生姜生物活性成分的合成分析與抗運動病應用研究

蔡明亮，劉 琦，徐麗華，周 鑫，姜正林

（南通大學 特種醫(yī)學研究院， 江蘇 南通 226019）

1 問題提出

運動病多發(fā)生在乘車、乘船與航天等特殊環(huán)境下，主要癥狀有流涎、胃部不適、嗜睡、面色蒼白、出冷汗、眩暈、惡心、甚至嘔吐等[1]。目前，抗運動病藥物主要有抗組胺藥，代表藥物為茶苯海明；抗膽堿藥，代表藥物為東莨菪堿；擬交感神經藥，代表藥物有哌唑甲酯[2]。除了以上化學藥物外，還有些中藥材如丹參、天麻、生姜等均能防止運動病的發(fā)生，對運動病癥狀有一定的緩解作用。

生姜被認為是較理想的天然抗運動病藥物之一，幾乎沒有副作用，因此被人們廣泛研究[3-4]。目前，生姜已被開發(fā)出很多復方制劑，其抗運動病效果受到肯定，但是生姜的具體抗運動病成分及機制還不十分清楚。生姜中發(fā)現(xiàn)的成分有100 多種，其中姜酚是主要的生物活性成分。根據支鏈上所連的碳鏈長短不同，姜酚又可分為6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、12-姜酚等，其中以6-姜酚的含量最高，生物活性最強[5]。因此，6-姜酚被認為是最有效的生姜活性成分。

現(xiàn)有技術不僅可進行生姜活性成分的提純，也可通過化學合成的方法得到所需的各種有效成分。本研究通過逆向推理，以香蘭素和丙酮為原料[6]，通過羥醛縮合等化學反應得到6-姜酚、6-姜烯酚、6-姜烯酮，其結構式見圖1。對合成的三種代表性生姜生物活性成分進行分析鑒定，并以旋轉刺激誘導大鼠產生對0.15 %糖精水的條件性厭飲行為作為運動病模型，觀察其抗運動病作用，明確生姜生物活性成分的抗運動病效果，為進一步開發(fā)使用該藥提供依據。

圖1 6-姜酚、6-姜烯酚、6-姜烯酮的結構式

2 實驗材料與方法

2.1 實驗材料

甲醇（分析純），氫氧化鈉（分析純），乙醇（分析純），乙酸乙酯（分析純），石油醚（分析純），四氫呋喃（分析純），二異丙胺（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），香蘭素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），丙酮（分析純），鹽酸（分析純），鈀—碳（Sigma-Aldrich 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司），6-姜酚（Sigma-Aldrich 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司），6-姜烯酚（北京百靈威科技有限公司）。

2.2 實驗設備

電熱恒溫水浴鍋（上海華聯(lián)環(huán)境試驗設備公司恒昌儀器廠，HH-S21-6S），旋轉刺激裝置（南通大學自主研制），各種量程移液器（2.5 μL，10 μL，100 μL，200 μL，德國艾本德股份公司），恒溫磁力攪拌器（上海滬西分析儀器廠有限公司，90-3），高效液色譜相儀（日本島津公司，LC-20AD）。

2.3 實驗方法

2.3.1 6-姜酚系列化合物的合成

6-姜酚系列化合物的合成路線如圖2 所示。

圖2 6-姜酚系列化合物的合成反應式

以香蘭素為原料[6-7]，氫氧化鈉為催化劑，在丙酮作為溶劑的條件下得到脫氫姜酮，以Pd/C 為催化劑，通過氫氣還原制備得到姜酮中間體。將姜酮與正己醛在無水四氫呋喃的溶劑中，以LDA 為催化劑，-78 ℃低溫反應（丙酮+干冰），即可制備目標化合物6-姜酚。以6-姜酚為原料，稀鹽酸（2 mol/L）為催化劑，在四氫呋喃的回流條件下即可制備6-姜烯酚。以6-姜烯酚為原料，在Pd/C為催化劑的氫氣還原條件下，即可制備另一目標化合物6-姜烯酮。

2.3.2 催化劑二異丙基氨基鋰（LDA）的制備

二異丙基氨基鋰（LDA）作為催化劑具有一定危險性，不可長期保存，因此，應現(xiàn)用現(xiàn)制備，反應式如圖3。

圖3 二異丙基氨基鋰的制備反應式

將二異丙胺10.5 mL 溶于50 mL 無水四氫呋喃溶劑，并加入裝有滴液漏斗的250 mL 三口瓶，氮氣保護，密封瓶口。然后在-78 ℃下攪拌，緩慢滴加用40 mL 無水四氫呋喃稀釋的正丁基鋰30 mL（2.5 mol/L），持續(xù)30 min。逐漸回復溫度至0 ℃，攪拌 10 min，將溫度再次恢復至-78 ℃[7]，得到二異丙基氨基鋰。

2.3.3 藥物純度檢測

通過實驗，合成得到6-姜酚、6-姜烯酚、6-姜烯酮三種化合物，用高效液相色譜法（HPLC）測定其純度。三種化合物均為脂溶性藥物，選擇甲醇為溶劑，高效液相的流動相為甲醇和水。高效液相法的檢測條件為：室溫27 ℃，流動相為甲醇和水的混合液（V甲醇∶V水=13 ∶7），流速 1.0 mL/min，檢測波長280 nm，進樣量20 μL。

2.3.4 大鼠運動病模型

實驗時將大鼠放入旋轉裝置的有機玻璃籠內，繞水平軸順時針旋轉，以16 °/s2角加速度加速，達到最大速度 120 °/s2后，立即以-48 °/s2的角加速度減速，至旋轉停止為一個旋轉周期，歷時10 s，再反方向重復刺激，持續(xù)旋轉刺激2 h。

2.3.5 運動病敏感性分組

采用旋轉刺激誘導大鼠產生條件性味覺厭惡（conditional taste aversion，CTA）的方法制作大鼠運動病模型后，進行大鼠運動病敏感性分組。給大鼠編號，適應性飼養(yǎng)2 天后，給予0.15 % 糖精水適應24 h。首日上午始禁水24 h，次日上午給予0.15 % 糖精水，大鼠自由飲用45 min，測量各大鼠飲用量。隨后自由飲水一天。第三天對大鼠進行旋轉刺激2 h 后禁水24 h。第四天讓其自由飲用0.15 % 糖精水45 min，再次測量各大鼠飲用量。環(huán)境溫度保持在25 ℃。計算旋轉刺激后各大鼠糖精水飲用量減少程度，減少15 %以上的為敏感組，減少15 %以下為不敏感組。一周后重復上述實驗，兩次結果一致的大鼠進行后續(xù)實驗。

2.3.6 生姜抗運動病有效成分篩選

選取敏感SD 大鼠，利用拉丁方設計，對藥物進行篩選（見表 1）。其中：A 為空白，B 為花生油，C 為 25 mg/kg 6-姜酚，D 為 50 mg/kg 6-姜酚，E 為 50 mg/kg 6-姜烯酚，F(xiàn) 為 100 mg/kg 6-姜烯酚，G 為 50 mg/kg 6-姜烯酮，H 為 150 mg/kg 6-姜烯酮，I 為 60 mg/kg 茶苯海明。由于 6-姜酚、6-姜烯酚和6-姜烯酮均為脂溶性藥物，故選擇花生油作為三種藥物的溶劑。茶苯海明為顆粒固體藥物，用生理鹽水溶解。

對篩選出的敏感大鼠進行編號，適應性飼養(yǎng)2 天后，給予0.15 %糖精水適應24 h。首日上午禁水24 h，次日上午給予0.15 % 糖精水，自由飲用45 min，測量各大鼠飲用量。隨后自由飲水一天。第三天，在對大鼠進行旋轉刺激前半小時，按表1的順序對大鼠進行灌胃給藥，然后旋轉刺激2 h后禁水24 h。第四天讓其自由飲用0.15 %糖精水45 min，再次測量各大鼠飲用量。每周一次，共進行9 次實驗。

表1 拉丁方設計藥物篩選表

3 實驗結果

3.1 化學合成藥物結構確定

使用核磁氫譜、高效液相色譜方法對三種化合物進行結構表征。

5-羥基-1-（4-羥基-3-甲氧基苯基）癸-3-酮（6-姜酚）：1HNMRδ 0.88（3H，s），1.21-1.53（8H，m），2.52（2H，m），2.73（2H，m），2.83（2H，m），2.99（1H，s），3.88（3H，s），4.03（1H，m），5.56（1H，s），6.66（2H，m），6.84（1H，d，J=8.0 Hz）；根據電子轟擊源質譜（EI-MS）結果，計算得到6-姜酚的分子量為 294.182 5（圖 4（a））。對照品和合成化合物在薄層色譜上顯示一個斑點，Rf=0.68。產品與標準品的高效液相檢測后保留時間一致，在13 min 左右，如圖 4（b）、（c）所示。

圖4 合成品6-姜酚結構分析

1-（4-羥基-3-甲氧基苯基）癸-4-烯-3-酮（6-姜烯酚）：1H NMRδ 0.89（3H，t，J = 6.6 Hz），1.30（4H，m），1.45（2H，m），2.19（2H，q，J=7.2 Hz），2.85（4H，m），3.87（3H，s），5.53（1H，s），6.10（1H，d，J = 16.0 Hz），6.68（2H，m），6.82（2H，m）；根據電子轟擊源質譜（EI-MS）結果，計算得6-姜烯酚的分子量為 276.371 5（圖 5（a））。標準品與合成化合物在薄層色譜上顯示一個斑點，Rf=0.55。高效液相檢測后保留時間一致，在30 min 左右，見圖5（b）、（c）。

圖5 合成品6-姜烯酚結構分析

1-（4-羥基-3-甲氧基苯基）-3-癸酮（6-姜烯酮）：1H NMRδ 0.89（3H，t），1.26-1.30（8H，m），1.56（2H，J=7.2 Hz），2.39（2H，J=7.4 Hz），2.71（2H，J=7.4 Hz），2.84（2H，J=7.4 Hz），3.88（3H，s），5.62（1H，s）6.67-6.71（2H，m），6.84（1H，m）。根據電子轟擊源質譜（EI-MS）結果，計算得到6-姜烯酮的分子量為 278.2015 ，如圖 6（a）所示。

圖6 合成品6-姜烯酮結構分析

3.2 化合物純度測定

利用高效液相色譜法對化合物進行純度分析，根據高效液相圖譜分析得到峰面積的比例。圖 4（b）和（c）顯示，6-姜酚合成化合物和標準品都是在13 min 左右出峰，合成的6-姜酚占對照品的峰面積比例為98.4 %，因此藥物的純度與對照品接近。圖 5（b）和（c）顯示，HPLC 出峰時間有微小偏差，但在允許范圍內。合成的6-姜酚和6-姜烯酮有肩峰，表明所合成的6-姜酚和6-姜烯酮純度較 6-姜酚低（圖 5（c）和圖 6（b））。如圖 6（b）顯示，在8 min 和10 min 左右出現(xiàn)了顯著雜峰，這也影響6-姜烯酮的純度。

3.3 生姜有效成分的抗運動病效果

采用拉丁方設計，循環(huán)9 個周期，每個周期為7 天，對藥物的抗運動病效果進行評價。結果顯示，對照組1 和對照組2 兩組大鼠糖精水飲用量減少程度無統(tǒng)計學差異（P ＞0.05）。陽性對照藥茶苯海明抑制大鼠的糖精水厭飲行為（P ＜0.05），6-姜烯酮兩個劑量50 mg/kg 和150 mg/kg 組與對照組相比均無統(tǒng)計學差異（P ＞0.05）。6-姜酚和6-姜烯酚均抑制大鼠糖精水厭飲行為（P ＜0.05 或0.01），其中6-姜酚50 mg/kg 作用優(yōu)于25 mg/kg劑量，6-姜烯酚100 mg/kg 作用優(yōu)于50 mg/kg 劑量，但與陽性藥對照組相比無統(tǒng)計學差異（P ＞0.05，見圖 7）。上述結果表明，6-姜酚 50 mg/kg 劑量時，抑制大鼠的糖精水厭飲行為效果最佳。

圖7 生姜有效成分合成品的抗運動病效果（n=9）

4 討 論

本研究首先通過縮合、還原等化學合成方法，以香蘭素和丙酮為原料合成得到6-姜酚、6-姜烯酚、6-姜烯酮。以質譜和核磁共振法對三種化合物結構進行表征，高效液相色譜分析其純度。結果顯示，各化學合成物核磁表征與標準品吻合且有效成分的純度均較高。表明本實驗采用的以香蘭素和丙酮為原料合成6-姜酚、6-姜烯酚、6-姜烯酮的方法良好。

后續(xù)以旋轉刺激誘導條件性厭飲作為大鼠運動病模型，以旋轉刺激后0.15 %糖精水飲用量的減少程度衡量運動病的發(fā)作程度，并評價藥物的作用。結果顯示，與茶苯海明比較，6-姜烯酮的抗運動病效果不明顯，而6-姜酚、6-姜烯酚具有較好的抗運動病效果，能明顯抑制大鼠旋轉刺激后糖精水飲用量的減少，特別是6-姜酚50 mg/kg 劑量的作用最強。6-姜酚與6-姜烯酚兩種化合物的化學結構式非常相似（圖1），從合成化學角度看，6-姜烯酚可以由6-姜酚一步合成而來，在支鏈上，原本的6-姜酚上-OH 脫水形成一個C=C 雙鍵，即變成6-姜烯酚，而其母環(huán)和主要官能團未發(fā)生改變，因此這兩種化合物應屬于一種類型的藥物，兩者的作用機制應是一致的。

依據構效關系來比較6-姜酚和6-姜烯酚，可以看出6-姜酚含有-OH，親水性增強，使藥物更容易進入體液，6-姜烯酚因其含有C=C 雙鍵，親脂能力更強，藥物更容易通過血腦屏障發(fā)揮中樞作用。但是，任何一種藥物透過血腦屏障進入中樞發(fā)揮藥效，除要具有一定的親脂能力外，一定的親水能力也十分必要，兩者達到恰當?shù)闹峙洳拍馨l(fā)揮最大的藥效[8]。6-姜烯酮（圖1）的支鏈為一些飽和烷烴鏈，其親脂能力比6-姜烯酚更強，相對親水能力減弱，其脂水分配更加不均，導致藥效無法發(fā)揮。

5 結 論

本實驗通過合成得到生姜抗運動病有效成分6-姜酚、6-姜烯酚、6-姜烯酮，且對目標產物進行了高效液相色譜純度檢測、核磁共振氫譜表征及藥效學評估。結果表明，三種化合物核磁氫譜數(shù)據及液相色譜數(shù)據與對照品吻合，且各有效成分的純度較高。合成的三種化合物中，6-姜酚和6-姜烯酚與陽性對照藥茶苯海明一樣能抑制大鼠的糖精水厭飲行為，且50 mg/kg 劑量的6-姜酚效果最好。