小肽對大黃魚仔魚生長和小腸發(fā)育的影響及其在低溫脅迫下的抗氧化應(yīng)激效應(yīng)

李文成 趙旭民 張延軍 宋 煒,4 曾 霖 張 惠 趙向炯

(1.浙江海洋大學(xué)國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，舟山316000；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海200090； 3.浙江華太生物科技有限公司，義烏322005；4.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室，青島266237)

大黃魚(Larimichthyscrocea)是我國南方沿海重要海洋經(jīng)濟(jì)魚類，其營養(yǎng)豐富、口感鮮美，備受廣大消費(fèi)者的青睞[1]。自從20世紀(jì)80年代大黃魚大批量人工育苗技術(shù)獲得突破以來，其養(yǎng)殖業(yè)在福建、廣東、浙江等地得到了迅速發(fā)展[2]。然而，冬春季大黃魚繁殖期間，其仔稚魚死亡率高，尤其是在浙江養(yǎng)殖區(qū)域。低溫使魚類處于脅迫生理狀態(tài)，可能導(dǎo)致其生長緩慢、免疫力低下、疾病頻繁爆發(fā)[3-4]。當(dāng)前，養(yǎng)殖戶濫用抗生素來防治和治理環(huán)境脅迫所誘導(dǎo)的魚類疾病，這容易引起魚類機(jī)體和水環(huán)境抗生素藥物殘留和病原菌耐藥性等問題，影響了水產(chǎn)品和水環(huán)境安全，并阻礙了水產(chǎn)養(yǎng)殖的綠色發(fā)展。

當(dāng)魚類遭受環(huán)境脅迫時(shí)，導(dǎo)致活性氧(oxygen species,ROS)大量產(chǎn)生[5]。若機(jī)體不能有效控制ROS含量，將會(huì)產(chǎn)生蛋白質(zhì)羰基化、脂質(zhì)過氧化、DNA合成障礙等危害，從而導(dǎo)致魚類生理功能失常[6]。魚類可以通過抗氧化系統(tǒng)控制ROS過量產(chǎn)生，從而維持機(jī)體氧化還原平衡。環(huán)境脅迫能夠上調(diào)抗氧化酶如過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)等基因的表達(dá)[7]。非酶抗氧化劑谷胱甘肽(glutathione,GSH)可與抗氧化酶協(xié)同作用，共同抑制ROS過量產(chǎn)生[8]。另外，魚類的非特異性免疫系統(tǒng)在緩解脅迫誘導(dǎo)的損傷方面也發(fā)揮著重要作用，且與抗氧化系統(tǒng)密切相關(guān)[9]。作為非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，溶菌酶(lysozyme,LZM)和堿性磷酸酶(alkaline phophatase,AKP)基因表達(dá)水平通常被用作評價(jià)環(huán)境脅迫、細(xì)菌感染、免疫刺激劑等作用效應(yīng)的分子生物標(biāo)記物[10]。

基因表達(dá)水平主要受控于核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factors,NFs)。在哺乳動(dòng)物中，NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)均能被ROS誘導(dǎo)激活，激活的Nrf2和NF-κB分別結(jié)合到抗氧化酶和非特異性免疫酶相關(guān)基因的順式作用元件，從而調(diào)控這些目的基因的表達(dá)[11-12]。因此，Nrf2和NF-κB分別在抗氧化反應(yīng)和非特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

小肽又稱為短肽、寡肽，是一類由蛋白質(zhì)水解、易消化吸收且具有多種生物功能的小分子物質(zhì)[13]。它能顯著提高水生動(dòng)物的攝食量、飼料效率及機(jī)體蛋白質(zhì)合成能力，從而促進(jìn)它們的生長。小肽也能改善水生動(dòng)物的抗氧化性能和非特異性免疫力，從而降低發(fā)病率和提高抗逆性。已有研究表明，飼料中添加小肽可提高魚類的抗氧化能力和非特異性免疫力[14-15]，也能改善凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的抗病力[16]。然而，有關(guān)小肽營養(yǎng)強(qiáng)化活餌料對魚類生理影響的研究尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)用小肽營養(yǎng)強(qiáng)化輪蟲和鹵蟲投喂于大黃魚仔魚，以探討小肽對其生長和小腸發(fā)育的影響，然后將大黃魚仔魚低溫暴露24 h，以探討小肽對低溫脅迫下大黃魚仔魚抗氧化能力和非特異性免疫力的影響，該研究成果可為大黃魚仔魚養(yǎng)殖中小肽最佳營養(yǎng)強(qiáng)化濃度提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也可為小肽緩解環(huán)境脅迫對魚類損傷的研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 小肽制備

利用豬小腸生產(chǎn)肝素鈉的下腳料腸黏膜為原料，采用堿性水解蛋白酶和胰蛋白酶裂解制備小肽。使用凝膠色譜法測定小肽分子質(zhì)量組成，分子質(zhì)量小于2.0 ku的占80%以上。小肽氨基酸組成采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18246—2000中方法測定，氮、五氧化二磷、氧化鉀和有機(jī)質(zhì)采用農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 525—2012中方法測定，其主要成分見表1。

表1 小肽主要成分(濕重基礎(chǔ))

1.1.2 輪蟲和鹵蟲營養(yǎng)強(qiáng)化

輪蟲營養(yǎng)強(qiáng)化：將寧德霞浦育苗場水泥池培育的褶皺臂尾輪蟲(Brachionusplicatilis)以100～120條/mL的密度轉(zhuǎn)移到5個(gè)容量為1 000 L的鋼化玻璃桶的水體(海水800 L)中，加入小肽(體積百分濃度約為86.50%)，使得水體中小肽濃度分別為0、0.5、1.0、2.0和3.0 mL/m3，在水溫為(24.1±3.4) ℃、鹽度為26.12±0.35、光照為3 000 lx的條件下進(jìn)行營養(yǎng)強(qiáng)化。7 d以后，用250目尼龍篩絹網(wǎng)袋過濾收集10%體積的輪蟲用于大黃魚仔魚投喂，然后再加入相同濃度和體積的小肽溶液，每天4次。將小肽濃度為0和2.0 mL/m3養(yǎng)殖桶中所收集的輪蟲樣本(20 mL)保存于-20 ℃冰箱，取樣3次，用于粗蛋白質(zhì)含量和氨基酸組成測定。

鹵蟲營養(yǎng)強(qiáng)化：將寧德霞浦育苗場孵化的鹵蟲Ⅰ齡無節(jié)幼體(體內(nèi)卵黃已耗盡)按45～50 條/mL的密度放入5個(gè)容量為1 000 L的鋼化玻璃桶水體(海水800 L)中，加入小肽(體積百分濃度約為86.50%)，使得水體中小肽濃度分別為0、0.5、1.0、2.0和3.0 mL/m3，在水溫為(26.0±2.3) ℃、鹽度為26.12±0.35、自然光照的條件下營養(yǎng)強(qiáng)化24 h后，用250目尼龍篩絹網(wǎng)袋過濾收集鹵蟲用于大黃魚仔魚投喂。將小肽濃度為0和2.0 mL/m3養(yǎng)殖桶中所收集的鹵蟲樣本(20 mL)保存于-20 ℃冰箱中，取樣3次，用于粗蛋白質(zhì)含量和氨基酸組成測定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)1：大黃魚仔魚生長試驗(yàn)

從寧德霞浦育苗場購買7.5萬尾左右剛孵化出的大黃魚仔魚，放入15個(gè)容積為300 L的鋼化玻璃桶中飼養(yǎng)，約5 000尾/桶。將15桶試驗(yàn)魚隨機(jī)分為5組，每組3桶(重復(fù))，采用靜水充氣養(yǎng)殖，每天換水2次(08:00和16:00)，換水率為60%。水質(zhì)參數(shù)如下：水溫為(24.1±3.4) ℃，鹽度為26.12±0.35，pH為7.67±0.31；總氨氮濃度為(0.15±0.02) mg/L～(0.20±0.03) mg/L，各組之間無顯著差異(P>0.05)。將經(jīng)0、0.5、1.0、2.0和3.0 mL/m3小肽營養(yǎng)強(qiáng)化好的輪蟲和鹵蟲按圖1的投喂策略投喂5組大黃魚仔魚，并分別命名為對照組、S0.5組、S1.0組、S2.0組和S3.0組。每天投喂4次，投喂間隔6 h。大黃魚仔魚攝食0.5 h之后剩余少量的輪蟲和鹵蟲即可停止投喂。試驗(yàn)結(jié)束后，每桶隨機(jī)取10尾魚，用精度為0.1 mm的游標(biāo)卡尺測量體長。每桶隨機(jī)取4尾魚，用4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)固定，用于組織切片觀察。組織切片制作具體步驟[17]如下：首先，樣品采用梯度乙醇使其脫水，水楊酸甲酯透明，石蠟包埋；然后，用石蠟切片機(jī)切成矢狀切片(厚度為4～6 μm)，并用蘇木素-伊紅(HE)染色；最后，用光學(xué)顯微鏡觀察切片，用分析軟件Image-pro plus 6.0(Media Cybernetics, Inc.,美國)隨機(jī)選取5處測量小腸絨毛高度(mm)(圖2中紅色線段)，計(jì)數(shù)視野內(nèi)絨毛數(shù)量并測量組織面積(mm2)，并求出單位面積內(nèi)絨毛數(shù)量(個(gè)/mm2)(圖3)。

圖1 輪蟲和鹵蟲投喂策略

圖2 大黃魚仔魚小腸絨毛高度示意圖

圖3 大黃魚仔魚小腸絨毛數(shù)量和組織面積示意圖

1.2.2 試驗(yàn)2：大黃魚仔魚低溫脅迫試驗(yàn)

選擇21個(gè)容量為70 L的塑料桶，分為7組，每組3個(gè)桶(重復(fù))。按圖4所示，從試驗(yàn)1對應(yīng)的鋼化玻璃桶中隨機(jī)取200尾魚放入塑料桶中。2組采用常溫處理，另外5組采用低溫處理，分別命名為S0常溫組、S1.0常溫組、S0低溫組、S0.5低溫組、S1.0低溫組、S2.0低溫組和S3.0低溫組。降溫方式如下：將養(yǎng)殖桶水體溫度以3 ℃/h降至12 ℃(自然海水溫度)，然后將12 ℃水溫維持24 h。試驗(yàn)結(jié)束后取樣，每桶取4尾試驗(yàn)魚用于ROS和GSH含量測定，另取4尾試驗(yàn)魚的肝臟用于基因表達(dá)測定。所有樣本先放于液氮中，然后轉(zhuǎn)移到-80 ℃超低溫冰箱中保存。

圖4 試驗(yàn)組示意圖

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 粗蛋白質(zhì)含量和氨基酸組成

采用凱氏定氮法測定輪蟲和鹵蟲中粗蛋白質(zhì)含量。參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18246—2000的方法進(jìn)行樣品處理，采用高效液相色譜儀測定其氨基酸組成。

1.3.2 ROS和GSH含量測定

全魚均漿液制備參照Zeng等[18]的方法。向全魚中加入9倍的4 ℃緩沖液[1 mmol/L 4-(2-氨甲基)苯磺酰氟鹽酸、1 mmol/L苯甲脒、2 mmol/L二硫蘇糖醇、5 mmol/L乙二胺四乙酸、80 mmol/L氨基丁三醇，pH 7.6)，勻漿后制成10%勻漿液。在4 ℃下以900 r/min離心10 min，取上清，采用Bradford方法測量蛋白質(zhì)含量，使用試劑盒(南京建成生物工程研究所產(chǎn)品)采用分光光度法測定ROS和GSH含量。

1.3.3 抗氧化和非特異性免疫相關(guān)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

續(xù)表2基因名稱Gene names引物序列Primer sequences (5'—3')基因長度Gene length/bpPCR擴(kuò)增效率PCR amplification efficiency谷胱甘肽還原酶GRF:AGCCAAAACAGCCGTGATR:CGGCTAACATAAGCATCCC1260.98NF-E2相關(guān)因子2Nrf2F:CCCTCAAAATCCCTTTCACTR:GCTACCTTGTTCTTGCCGC900.96c型溶菌酶c-type LZMF:CCAGAGCCATCAACCACAACACTR:GATCGCCACGCTGACATCATC1520.97g型溶菌酶g-type LZMF:TCAGCCAAGGCACCGACATR:GCATCCACCGCTTCATAGCA1481.04堿性磷酸酶AKPF:TCAGCAGACTCCCGTCCCTCR:GTTGTCCAGTTCGCAGTTCTCATAG1750.98核轉(zhuǎn)錄因子-κBNF-κBF:TGCGGCTCGTGCGGATAR:GCGGCTTCAACTGGACTGC1171.05β-肌動(dòng)蛋白β-actinF:TCGTCGGTCGTCCCAGGCATR:ATGGCGTGGGGCAGAGCGT1821.05

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)單因素方差分析(one-way ANOVA)后，若存在顯著差異，再采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。以P<0.05為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小肽對輪蟲和鹵蟲的營養(yǎng)強(qiáng)化效果

與對照組相比，S2.0組輪蟲和鹵蟲的粗蛋白質(zhì)含量無顯著變化(P>0.05)(表3)。與對照組相比，S2.0組輪蟲和鹵蟲的必需氨基酸(EAA)和總氨基酸(TAA)含量顯著增加(P<0.05)，但2組之間的EAA/TAA差異不顯著(P>0.05)(表4)。

表3 小肽對輪蟲和鹵蟲粗蛋白質(zhì)含量的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

表4 小肽對輪蟲和鹵蟲氨基酸組成的影響(占粗蛋白質(zhì)的百分比)

續(xù)表4氨基酸Amino acids輪蟲 Rotifers對照組Control groupS2.0組S2.0 group鹵蟲 Artemia nauplii對照組Control groupS2.0組S2.0 group甘氨酸 Gly4.37±0.295.14±0.22*3.37±0.293.64±0.25丙氨酸 Ala3.02±0.233.88±0.24*4.08±0.344.78±0.24*纈氨酸 Val2.96±0.143.73±0.21*3.12±0.243.62±0.21蛋氨酸 Met0.59±0.040.71±0.10*0.64±0.060.76±0.09異亮氨酸 Ile2.63±0.163.29±0.28*2.40±0.152.73±0.13*亮氨酸 Leu4.08±0.245.25±0.22*3.94±0.244.29±0.14酪氨酸 Tyr2.86±0.193.39±0.22*2.75±0.212.96±0.40苯丙氨酸 Phe2.71±0.143.46±0.19*1.66±0.151.81±0.19賴氨酸 Lys3.89±0.275.16±0.24*5.86±0.506.72±0.38組氨酸 His0.63±0.070.74±0.071.47±0.111.58±0.10精氨酸 Arg1.87±0.152.24±0.12*5.24±0.326.13±0.48脯氨酸 Pro3.08±0.293.68±0.19*3.36±0.193.73±0.26必需氨基酸 EAA19.20±1.1524.57±1.53*20.53±1.6723.38±1.91總氨基酸 TAA46.47±1.3357.59±1.66*58.33±1.8365.17±2.07*必需氨基酸/總氨基酸 EAA/TAA41.32±1.1642.65±1.1335.18±1.3235.71±1.35

2.2 小肽對大黃魚仔魚生長和小腸發(fā)育的影響

由圖5可知，與對照組相比，投喂由4種不同濃度小肽營養(yǎng)強(qiáng)化的輪蟲和鹵蟲均能促進(jìn)大黃魚仔魚的生長，使其體長顯著增加(P<0.05)。根據(jù)小肽濃度和大黃魚仔魚體長的二元回歸分析，小肽最佳營養(yǎng)強(qiáng)化濃度為1.88 mL/m3(圖5)。與對照組相比，4種不同濃度小肽組的小腸絨毛高度均顯著增加(P<0.05)，尤其是S1.0組；S1.0組和S3.0組的小腸絨毛數(shù)量顯著增多(P<0.05)；S1.0組和S2.0組的小腸組織面積顯著增大(P<0.05)。然而，小腸單位面積內(nèi)絨毛數(shù)量不受小肽濃度的顯著影響(P>0.05)(表3)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示顯著差異(P<0.05)。圖6同。

表5 小肽對大黃魚仔魚小腸絨毛形態(tài)的影響

2.3 小肽對大黃魚仔魚ROS和GSH含量的影響

由圖6可知，與S0常溫組相比，S1.0常溫組和S3.0低溫組的ROS含量顯著降低(P<0.05)，S0低溫組、S0.5低溫和S2.0低溫組的ROS含量顯著升高(P<0.05)。與S0常溫組相比，除S0低溫組的GSH含量顯著降低(P<0.05)外，而小肽在常溫和低溫條件下均能顯著增加大黃魚仔魚的GSH含量(P<0.05)。

圖6 小肽對低溫脅迫下大黃魚仔魚ROS(A)和GSH(B)含量的影響

2.4 小肽對大黃魚仔魚肝臟抗氧化相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

由表6可知，與S0常溫組相比，S1.0常溫組的銅鋅超氧化物歧化酶(copper-zinc superoxide dismutase，Cu/Zn-SOD)、錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，Mn-SOD)、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶-1a(glutathione peroxidase-1a,GPx-1a)、谷胱甘肽過氧化物酶-1b(glutathione peroxidase-1b，GPx-1b)、GR和Nrf2基因表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)；S0低溫組的Cu/Zn-SOD、CAT、GPx-1a、GR和Nrf2基因表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；S0.5低溫組、S2.0低溫組和S3.0低溫組的Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx-1a、GPx-1b、GR和Nrf2基因表達(dá)水平均顯著提高(P<0.05)；S1.0低溫組的Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx-1a、GR和Nrf2基因表達(dá)水平均顯著提高(P<0.05)。

2.5 小肽對大黃魚仔魚肝臟非特異性免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

由表7可知，與S0常溫組相比，S1.0常溫組的c型溶菌酶(c-type lysozyme，c-typeLZM)、g型蛋白溶菌酶(g-type lysozyme，g-typeLZM)、AKP和NF-κB基因表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05)；S0低溫組的c-typeLZM、g-typeLZM、AKP和NF-κB基因表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；S1.0低溫組、S2.0低溫組和S3.0低溫組的c-typeLZM、g-typeLZM、AKP和NF-κB基因表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)；S0.5低溫組的c-typeLZM、AKP和NF-κB基因表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。

表6 小肽對低溫脅迫下大黃魚仔魚肝臟抗氧化相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

表7 小肽對低溫脅迫下大黃魚仔魚肝臟非特異性免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

2.6 相關(guān)性分析

由表8可知，大黃魚仔魚ROS含量與Nrf2和NF-κB基因表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；Nrf2基因表達(dá)水平與抗氧化酶(Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx-1a、GPx-1b、GR)基因表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；NF-κB基因水平與非特異免疫酶(c-typeLZM、g-typeLZM、AKP)基因表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

表8 大黃魚仔魚不同參數(shù)之間的相關(guān)性分析

3 討 論

輪蟲和鹵蟲是海水仔魚育苗的主要活性餌料。然而，它們均存在營養(yǎng)缺陷，需要進(jìn)行營養(yǎng)強(qiáng)化才適合充當(dāng)開口餌料。粗蛋白質(zhì)含量、氨基酸種類及其含量是重要的營養(yǎng)指標(biāo)。在本研究中，盡管水體中小肽濃度為2.0 mL/m3時(shí)對輪蟲和鹵蟲的粗蛋白質(zhì)含量未產(chǎn)生顯著影響，但能顯著提高它們的EAA和TAA含量，表明小肽改善了輪蟲和鹵蟲的營養(yǎng)價(jià)值。

抗氧化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)在保護(hù)機(jī)體免受環(huán)境脅迫所造成的損傷等方面發(fā)揮著積極作用[21]。當(dāng)前，關(guān)于低溫脅迫對魚類影響的分子機(jī)理研究僅有少量報(bào)道。有研究表明，飼料中的小肽能夠通過改善魚類的抗氧化性能和非特異性免疫力來提高脅迫耐受性[15-16]。本試驗(yàn)研究了小肽營養(yǎng)強(qiáng)化輪蟲和鹵蟲對大黃魚仔魚生長的影響以及對低溫脅迫下大黃魚仔魚抗氧化性能和非特異性免疫力的影響，并試圖闡明其分子機(jī)理。

與對照組相比，不同濃度小肽營養(yǎng)強(qiáng)化輪蟲和鹵蟲均顯著提高了大黃魚仔魚的體長、小腸絨毛高度和組織面積等生長發(fā)育指標(biāo)，尤其是S1.0組，與李杰[22]的研究結(jié)果相似。小肽通過增加小腸絨毛高度、數(shù)量和組織面積來增加小肽載體數(shù)量，從而改善游離氨基酸和小肽的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，進(jìn)而提高魚類機(jī)體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成能力和沉淀量，最終促進(jìn)魚類的生長[23]。以大黃魚仔魚體長為參數(shù)，小肽最佳營養(yǎng)強(qiáng)化濃度為1.88 mL/m3。

當(dāng)魚類處于氧化應(yīng)激生理狀態(tài)時(shí)，機(jī)體內(nèi)通常會(huì)產(chǎn)生大量ROS，因此ROS被認(rèn)為是氧化應(yīng)激標(biāo)志物[24]。S0低溫組的大黃魚仔魚ROS含量較S0常溫組顯著提高，表明低溫對大黃魚仔魚產(chǎn)生了氧化損傷。與S0常溫組相比，小肽能夠顯著降低大黃魚仔魚機(jī)體內(nèi)的ROS含量，表明其抗氧化能力發(fā)生了改變，從而使機(jī)體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生了新的平衡[5]。與S0低溫組相比，小肽能夠顯著降低低溫脅迫下大黃魚仔魚機(jī)體內(nèi)的ROS產(chǎn)量，表明小肽能夠緩解低溫脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷。非酶抗氧化劑GSH在抑制超氧化物產(chǎn)生、緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用[8]。與S0常溫組相比，小肽增加了大黃魚仔魚機(jī)體內(nèi)的GSH含量。這進(jìn)一步解釋了小肽能夠提高大黃魚仔魚在低溫脅迫下的抗氧化能力，從而降低ROS含量，緩解氧化損傷。

與S0常溫組相比，低溫脅迫(S0低溫組)顯著抑制大黃魚仔魚肝臟非特異性免疫酶(c-typeLZM、g-typeLZM和AKP)基因表達(dá)水平，從而降低了非特異性免疫力；而小肽提高了低溫脅迫下大黃魚仔魚肝臟c-typeLZM、g-typeLZM和AKP基因表達(dá)水平，從而提高了非特異性免疫力，以此來應(yīng)對低溫脅迫誘導(dǎo)的損傷。值得注意的是，在常溫條件下，大黃魚仔魚肝臟非特異性免疫相關(guān)基因表達(dá)水平不受小肽(S1.0常溫組)的影響。有研究表明，功能性食品可改善能量代謝效率來改變魚類宿主生理狀態(tài)。一旦遭受脅迫時(shí)，魚類即可通過改善免疫功能來保護(hù)機(jī)體免遭脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷[30]。另外，當(dāng)魚類處于正常生理狀態(tài)時(shí)，非特異性免疫相關(guān)基因的過量表達(dá)也會(huì)對宿主產(chǎn)生負(fù)面影響[31]。

基因表達(dá)水平受核轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2和NF-κB分別在調(diào)控抗氧化反應(yīng)和非特異性免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[12,32]。本研究中，低溫脅迫抑制了大黃魚仔魚肝臟Nrf2和NF-κB基因的表達(dá)，這與汞脅迫狀態(tài)下大黃魚的研究結(jié)果[30-32]相似。Nrf2基因表達(dá)水平與Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx-1a、GPx-1b、GR基因表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，表明這些抗氧化酶基因表達(dá)受Nrf2調(diào)控。NF-κB基因表達(dá)水平與c-typeLZM、g-typeLZM和AKP基因表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，表明這些非特異性免疫酶基因表達(dá)的激活依賴于NF-κB信號通路。ROS可充當(dāng)抗氧化反應(yīng)和非特異性免疫反應(yīng)的第二信號分子。ROS可激活Nrf2和NF-κB基因表達(dá)，從而調(diào)控抗氧化酶基因和非特異性免疫酶基因的表達(dá)[33-34]。ROS含量與Nrf2和NF-κB基因表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。

4 結(jié) 論

① 小肽能夠提高輪蟲和鹵蟲的必需氨基酸和總氨基酸含量，從而促進(jìn)大黃魚仔魚的生長和小腸發(fā)育，最佳營養(yǎng)強(qiáng)化濃度為1.88 mL/m3。

② 小肽通過誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄基因Nrf2和NF-κB的表達(dá)來增加抗氧化酶基因和非特異性免疫酶基因表達(dá)水平，從而緩解低溫脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷。

致謝：

感謝臺(tái)州大陳黃魚有限公司陳國業(yè)工程師對大黃魚仔魚養(yǎng)殖所提供的寶貴意見和技術(shù)指導(dǎo)。