由于芳香醇是群體感應分子，可以使酵母在氮饑餓的情況下轉(zhuǎn)變?yōu)榻z狀體，因此高密度的細胞每個細胞可以產(chǎn)生更多的芳香醇。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，在高細胞密度時［32］，aro9和aro10的轉(zhuǎn)錄水平顯著增強。圖2（b）顯示了通過艾氏途徑合成2-PE的總體調(diào)控圖，但其調(diào)控機制尚不清楚。

圖2 苯乙醇生物合成的代謝網(wǎng)絡調(diào)控Fig.2 Regulatory network of 2-PE synthesis

2.2 莽草酸/苯丙酮酸途徑

莽草酸/苯丙酮酸途徑是酵母等微生物中從頭合成2-PE 的途徑。該途徑將碳水化合物代謝與芳香族化合物合成聯(lián)系起來，其中包括3種芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）和其他芳香族次級代謝物。首先葡萄糖經(jīng)過糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑被轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸赤蘚糖，這兩種物質(zhì)再經(jīng)過4步酶促反應轉(zhuǎn)化為莽草酸，接著莽草酸經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化為苯丙酮酸。苯丙酮酸隨后如艾氏途徑［33］所述（圖1）通過脫羧和脫氫被轉(zhuǎn)化為2-PE。米曲霉、馬克思克魯維酵母和釀酒酵母等均表現(xiàn)出具有利用葡萄糖合成2-PE 的能力，但是由于其生物合成途徑復雜，代謝支路多且存在多種反饋抑制因子，2-PE 的產(chǎn)量很低。在最佳生長條件下，芳香族氨基酸的胞內(nèi)濃度足以使苯丙氨酸和酪氨酸敏感的同工酶基本上失活［34］。因此，尋找能夠增加L-Phe或苯丙酮酸池的優(yōu)質(zhì)菌株是提高利用莽草酸途徑合成2-PE 效率的關(guān)鍵。

2.3 苯乙胺途徑

苯乙胺途徑是與艾氏途徑相類似的途徑，該途徑首先是在釀酒酵母和米曲霉中得到研究［15，33］。在該途徑中，L-Phe 首先被脫羧成苯乙胺，然后被氧化脫氨成苯乙酸，最后被還原成2-PE（圖1）。苯乙胺途徑在諸如番茄等植物中起著非常重要的作用［35］。并且，在矮牽?；ê兔倒寤ò曛幸呀?jīng)發(fā)現(xiàn)了該途徑的替代方法，其中L-Phe 可以通過苯乙醛合酶（PAAS）一步轉(zhuǎn)化為L-苯乙醛。所有這些天然途徑的研究與發(fā)現(xiàn)為構(gòu)建基因工程菌株提供了有效酶的良好來源。

3 提高生物合成2-苯乙醇產(chǎn)量的策略

培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件對2-苯乙醇的合成影響很大。為提高2-苯乙醇生產(chǎn)的經(jīng)濟性，研究人員對菌種誘變選育、基因編輯、培養(yǎng)基組成優(yōu)化、發(fā)酵條件優(yōu)化等常規(guī)策略進行了廣泛研究，并取得了很大進展。

3.1 底盤菌株的篩選與構(gòu)建

2-苯乙醇可由許多微生物進行合成。然而，由于其產(chǎn)量仍然太低，現(xiàn)在并不適合于工業(yè)化生產(chǎn)。但是對于艾氏途徑和莽草酸途徑的研究為利用基因編輯等技術(shù)提高2-PE的產(chǎn)量提供了廣闊的前景。例如：通過過量表達ARO8 和ARO10，S.cerevisiaeS288在培養(yǎng)60 h后可以合成2.61 g/L 2-PE，比原始菌株高出36.8%［36］。為了加快L-Phe 在釀酒酵母中的轉(zhuǎn)運速度，Chen 等［37］通過過量表達MT2 和S.cerevisiaeYS58 來源的Gap1 基因來提高芳香族氨基酸轉(zhuǎn)運體的表達水平，2-PE 產(chǎn)量分別增加了26.5%和25.3%。此外，ARO80、GLN3、GAT1 和CAT8等全局調(diào)控因子的引入，使2-PE 產(chǎn)量分別顯著增加 58%、34.7%、30.6% 和 62%［7，28，37］。最近，在最佳發(fā)酵條件下，一個由L-Phe 轉(zhuǎn)運體Gap1、轉(zhuǎn)氨酶ARO8、苯丙酮酸脫羧酶ARO10、醇脫氫酶ADH2和谷氨酸脫氫酶GDH2組裝而成的人工構(gòu)建菌株S.cerevisiaeYS58（G1-A8-A10-A2）-GDH 在5 L 發(fā)酵罐中的2-PE 合成產(chǎn)量達到6.3 g/L（轉(zhuǎn)化率為95%），顯示出2-PE 產(chǎn)業(yè)化的良好前景［38］。

除艾氏途徑外，利用莽草酸途徑從頭合成2-PE 同樣具有重要意義。Aoki和 Uchida［15］獲得了一株經(jīng)過化學誘變處理的突變株Z. rouxiiNISL3355，使2-PE 產(chǎn)量提高了約38 倍。類似地，Kim 等［39］獲得了一株馬克思克魯維酵母的抗苯丙氨酸類似物（對氟苯丙氨酸）抗性突變體，該突變體在不添加L-Phe 的情況下從20 g/L 葡萄糖中可以產(chǎn)生1.3 g/L 2-PE。相比于傳統(tǒng)的誘變選育等方法，通過基因工程改造對于2-PE 的合成則更加有效。最近，Daran 等［40］在釀酒酵母中過量表達ARO4、ARO7、3ABP、TKL1、ARO10、PYK1D146N、EcaroL、ARO3K222L，并敲除aro3和aro8，最終使得2-PE 的產(chǎn)量達到 1.59 g/L。類似地，Xu 等［41］通過過 量 表 達ylPAR4、ylARO10、ylARO7、ylPHA2、scARO7G141S，并敲除ylPYK，使得Y.lipolyticaYL35以葡萄糖為底物可以合成2.42 g/L 2-PE，為目前利用莽草酸途徑合成2-PE的最高產(chǎn)量。

雖然酵母具有天然的2-PE 合成途徑，但發(fā)酵過程通常很長（2～4 d），這增加了設備成本和能源消耗，進一步限制了工業(yè)化的可擴展性。因此，除了酵母以外，大腸桿菌也取得了重大突破［42］。由于艾氏途徑不完整，野生的大腸桿菌無法合成2-PE，通過引入玫瑰來源的PAAS基因，經(jīng)過發(fā)酵48 h 該克隆菌株可以產(chǎn)0.34 g/L 2-PE。Guo 等在大腸桿菌 MG1655 中共表達aro8、KDC和yigB使 2-PE 的產(chǎn)量增加到 0.28 g/L［43］。同樣的，Atsumi等［44］通過在大腸桿菌 BW25113 中共表達kivD和ADH2也獲得了類似的結(jié)果，2-PE產(chǎn)量最終可以達到0.88 g/L。在艾氏途徑中，提高還原力NAD（P）H是合成2-PE 的一個重要因素。在全細胞轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，Hwang 等［45］將來源于枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶引入大腸桿菌，通過氧化葡萄糖來促進NAD（P）H的再生，從而使2-PE的產(chǎn)量提高了3倍。在另一項研究中，將來源于枯草芽孢桿菌的谷氨酸脫氫酶在大腸桿菌BW25113（31G）中過表達，以加速還原力的再生，最終工程菌株的2-PE 產(chǎn)量提高了250%。為了改善輔因子與還原力不足的問題，Wang等［46］開發(fā)了一種輔因子自給自足的系統(tǒng)，將谷氨酸脫氫酶與轉(zhuǎn)氨酶和乙醇脫氫酶偶聯(lián)，可同時再生共底物（2-酮酸）和氧化還原力［NAD（P）H］，最終使生物催化效率提高了3.8倍。和酵母一樣，大腸桿菌同樣擁有莽草酸途徑，通過引入一條從L-Phe到2-PE的路線，可以使其利用葡萄糖從頭 合 成 2-PE。 Guo 等［47］通 過 過量 表 達aroGfbr、pheAfbr、kdc、yjgB和aro8等基因，最終獲得可以利用葡萄糖合成1016 mg/L 2-PE 的工程菌株DG02。Koma 等［48］在大腸桿菌中進一步引入了T7啟動子來增強Azospirillum brasilense來源的苯丙酮酸脫羧酶基因（ipdC）和Lactobacillus brevis來源的乙醇脫氫酶基因（adhC）的表達，同時敲除內(nèi)源的苯乙醛脫氫酶基因（feaB）。該工程菌株最終利用葡萄糖合成7.7 mmol/L（0.94 g/L）2-PE。Kang 等［49］優(yōu)化了莽草酸途徑中 4 種關(guān)鍵酶aroFfbr、pheAfbr、kdc和adh1的協(xié)同表達，重組大腸桿菌可以利用葡萄糖合成285 mg/L 2-PE。

生物轉(zhuǎn)化在2-PE 生產(chǎn)中顯示出廣闊的前景。然而，和其他醇類物質(zhì)一樣，高濃度的2-PE 對微生物細胞有一定的毒性，當發(fā)酵液中的2-PE 濃度達到一定程度時，就會抑制微生物的生長，而且2-PE 和乙醇聯(lián)合作用產(chǎn)生的毒性比它們各自產(chǎn)生的毒性作用累加要高。2-PE 的抑菌作用機理很復雜，但通常認為主要是由其物化特性引起，而不是對特定受體的抑制。抑制作用的主要部位可能是原生質(zhì)膜，影響糖類和氨基酸運輸系統(tǒng)，此外，由于膜的通透性增加，加速了離子和小分子代謝產(chǎn)物跨膜向胞外擴散，擾亂了跨膜質(zhì)子電勢。因此，該特性導致的生產(chǎn)力受限仍然是一個顯著的瓶頸，這促使研究人員去尋求性能更優(yōu)的菌株［50］。商業(yè)上用于從葡萄糖生產(chǎn)甘油的菌株Candida glycerinogenesWL2002-5 表現(xiàn)出 4 g/L 的高 2-PE 耐受性。利用該菌株通過分批發(fā)酵可以產(chǎn)生5 g/L 2-PE，是目前使用野生型菌株合成2-PE 的最高產(chǎn)量［51］。另外，2-PE 的生產(chǎn)已經(jīng)實現(xiàn)了與隨機突變相結(jié)合的巨大進展。例如，經(jīng)過紫外線輻射處理后，S. cerevisiaeCWY13210 的突變菌株與原始菌株相比，2-PE 耐受性和產(chǎn)量分別提高了50%和9.1%［52］。同樣，通過紫外線照射獲得的S.cerevisiaeBD-25-39 突變體可以合成5.4 g/L 2-PE，比原始菌株提高10.2%［53］。值得注意的是，由于2-PE 具有親脂性，仍然難以完全消除其所引起的毒性。因此，仍然需要更有效的誘變和篩選方法。此外，引入一些耐受性因子，例如與膜相關(guān)的熱休克蛋白HSP12，可以保護脂質(zhì)體膜的完整性，避免其受到不利環(huán)境的影響［54］。

3.2 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

在工業(yè)發(fā)酵過程中，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分對于代謝產(chǎn)物的效價和產(chǎn)率至關(guān)重要。如上所述，氮源的利用遵循特定的順序［55］。因此，L-Phe總是作為唯一氮源來激活艾氏途徑。但是，少量的有機氮源，如酵母提取物則有利于細胞生長而不抑制艾氏途徑［53，56］。有趣的是，Barbosa 等［57］發(fā)現(xiàn)，通過添加少量無機氮源，如磷酸二銨（DAP），可顯著減少乙醇和乙酸的形成，并增加2-PE的產(chǎn)量。這可能是由于氮源的加入促進了NADH 的再生，但其機制仍有待進一步闡明。碳源的主要功能是維持菌株生長并提供必要的輔因子，如2-酮酸和NADH［58］。一般情況下，隨著碳源的增加，2-PE的產(chǎn)量也會增加，但這種提高是有限的［58］。此外，不同的碳源可以改變L-Phe的消耗百分比、2-PE和2-苯乙基衍生物的摩爾產(chǎn)率［59］。通過與果糖、蔗糖、麥芽糖和糖蜜進行比較，發(fā)現(xiàn)葡萄糖是S.cerevisiaeCWY132 合成 2-PE 的最適碳源［56］。但是為了降低成本，廉價的碳源（如粗甘油和其他工業(yè)廢料）則具有更好的價值。此外，維生素和礦物質(zhì)對生產(chǎn)2-PE 也有很大影響。例如，與初始條件相比，K.marxianusCBS 600 在發(fā)酵條件優(yōu)化后需要的維生素劑量是初始條件的80 倍，這表明在生物轉(zhuǎn)化條件下優(yōu)化后的代謝壓力更大［11］。在惡劣條件下，Ca2+和Mg2+都可以通過增加膜穩(wěn)定性來保護細胞［60］。當 MgSO4添加量增加到 0.4 g/L 時，2-PE 產(chǎn)量提高了1.65 倍。當KH2PO4增加到6 g/L時，2-PE的產(chǎn)量也出現(xiàn)了類似的增加［56，61］。

3.3 發(fā)酵過程參數(shù)優(yōu)化

一般來說，香料的合成過程對培養(yǎng)溫度非常敏感。高溫可以增強一些與酒精產(chǎn)生有關(guān)的酶的表達，如BAT1/2［62］。然而，超過最佳溫度范圍，醇類的生成量將顯著降低。以釀酒酵母為例，當培養(yǎng)溫度從30 ℃增加到40 ℃時，2-PE產(chǎn)量下降到1/3～1/23［16］。在 20～35 ℃的培養(yǎng)溫度下，L-Phe的消耗量在80.5%～90.1%之間變化；當溫度升高到40 ℃時，L-Phe的消耗量顯著降低21.9%［14］。除了溫度之外，pH 也會通過影響酶活性從而影響芳香物質(zhì)的產(chǎn)量和成分［63］。艾氏途徑中的關(guān)鍵酶如ARO8 和ARO9 是堿性上調(diào)的，而ARO10 則是相反的堿性下調(diào)［64］；因此，需要采用折中的pH 來平衡整個艾氏途徑。此外，pH 也會改變基質(zhì)的離子狀態(tài)，影響吸附劑對2-PE 的吸附容量［65］。在以氨基酸為唯一氮源且葡萄糖受限的有氧條件下，氨基酸主要轉(zhuǎn)化為雜酸［66］。然而，在厭氧條件下，氨基酸幾乎完全轉(zhuǎn)化為雜醇［67］。雜酸（和雜醇）的分布與培養(yǎng)條件密切相關(guān)?；诖?，Tian 等［68］在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入了一些抗壞血酸以提高系統(tǒng)的還原水平，抑制副產(chǎn)物的產(chǎn)生。在這一改良系統(tǒng)中生產(chǎn)的2-PE 與標準2-PE 樣品表現(xiàn)出最接近的香氣相似性［68］。

除培養(yǎng)條件外，發(fā)酵方式對2-PE 產(chǎn)量也有影響。據(jù)文獻記載，2-PE 的合成過程與細胞生長密切相關(guān)［69］，當葡萄糖濃度超過一定水平時，在有氧條件下會產(chǎn)生大量乙醇。乙醇的積累對2-PE 的產(chǎn)生有很大的協(xié)同抑制作用［50］。為了防止發(fā)酵過程中產(chǎn)生比1 g/L高的乙醇，Rong等［70］利用活性干酵母生產(chǎn)2-PE。在該體系中，酵母降解乙醇以提供還原力NADH，最終可以利用8 g/L 的L-Phe 合成7.6 g/L的2-PE。

3.4 統(tǒng)計實驗設計

鑒于培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件對2-PE 生產(chǎn)的影響，需要進行更合理的優(yōu)化研究。近年來，統(tǒng)計實驗設計如單因素優(yōu)化、遺傳算法、Box-Behnken中心組合設計、響應面法等已被廣泛使用（表1）。Etschmann 等［11］利用遺傳算法優(yōu)化了 13 種培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)溫度，最終，利用K. marxianusCBS 600 將 2-PE 的產(chǎn)量提高了 87%。Mei 等［61］采用單因素、正交設計、Box-Behnken 中心組合設計和響應面法對培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，利用S. cerevisiaeBD將2-PE的產(chǎn)量由1.19 g/L提高到4.18 g/L。統(tǒng)計方法的采用不僅減少了工作量，而且評估了多個參數(shù)之間的相互作用，特別是在利用復雜的農(nóng)產(chǎn)工業(yè)廢物方面。例如，當Plackett-Burman 設計、steepest ascent設計和Box-Behnken設計結(jié)合起來優(yōu)化可發(fā)酵培養(yǎng)物的培養(yǎng)基成分、酸堿度和發(fā)酵時間時，2-PE產(chǎn)量提高了3.3倍［71］。

表1 基于統(tǒng)計設計的2-PE發(fā)酵工藝優(yōu)化Tab.1 Statistics-based optimized fermentation processes for 2-PE production

4 利用農(nóng)業(yè)和工業(yè)廢料生物合成2-苯乙醇

農(nóng)業(yè)和工業(yè)廢物被認為是復雜碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類和各種營養(yǎng)物質(zhì)的儲存庫［72］。將這些廢物生物轉(zhuǎn)化為增值產(chǎn)品，如2-PE，不僅可以防止廢物處置造成的環(huán)境污染，還可以增加經(jīng)濟價值。例如，葡萄含有復雜的成分，包括糖、有機酸、酚類化合物、蛋白質(zhì)、維生素等，當使用它作為碳源并供應5 g/L L-Phe 時，利用K.marxianusCBS 6556 可以合成 0.77 g/L 2-PE［73］。糖蜜是一種眾所周知的工業(yè)廢料，富含混合糖和微量元素。當使用甜菜糖蜜作為碳源并添加7 g/L L-Phe時，利用K. marxianusCBS 600 可以合成0.89 g/L 2-PE［74］。在使用K.marxianusATCC 10022 進行固態(tài)發(fā)酵時，以L-Phe 及干燥的固體甘蔗渣為原料可合成2-PE 10.2 mg/g［75］。當在甘蔗糖蜜廢水中添加6 g/L L-Phe 時，使用微生物混合培養(yǎng)物可獲得0.99 g/L 2-PE［63］。另外，季也蒙畢赤酵母、發(fā)酵單胞菌和釀酒酵母等都可以利用乳清培養(yǎng)基通過分批發(fā)酵的方式合成1.17~3.28 g/L 2-PE［76］。煙草廢料是一種眾所周知的可再生資源，因為它含有豐富的芳香族化合物，是合成香料的潛在前體。在不添加任何L-Phe 的情況下使用釀酒酵母可以從39.28 g/L 煙草廢料和10 g/L 葡萄糖中產(chǎn)生1.55 g/L 2-PE［71］。此外，木薯廢水、番茄、辣椒渣等也都含有豐富的碳水化合物和營養(yǎng)物質(zhì)，為2-PE 的生產(chǎn)提供了可替代的底物［77-79］。然而，應該指出的是，由于這些農(nóng)用工業(yè)廢物中成分復雜且未知，2-PE的產(chǎn)量仍然很低且不穩(wěn)定。

5 2-苯乙醇原位產(chǎn)物分離技術(shù)

香料生產(chǎn)的瓶頸之一是由于其疏水特性會使得脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)成為優(yōu)先結(jié)合的目標，導致跨膜梯度的崩潰，從而喪失細胞活力［80］。不同的微生物對于香料的細胞毒性表現(xiàn)出不同的耐受水平。例如，2.0 g/L 外源2-PE 可以完全抑制馬克思克魯維酵母的生長［81］；而釀酒酵母則可以耐受高達4 g/L 的 2-PE［17］。為了減輕細胞毒性增加 2-PE 的產(chǎn)量，有機溶劑萃取、疏水吸附、有機滲透汽化、環(huán)糊精（CDs）絡合和超臨界CO2萃取等ISPR 技術(shù)已被廣泛用于去除發(fā)酵液中的2-PE。表2 列舉了已發(fā)表文獻中關(guān)于原位產(chǎn)物分離（ISPR）技術(shù)在2-PE 生產(chǎn)中的應用。

表2 用于2-PE生產(chǎn)的不同的原位產(chǎn)物分離（ISPR）技術(shù)Tab.2 Different in situ product removal(ISPR)techniques for 2-PE production

5.1 液-液萃取

液-液萃取法（LLE）采用有機溶劑從有機相中連續(xù)提取疏水產(chǎn)物，因其簡單、廉價、易擴展等特點而被廣泛應用于香精生產(chǎn)。例如，當使用油酸作為萃取劑時，使用釀酒酵母可以獲得12.6 g/L 2-PE，與沒有使用提取技術(shù)相比，2-PE 的含量增加了8.6 g/L［69］。用油醇作為萃取劑，使K.marxianusCBS 600 的 2-PE 產(chǎn)量提高了 3 倍［74］。此外，聚丙二醇 1500 和 1200 （PPG 1500 和 PPG 1200）等高分子萃取劑在2-PE 分離中同樣表現(xiàn)出良好的萃取性能。在以PPG 1500 為萃取劑的補料分批發(fā)酵中，萃取劑中的2-PE 濃度超過22 g/L，總濃度達到 7.5 g/L［82］。當以 PPG 1200 為萃取劑時，有機相中2-PE 含量為26.5 g/L，2-PE Ac 含量為6.1 g/L，2-PE總質(zhì)量濃度達到10.5 g/L。

在液-液萃取中，發(fā)酵液被泵入抽提裝置以連續(xù)回收2-PE［圖3（a）］。2-PE生產(chǎn)可以得到顯著改善，但仍存在一些缺陷。首先，有機溶劑會對細胞活力和代謝活性造成嚴重的毒性。因此，理想的萃取劑應具有良好的生物相容性和較高的分配系數(shù)。其次，乳狀液的形成將影響液體和溶劑相的分離［83］。最后，也是最重要的一點，液-液分離系統(tǒng)中使用的有機溶劑，特別是高碳含量的有機溶劑，很難蒸發(fā)從而去除2-PE，殘留的溶劑會嚴重影響2-PE 的質(zhì)量［81］。因此，尋找合適的有機溶劑是液-液分離操作的關(guān)鍵?？紤]到2-PE 的脂溶性，使用一些脂肪酸/油脂作為萃取劑可作為一種2-PE 回收的方法。菜籽油首先被證實可以將2-PE 的整體濃度提高2.7 倍［84］。此外，疏水中空纖維膜可以被用來阻擋催化介質(zhì)中的有機溶劑，從而避免乳狀液的形成［85］。但需要注意的是，該膜易受污染。

近年來，不相容離子液體（ILS）因其可忽略的蒸氣壓、不可燃性和高熱穩(wěn)定性而成為綠色非有機溶劑受到越來越多的關(guān)注［86］。通過對9 種離子液體的生物相容性、分配系數(shù)（Kd）和萃取效率的綜合考察，發(fā)現(xiàn)3 種基于［NTf2］-的離子液體具有很大的提高2-PE 產(chǎn)量的潛力。使用基于［NTf2］-的 ILS［87］，觀察到 2-PE 的總產(chǎn)量增加了3.5倍。此外，［NTf2］-、［TCM］-和［TCB］-基離子液體可以有效地從水相中回收2-PE［88-89］。

5.2 液-固萃取

為了進一步提高萃取效率，研究了一種液-固萃取系統(tǒng)（LSE）。在這個系統(tǒng)中，有機溶劑被包裹到聚合物基質(zhì)中，這不僅解決了微生物毒性和乳狀液的問題，而且還簡化了下游的加工過程［圖3（b）］。將癸二酸二丁酯包埋在聚乙烯的聚合物基質(zhì)中后，不僅沒有形成乳狀液，2-PE的產(chǎn)率還提高了1倍［83］。通過將癸二酸二丁酯嵌入到海藻酸鹽微膠囊中，設計了一條將LSE體系與膜工藝相結(jié)合的新工藝。在該體系中，不會形成乳狀液，使用S. cerevisiaeGIV2009，最終2-PE濃度提高到5.6 g/L，比使用單相時提高了1.8 g/L［90］。雖然LSE 的性能優(yōu)于LLE，但溶劑固定化會增加成本，使生產(chǎn)過程復雜化。

5.3 疏水吸附

原位產(chǎn)物吸附（ISPA）是一種常見的ISPR 技術(shù)，它使用樹脂或其他吸附介質(zhì)來避免底物或產(chǎn)物的抑制［圖3（c）］。ISPA 因其操作相對簡單、易放大、對有毒物質(zhì)不敏感、易于再生和成本低而被廣泛應用于生物技術(shù)過程［91］。為了回收2-PE，人們研究了各種樹脂。非極性大孔樹脂D101 對2-PE 的吸附能力較強，對L-Phe 的吸附能力較低。在添加2 g/L 水合樹脂D101 的條件下，S.cerevisiaeBD可獲得6.17 g/L 2-PE產(chǎn)量［65］。當使用7%（干重）的交聯(lián)聚苯乙烯樹脂HZ818 時，用S.cerevisiaeP-3 從 12 g/L L-Phe 中得到 6.6 g/L 2-PE，摩爾產(chǎn)率為0.744，比對照［92］提高了66.2%。當大孔樹脂F(xiàn)D 0816 作為連續(xù)生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的吸附劑時，摩爾產(chǎn)率最高，為0.90［93］。然而，樹脂對2-PE 的吸附容量很低，而且吸附過程受發(fā)酵液的影響很大［94］。該文對幾種聚合物吸附劑進行了測試，以確定具有較高選擇性的吸附劑。例如：將Hytrel?8206應用于固-液兩相分離生物反應器系統(tǒng)，在3 L 的發(fā)酵體積內(nèi)可獲得13.7 g/L 2-PE。當采用半連續(xù)反應器結(jié)構(gòu)時，2-PE的最高濃度為20.4 g/L，水相為1.4 g/L，聚合物相為97 g/L［81］。

圖3 應用于2-PE生產(chǎn)中的ISPR技術(shù)Fig.3 ISPR techniques for 2-PE production

5.4 其他分離技術(shù)

5.4.1 有機滲透汽化

滲透汽化是一種膜分離過程，在膜分離過程中，一層致密的無孔膜將液體溶液從氣相中分離出來。在裝有聚辛基甲基硅氧烷（POMS）膜的有機滲透汽化裝置中，分批培養(yǎng)獲得了2.2 g/L 和1.3 g/L 的雙倍 2-PE 濃度［60］。然而，這些膜很容易被污染，仍然需要探索更合適的膜材料［95］。

5.4.2 與環(huán)糊精（CDs）絡合

CDs是具有疏水內(nèi)部和親水外部的超分子主體化合物。眾所周知，CDs及其衍生物與許多有機化合物形成包合物。在最佳條件下，β-CD 對2-PE 的萃取率為 1 mol/mol［96］。

5.4.3 超臨界CO2萃取

超臨界流體（SCFs）具有高吸附能力、高擴散系數(shù)和低黏度等特點，被廣泛應用于從土壤、水和沉淀物中提取有機污染物［97］。無毒和不可燃的二氧化碳（CO2）是目前工業(yè)中使用的最流行和最便宜的超臨界流體材料［98］。特別是超臨界CO2在玫瑰混凝土揮發(fā)油的提取過程中表現(xiàn)出優(yōu)異的性能［99］。然而，直接利用超臨界CO2萃取是不可能的，因為CO2對細胞活力有很大的影響。因此，在提取［93］之前進行細胞分離是必要的。

6 小結(jié)與展望

由于植物提取的局限性和化學合成工藝的缺陷，生物合成2-PE 受到越來越多的關(guān)注。雖然在機理認識和提高2-PE 效價方面取得了很大突破［105］，但在經(jīng)濟上仍不具備工業(yè)化的可行性。為了將實驗室研究成果轉(zhuǎn)化為工業(yè)過程，底盤菌種開發(fā)、生物過程優(yōu)化和ISPR 技術(shù)設計之間的深度集成綜合開發(fā)是必要的。

在自然界中，許多真菌可以自主合成2-PE，但產(chǎn)量仍然很低。代謝工程對于改善2-PE 的生產(chǎn)至關(guān)重要，它可以減輕反饋抑制，增強前體轉(zhuǎn)運，提高關(guān)鍵酶活性，并干擾副產(chǎn)物的形成。通過對2-PE 合成途徑的改造或引入耐受因子，選擇耐受性好、產(chǎn)2-PE 能力強的菌株可能是獲得較好的2-PE 生產(chǎn)候選菌株的唯一途徑。此外，目前對2-PE 合成的調(diào)控機制還沒有進行深入的研究。更好地理解艾氏途徑/莽草酸途徑涉及的生物化學，特別是酶及其代謝調(diào)節(jié)，是指導進一步遺傳修飾的基礎。

培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件對2-PE 的生產(chǎn)有很大影響。從經(jīng)濟的角度來看，高增值產(chǎn)品的生產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量遠比實際產(chǎn)量重要。然而，培養(yǎng)基成分的改變無疑會增加生物催化法合成2-PE 的生產(chǎn)成本，不利于該技術(shù)的工業(yè)化應用。因此，進一步研究利用農(nóng)業(yè)或工業(yè)副產(chǎn)品為主要原料，如制糖工業(yè)的副產(chǎn)品糖蜜，可以節(jié)約生產(chǎn)成本，有利于該工藝的工業(yè)化應用。目前報道的不利用原位產(chǎn)物分離技術(shù)的2-PE 最高生產(chǎn)率只有0.12 g/（L·h）［53］，為了更好地實現(xiàn)2-PE 商業(yè)化生產(chǎn)，更多的研究應該集中在2-PE的生產(chǎn)率上。

ISPR 技術(shù)已廣泛應用于2-PE 生產(chǎn)中，尤其是LLE 和ISPA。然而，LLE 系統(tǒng)中殘留有機溶劑的去除困難限制了其應用。與LLE 相比，ISPA 具有更大的工業(yè)放大潛力。在實際生產(chǎn)中，ISPR 技術(shù)必定會增加生產(chǎn)過程的復雜性和成本，因此，仍需進一步研究開發(fā)更多的高容量吸附材料運用于完整細胞的原位產(chǎn)物分離技術(shù)，如合成聚合物。隨著生物技術(shù)和跨學科的快速發(fā)展，采用更先進的發(fā)酵方式，如將不同的生物材料應用到微生物發(fā)酵過程中，設計使用可以同時合成并分離2-PE的新型反應器等，同時結(jié)合ISPR 技術(shù)，使用優(yōu)質(zhì)菌株，將進一步提高2-PE 的生產(chǎn)效率。此外，對“天然”香料日益增長的需求將使得利用生物法合成2-PE的商業(yè)前景更加廣闊。