脂肪干細胞條件培養(yǎng)基及微針治療脫發(fā)的研究進展

鮑 慧 張志丹 肖麗玲

（1.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科，廣東 廣州 510630）

脫發(fā)是由多種毛發(fā)生長障礙引起的疾病，對患者心理有很大影響，超過50%的人有脫發(fā)困擾[1]。其中，雄激素性脫發(fā)（androgenic alopecia，AGA）和斑禿是最常見的兩種脫發(fā)類型。關(guān)于脫發(fā)的藥物治療，目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的AGA治療方法包括口服非那雄胺和局部應(yīng)用米諾地爾[2-3]。然而，藥物治療只是延緩脫發(fā)，并且有出現(xiàn)不良反應(yīng)的可能[3]。常用于斑禿的治療方法為全身或局部應(yīng)用激素或免疫抑制劑，治療后患者常出現(xiàn)免疫抑制相關(guān)的不良反應(yīng)[4]。利用干細胞進行生物工程再生毛囊的研究為脫發(fā)的治療提供了新的途徑。例如，脂肪干細胞條件培養(yǎng)基（adipose derived stem cell-conditioned medium，ADSC-CM）沒有細胞成分，無免疫原性，不需要進行供體-受體匹配，這使其成為一個更優(yōu)的選擇。微針治療作為一種微創(chuàng)的皮膚病學(xué)手術(shù)，在脫發(fā)治療中的應(yīng)用也逐漸增多，且微針治療已經(jīng)成功地與其他促進毛發(fā)生長的療法例如米諾地爾、富血小板血漿和局部類固醇治療等相結(jié)合，能夠有效地刺激毛囊生長。本文對ADSC-CM及微針治療脫發(fā)的現(xiàn)狀綜述如下。

1 脫發(fā)常見的病因及治療

不同病因?qū)е碌拿摪l(fā)類型不同，分類方式也較多，常見的脫發(fā)類型包括：AGA、斑禿、女性型脫發(fā)、休止期脫發(fā)（TE）和惡性腫瘤引起的脫發(fā)及老年性脫發(fā)等[5]。脫發(fā)涉及兩種類型的毛發(fā)干細胞的變化，包括人類毛囊干細胞（HFSCs）和真皮乳頭細胞（DPCs）[6-7]，它們是頭發(fā)正常再生的條件。

AGA是男性最常見的脫發(fā)形式，影響了近50%的男性人口[8]。AGA是由遺傳和激素因素引起的常見脫發(fā)疾病，其特征是雄激素相關(guān)性的頭發(fā)逐漸稀疏[9]。目前常應(yīng)用于治療AGA的藥物包括非那雄胺及米諾地爾。應(yīng)用非那雄胺及米諾地爾的效果是暫時的，需要持續(xù)應(yīng)用才能保持療效[10]。局部使用米諾地爾有多種不良反應(yīng)發(fā)生，如接觸性皮炎、瘙癢、干燥和面部多毛癥[11-12]。非那雄胺是II型5α-還原酶的選擇性抑制劑，通過阻斷睪酮向雙氫睪酮的轉(zhuǎn)化，可有效防止雄激素依賴性毛囊縮小[13-14]。雖然口服非那雄胺可以治療95%的男性脫發(fā)，但只有66%的男性實現(xiàn)了中等程度的毛發(fā)再生，5%的男性實現(xiàn)了顯著的毛發(fā)再生[15]，同時有可能導(dǎo)致男性性功能障礙、情緒障礙以及前列腺癌風(fēng)險增加[3]。AGA患者發(fā)生脫發(fā)時，祖細胞受損，但HFSCs仍保留，因此這種脫發(fā)是可逆的[16]。然而，即使HFSCs仍存留，更有效增殖的DPCs數(shù)量卻顯著降低[7]。因此，毛發(fā)組織工程的目標是通過體外培養(yǎng)ADSC-CM、體內(nèi)恢復(fù)DPCs活性，同時通過分泌物刺激毛囊干細胞生長等方法，誘導(dǎo)毛發(fā)快速再生。

女性型脫發(fā)是女性最常見的脫發(fā)形式，其脫發(fā)的過程稱為“毛囊小型化”，發(fā)病原因尚不清楚，可能與遺傳及雄激素有關(guān)[17]。米諾地爾是女性型脫發(fā)的主要治療藥物，如上所述，這種藥物在治療后可能發(fā)生一些不良反應(yīng)；將非那雄胺和米諾地爾聯(lián)合可有效治療FPHL，但由于其致畸作用，這種療法僅限于絕經(jīng)后婦女。其他治療方法包括富血小板血漿（PRP）、微針及植發(fā)等[18]。

斑禿的病因暫不明確，免疫和遺傳因素均可導(dǎo)致這種疾病[4]，表現(xiàn)為非瘢痕性脫發(fā)，其組織學(xué)特征是由CD4+和CD8+T細胞組成的毛囊內(nèi)或毛囊周圍淋巴細胞浸潤。最常見的治療方式是病灶內(nèi)皮質(zhì)類固醇注射；其他治療包括局部和全身應(yīng)用皮質(zhì)類固醇、米諾地爾等。這些藥物可能產(chǎn)生許多不良影響，如體質(zhì)量增加、缺血性壞死、高血壓、糖尿病、睡眠障礙、情緒變化、痤瘡、過敏反應(yīng)[4]。休止期脫發(fā)是指毛囊休止期時頭發(fā)的過度脫落。常見原因包括急性重癥、發(fā)熱、手術(shù)、營養(yǎng)不良、慢性疾病以及口服避孕藥等。通常在去除病因后，脫發(fā)狀況會明顯改善[19-20]。惡性腫瘤引起的脫發(fā)與化療相關(guān)，化療藥物在通過破壞快速分裂的癌細胞起治療作用的同時，也破壞掉身體的其他快速分裂細胞（如毛囊），這種不良影響導(dǎo)致化療引起的脫發(fā)從1～3周開始，并在1～2個月時達到峰值[8]。

除藥物治療脫發(fā)外，頭發(fā)移植手術(shù)效果顯著，可以直接改善脫發(fā)患者的外觀，適用于大部分類型的脫發(fā)患者。據(jù)研究，目前，毛囊移植存活率最高達95%[21]，但毛發(fā)移植的本質(zhì)是自體優(yōu)勢資源再分配，有限的供區(qū)限制了毛發(fā)移植受體的治療滿意度。同時，出于長遠考慮，不建議年輕脫發(fā)患者進行頭發(fā)移植手術(shù)。因此，脫發(fā)患者迫切需要有提高療效、減少不良反應(yīng)且不易產(chǎn)生耐藥性的替代療法。

隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，干細胞應(yīng)用為脫發(fā)治療開辟了新的途徑。干細胞參與組織和器官的發(fā)育和再生，具有自我更新能力和多系分化潛能[22]。干細胞的移植可能使毛囊再生成為現(xiàn)實，其特點是免疫原性弱，分化能力強[23]。然而，近年來有研究報道多能干細胞的移植存在有致瘤風(fēng)險，保質(zhì)期短，需要專門的生產(chǎn)、運輸和儲存條件，成本較高等問題[24]。由于對更安全、高效和經(jīng)濟有效的治療方法的需求，近幾十年來，來自干細胞的條件培養(yǎng)基刺激了頭發(fā)研究領(lǐng)域的發(fā)展。

2 ADSC-CM治療脫發(fā)

2.1 ADSC-CM的制備 一般首先采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1%青霉素和鏈霉素的DMEM 生長培養(yǎng)基)體外培養(yǎng)ADSC[25]，至ADSCs第4代細胞達到70%～80%融合時，換用無血清及抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，即以DMEM代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基。體外培養(yǎng)2～3 d后，以300g×10 min離心。使用0.22 μm的過濾器過濾，收集上清，即ADSC-CM[24]。由于無細胞狀態(tài)，ADSC-CM的一個重要優(yōu)點是它與受體的免疫相容性—不需要作為細胞療法先決條件的供體-受體匹配。與干細胞相比，ADSC-CM生產(chǎn)所需的時間和成本更低，大量生產(chǎn)的可能性更高，保質(zhì)期更長[26]。此外，ADSC-CM可以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)、冷凍干燥以及易于包裝、運輸和儲存，這對于臨床應(yīng)用來說更加經(jīng)濟和實用。

2.2 ADSC-CM的作用機制 許多研究指出，脂肪組織及其提取物(脂肪干細胞、ADSC-CM)能夠促進毛發(fā)生長。Narita等[27]的一項臨床研究中，將21例患有AGA的男性及19例患女性型脫發(fā)患者通過每月皮內(nèi)注射ADSC-CM治療6個月，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADSC-CM對毛囊的再生有效。Xiao等[28]建立了C57小鼠的脫發(fā)模型，并予以兩種條件培養(yǎng)基（脂肪干細胞基質(zhì)膠條件培養(yǎng)基及ADSC-CM）處理，結(jié)果，兩種條件培養(yǎng)基中的各種生長因子如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、β-成纖維細胞生長因子（β-FGF）及角質(zhì)細胞生長因子（KGF）等分泌增加；且與對照組相比，條件培養(yǎng)基組可促進小鼠毛發(fā)生長。Park等[29]建立了C3H/NeH小鼠脫發(fā)模型，證實了ADSC-CM中含有多種可促進小鼠毛發(fā)生長的生長因子，且在缺氧條件下培養(yǎng)出的ADSC-CM中生長因子含量增多，促毛發(fā)生長效果更佳。這些報道中，其效應(yīng)機制主要指向ADSC-CM中的生長因子。脂肪干細胞具有強大的分化、再生、修復(fù)和分泌功能，可通過分泌細胞因子、調(diào)節(jié)細胞周期、促進血管新生以及抗炎、抗氧化等綜合作用，促進毛乳頭、毛囊干細胞的再生和增殖，進而正性調(diào)節(jié)了毛發(fā)的生長。

毛囊是一個自我更新的微型器官，在成年人的生命中會在不同時間經(jīng)歷生長期（生長初期），衰退期（生長中期）和休止期（生長終期）的周期[30]。干細胞通過刺激信號傳導(dǎo)通路、釋放多種生長因子，調(diào)節(jié)頭發(fā)的生長，刺激毛囊發(fā)育并抑制細胞凋亡，從而延長生長期，誘導(dǎo)細胞生長。

ADSC-CM中的活性因子在毛囊的增殖中起到很大作用。如VEGF通過刺激血管生成來調(diào)節(jié)毛發(fā)生長和毛囊大小，胰島素樣生長因子1(IGF-1)控制毛發(fā)生長周期和毛細胞分化。ADSCs的旁分泌活性非常復(fù)雜，干細胞分泌的因子對毛囊有直接和間接的影響（見表2）?？紤]到與毛發(fā)再生相關(guān)的自然反應(yīng)是涉及毛囊干細胞的激活和分化的復(fù)雜過程，一組旁分泌因子而不是ADSC-CM中單個旁分泌因子負責(zé)觸發(fā)反應(yīng)[26]。需要進一步的研究來確定有利于毛發(fā)再生和生長的關(guān)鍵生長因子和細胞因子。

表2 ADSC-CM分泌的細胞因子

ADSC-CM還通過Wnt途徑參與毛發(fā)生長的靜止期到生長期的發(fā)展。Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被認為是刺激毛發(fā)生長的關(guān)鍵因素。Xiao等[28]和Park等[29]的研究均表明，ADSC-CM不僅通過旁分泌生長因子促進毛發(fā)生長，還可通過Wnt途徑激活毛囊。在成人毛發(fā)周期中，生長期開始時就可以觀察到Wnt活性，在毛干分化期間，生長期毛囊的前皮質(zhì)中也可以觀察到Wnt活性[37]。已有研究證明了Wnt/β-catnein激活在毛囊生長中的必要作用，但Wnt信號的這種動態(tài)模式在毛囊發(fā)育和成人毛發(fā)周期中是如何調(diào)節(jié)的尚不清楚。

3 微針用于治療脫發(fā)

微針治療也稱為經(jīng)皮膠原誘導(dǎo)療法，通過滾動微針至皮膚輕微出血，在皮膚上形成微孔，增加藥物和活性成分的滲透性。微針還可以促進血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子α和β）、VEGF、FGF、表皮生長因子及Wnt蛋白等釋放增加，而不會明顯損害表皮[38-40]。與ADSC-CM類似，微針療法通過釋放上述生長因子并刺激Wnt/β-catenin信號通路的傳導(dǎo)，介導(dǎo)了頭發(fā)的形態(tài)發(fā)生和毛細血管的生長。Kim等[39]將微針應(yīng)用于C57小鼠后發(fā)現(xiàn)，微針可通過上調(diào)Wnt/β-catenin通路，促進VEGF等生長因子釋放，促進小鼠毛發(fā)生長。

在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，使用梅花針在頭皮脫發(fā)區(qū)刺出多個微孔直至輕微出血，可起到疏通經(jīng)絡(luò)、行氣活血、促進血液循環(huán)，改善受損毛囊、促進毛發(fā)再生等作用。Li等[41]以87例脫發(fā)患者作為研究對象，按隨機數(shù)字表法分為西藥組和中藥組，西藥組給予胱氨酸片口服，中藥組采用梅花針針刺后服用益氣固表的中藥治療，得出中藥組總有效率顯著高于西藥組的結(jié)論；研究表明，梅花針針刺可以有效促進脫發(fā)部位的血液循環(huán)，調(diào)理氣血，使氣血流通更加順暢，刺激脫發(fā)部位萎縮的毛囊盡快恢復(fù)功能，促進頭發(fā)的生長，同時通過神經(jīng)體液調(diào)節(jié)，加快新發(fā)增長。我們認為，微針與中醫(yī)梅花針有相似的作用機制。

雖然檢測微針療效的相關(guān)研究數(shù)量有限，但微針已經(jīng)成功地與其他促進毛發(fā)生長的療法聯(lián)合使用，如米諾地爾、血小板血漿和局部類固醇藥物，并有結(jié)果顯示可以刺激毛囊生長。Lee等[42]將生長因子聯(lián)合微針應(yīng)用于女性型脫發(fā)患者，證實了二者聯(lián)用對增加頭發(fā)密度是安全有效的。Sasaki[43]將微針及PRP聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)二者有協(xié)同作用，可改善多種皮膚及脫發(fā)問題。 Chandrashekar等[44]用微針配合曲安奈德局部應(yīng)用治療兩名抗藥性斑禿，結(jié)果也令人滿意。通過以上研究可以發(fā)現(xiàn)，微針作為有前途的治療資源，可與其他治療方法結(jié)合使用，不僅有侵入性小、有助于滲透等優(yōu)點，同時可增加多種生長因子及Wnt蛋白等釋放，而不會明顯破壞表皮。

4 結(jié) 語

目前，ADSC-CM應(yīng)用于毛發(fā)再生還處于起步階段，不可避免地存在一些挑戰(zhàn)：①ADSC-CM的給藥方法、貯存方案、給藥劑量都有待深入研究。②不同捐獻者、不同批次的ADSCs在有效性、安全性方面不盡相同，隨之的治療效果也不盡相同，還需要研究驗證[45]。③培養(yǎng)條件會影響ADSC-CM中分泌因子的組成，首先，與常氧條件相比，缺氧條件下干細胞的增殖增加，缺氧還可以通過增強某些生長因子的分泌來增強干細胞的旁分泌作用[46]；其次，在3D系統(tǒng)中生長的細胞顯示出更高的生存力，在增殖、分化、基因表達和蛋白質(zhì)合成等方面也更優(yōu)[47]。④ADSCs在培養(yǎng)過程中會加入一些化學(xué)制劑，這些化學(xué)物質(zhì)也會影響頭皮環(huán)境。未來可以嘗試將上述參數(shù)標準化，以獲得成分一致的ADSC-CM。

綜上，ADSC-CM及微針均對脫發(fā)有顯著療效，基于回顧性臨床研究的結(jié)果，使用ADSC-CM聯(lián)合微針治療脫發(fā)是有希望的。今后可以進一步研究ADSC-CM聯(lián)合微針對脫發(fā)中毛發(fā)再生的影響，開展更大樣本量的隨機安慰劑對照研究，確定治療方案，為脫發(fā)患者提供更高效的治療方式，以提高脫發(fā)患者的預(yù)后。