延齡草甾體皂苷抗大鼠急性心肌缺血有效成分的研究

★ 李淑琪 胡凡 文安 張忠立 左月明 王亞芳（.江西中醫(yī)藥大學藥學院 南昌330004；.江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 南昌 330006）

延齡草為百合科延齡草屬植物延齡草Trillium tschonoskiiMaxim.的干燥根及根莖，其味甘、性平、有小毒，是傳統(tǒng)的名貴中藥，具有延年益壽的功效［1］。主治頭暈目眩、跌打損傷、神經(jīng)衰弱、腦震蕩后遺癥等疾病，是恩施土家族著名民間藥之一［2］。現(xiàn)代藥理研究具有抗氧化、抗衰老、降血壓、抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫等作用［3-4］。有研究發(fā)現(xiàn)［5］，甾體皂苷可增加冠狀動脈血流量、促進側(cè)支循環(huán)，增加心肌的供血供氧，降低血壓及血液黏稠度、改善血脂，減輕心肌缺血程度，具有預防和治療冠心病的作用。目前關(guān)于延齡草抗心肌缺血的活性研究較少，本項目組前期通過結(jié)扎大鼠冠狀動脈建立急性心肌缺血模型，研究證實延齡草抗心肌缺血的有效部位為85 %乙醇洗脫物［6］，并從有效部位中分離得到指標性和特征性3個甾體皂苷類單體。本實驗對延齡草中3個甾體皂苷類單體進行結(jié)構(gòu)確定和抗心肌缺血作用機制的探討，為新藥開發(fā)及指導臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠90只，SPF級，體重（330±20）g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2016-0004。

1.2 藥材及試劑 延齡草藥材于2012年8月采購湖北省神農(nóng)架地區(qū)，由筆者左月明教授鑒定為百合科延齡草屬植物延齡草Trillium tschonoskiiMaxim.的根及根莖。地奧心血康膠囊（成都地奧制藥集團有限公司，國藥準字Z10910051，批號1612013）；水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號20141224）；紅四氮唑（TTC：北京索萊寶科技有限公司，批號：922G037）；PBS磷酸鹽緩沖劑（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司，批號4A10A00160）；CK、LDH檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20160615、20160608）。

1.3 儀器 PowerLab8/16生理記錄儀（埃德儀器國際貿(mào)易有限公司）；ALC-V8S小動物呼吸機（上海奧爾科特生物科技有限公司）；Thermo D-37520臺式高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技有限公司）；721可見分光光度計（上海悅豐儀器儀表有限公司）；ELX800酶標儀（Bio Tek公司）。

2 方法

2.1 藥品制備 延齡草根及根莖30.0 kg，粉碎后用70 %乙醇回流提取得總提物浸膏5.7 kg，總提物水混懸后正丁醇萃取，正丁醇層經(jīng)AB-8型大孔樹脂梯度洗脫，依次用水、30 %乙醇、60 %乙醇和85 %乙醇梯度洗脫，其中得85%乙醇洗脫部位991.0 g，該部位經(jīng)各種色譜技術(shù)分離得到上述3個量大于100 mg的Y2T、Y3T和Y4T單體化合物，通過核磁、質(zhì)譜等波譜技術(shù)進行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)構(gòu)分析如下。

Y2T：無 色 針 晶（ 甲 醇 ）。ESI-MSm/z：739.4245［M+H］+，分 子 式 為 C39H62O13。1H-NMR（DMSO-d6，400MHz）δ：5.34（1H，d，J=4.4 Hz，H-6），5.03（1H，d，J=0.8 Hz，Rha-H-1″），4.93（1H，d，J=6.0 Hz，Glc-H-1′），0.95（3H，brs，CH3-19），0.78（3H，d，J=6.8 Hz，CH3-21），0.74（3H，d，J=6.0 Hz，CH3-27），0.73（3H，s，CH3-18）；碳譜數(shù)據(jù)見表1。以上數(shù)據(jù)與文獻［7］報道的基本一致，故鑒定為偏諾皂苷元 -3-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷，即重樓皂苷Ⅵ，簡稱Y2T。

Y3T：白 色 針 晶（ 甲 醇 ）。ESI-MSm/z：885.4827［M+H］+，分子式為C45H72O17。1H-NMR（DMSO-d6，400MHz）δ：5.33（1H，d，J=4.4 Hz，H-6），5.02（1H，brs，Rha-H-1″），4.92（1H，d，J=6.4 Hz，Glc-H-1′），4.70（1H，d，J=2.0 Hz，Rha-H-1′″），0.95（3H，brs，CH3-19），0.78（3H，d，J=6.8 Hz，CH3-21），0.74（3H，d，J=6.0 Hz，CH3-27），0.73（3H，s，CH3-18）；碳譜數(shù)據(jù)見表1。以上數(shù)據(jù)與文獻［8］報道的基本一致，鑒定該化合物為偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→4）-［α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）］-β-D-吡喃葡萄糖苷，簡稱Y3T。

Y4T：白 色 針 晶（ 甲 醇 ）。ESI-MSm/z：1053.5272［M+Na］+,分子式為 C51H82O21。1H-NMR（DMSO-d6，400MHz）δ：5.32（1H，d，J=4.0 Hz，H-6），5.06（1H，brs，Rha-H-1′′′′），5.02（1H，brs，Rha-H-1″），4.86（1H，d，J=4.0 Hz，Glc-H-1′），4.67（1H，d，J=1.2 Hz，Rha-H-1′″），0.95（3H，brs，CH3-19），0.78（3H，d，J=6.8 Hz，CH3-21），0.74（3H，d，J=6.0 Hz，CH3-27），0.73（3H，s，CH3-18）；碳譜數(shù)據(jù)見表1。以上數(shù)據(jù)與文獻［9］報道的基本一致，鑒定該化合物為偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→4）-α-L-吡喃鼠李糖基（1→4）-［α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）］-β-D-吡喃葡萄糖苷，即重樓皂苷Ⅶ，簡稱Y4T。

表1 延齡草3個甾體皂苷的13C-NMR數(shù)據(jù)（DMSO-d6，100 MHz）

2.2 動物分組與給藥 將90只健康SD雄性大鼠，按體重隨機分為假手術(shù)組（Sham）、模型組（I/R）、地奧心血康組 60.00 mg/kg（Contrast）、Y2T高劑量組 29.14 mg/kg（Y2TH）、Y2T 中劑量組 14.57 mg/kg（Y2TM）、Y3T高 劑 量 組 17.14 mg/kg（Y3TH）、Y3T中劑量組8.86 mg/kg（Y3TM）、Y4T高劑量組26.86 mg/kg（Y4TH）、Y4T 中 劑 量 組 14.28 mg/kg（Y4TM），每組10只。給藥量為10mL/kg，假手術(shù)組、模型組灌予等量蒸餾水，連續(xù)灌胃14 d，每天1次。

2.3 動物模型的制備 于末次給藥1 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉動物，將動物仰臥位固定于鼠臺上，將心電圖針狀電極插入四肢皮下，連接肢導聯(lián)。喉部備皮消毒剪開皮膚，鈍性分離皮下筋膜、肌肉組織，找到氣管，行氣管插管術(shù)，并接動物呼吸機輔助呼吸，穩(wěn)定4～8 min后記錄一段正常Ⅱ?qū)?lián)心電圖。然后胸部去毛、消毒、沿左胸骨中線縱行切開皮膚約2～3 cm缺口，在第4、5肋間鈍性分離肋間肌，打開胸腔，用自制圓形取心環(huán)掏出心臟。在肺動脈圓錐與左心耳下緣交界，距左冠脈前降支根部1～2 mm處，用6/0縫合線結(jié)扎（假手術(shù)組只穿線不予結(jié)扎）。用心電圖監(jiān)測Ⅰ、Ⅱ?qū)?lián)ST段弓背明顯抬高大于0.2 mV且結(jié)扎心肌色澤變淺，判定結(jié)扎成功后將心臟放回胸腔，排空胸腔積氣后迅速夾閉胸腔［10］。

圖1 延齡草3個甾體皂苷的結(jié)構(gòu)式

2.4 觀察指標

2.4.1 Ⅱ?qū)?lián)心電圖 動物麻醉仰臥位固定于鼠臺上，四肢皮下插入心電圖針狀電極，記錄正常Ⅱ?qū)?lián)心電圖及冠脈結(jié)扎后半小時心電圖，觀察結(jié)扎后心電圖5、10、15、30 min ST 段及 T 波的變化［11］。

2.4.2 心肌梗塞范圍 大鼠心肌缺血3 h后，腹主動脈取血，迅速取出心臟，去除心包膜，用PBS緩沖液洗凈心腔積血，濾紙吸干水分，放置-20 ℃冰箱內(nèi)冷凍7～10 min后取出，迅速將左心室結(jié)扎線下部分心肌平行切成厚度約為2 mm的片狀，片狀心肌恢復室溫后置現(xiàn)配的1 %TTC緩沖液中，37 ℃持續(xù)避光染色 15 min，每隔 3～4 min 翻動 1 次以便染色均勻。染色后將心肌組織置于4 %多聚甲醛中固定24 h，正常心肌組織被染為紅色，梗塞區(qū)心肌組織呈蒼白色。將心肌組織按順序置于黑色底板上拍照，采用Image Pro Plus6.0醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)對拍照的心肌梗死區(qū)面積進行分析，使用count and measure abjects 工具計算梗死區(qū)面積及整個心肌面積，心肌梗死率=缺血區(qū)面積/心臟總面積×100 %［12］。

2.4.3 CK、LDH活力的檢測 大鼠心肌缺血3 h后腹主動脈取血 6 mL，4 ℃靜置 2 h 后 4 000 r/min低溫離心20 min取上清液，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩y試時快速解凍血清，使用ELX800 酶標儀試劑盒檢測CK、LDH的活力。

2.5 統(tǒng)計方法 利用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，全部結(jié)果均用 表示，心電圖以不同時間點測定值與結(jié)扎前正常值之差值表示。組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 延齡草3個甾體皂苷對心肌缺血大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段及T波變化的影響 結(jié)果見圖2所示，與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠結(jié)扎后5～30 min心電圖ST段、T波均顯著上升（P<0.01），說明I/R模型造模成功；與I/R組比較，地奧心血康組、Y2TH組、Y2TM組、Y3TH組、Y3TM組、Y4TH組、Y4TM組在結(jié)扎后5～30 min心電圖ST段、T波均明顯降低（P<0.05或P<0.01），具有統(tǒng)計學意義，說明延齡草甾體皂苷Y2T、Y3T、Y4T均有抗大鼠急性心肌缺血作用。

3.2 延齡草3個甾體皂苷對心肌缺血大鼠心肌梗塞范圍的影響 結(jié)果見圖3所示，與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠心肌梗塞范圍顯著升高（P<0.01）；與I/R組比較，地奧心血康組、Y2TH組、Y2TM組、Y3TH組、Y3TM組、Y4TH組、Y4TM組均能顯著降低心肌梗塞范圍（P<0.05或P<0.01），說明地奧心血康和各給藥組均能增加缺血區(qū)供血和供氧，減小心肌梗死面積，降低心肌缺血性損害。

3.3 延齡草3個甾體皂苷對心肌缺血大鼠血清酶CK、LDH的影響 與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠在結(jié)扎后血清中CK、LDH活力明顯增強（P<0.01）；與I/R組比較，地奧心血康組、Y2TH組、Y2TM組、Y3TH組、Y3TM組、Y4TH組、Y4TM組 均能使血清中CK、LDH活性顯著降低（P<0.05或P<0.01），說明各給藥組具有抗大鼠急性心肌缺血作用。結(jié)果見表2。

表2 延齡草3個甾體皂苷對心肌缺血大鼠血清酶CK、LDH活力的影響（ ，n=8）

4 討論

在心肌缺血實驗研究中，心肌外膜損傷，使缺血區(qū)的心肌細胞過度極化與非缺血區(qū)心肌細胞形成損傷電流引起心電圖ST段抬高，而心內(nèi)膜下心肌缺血則引起T波升高，其中ST段及T波抬高超過正常范圍是心肌損傷的心電圖特征性表現(xiàn)，常用于判斷心肌缺血動物模型的建立是否成功以及評價藥物的抗心肌缺血藥效［13］。2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）是脂溶性光敏感化合物，能與正常機體組織中的脫氫酶反應(yīng)呈紅色。缺血組織內(nèi)脫氫酶的活性下降，TTC不發(fā)生反應(yīng)，缺血組織呈蒼白色［14］。因此，心肌梗死面積是反映心肌梗死程度的重要指標之一。

CK、LDH廣泛存在于心肌細胞內(nèi)，CK是一個與心肌細胞內(nèi)能量代謝有直接關(guān)系的重要生物酶，而LDH是細胞呼吸鏈上的重要生物酶。當心肌出現(xiàn)急性缺血時會造成心臟供血供氧匱乏，心肌細胞發(fā)生能量代謝障礙和細胞膜通透性增加，各種心肌酶在缺血早期便會外漏而釋放入血，它們的活性和外漏程度反映心肌缺血損傷的范圍和嚴重程度［15］。所以，血清中CK、LDH是心肌梗死、心肌缺血的特異性生化指標，既可反映心血管疾病病情的嚴重程度，也可作為患者預后評價指標并提供臨床治療依據(jù)［16］。

本研究表明，大鼠左冠脈前降支結(jié)扎后，肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段、T波均顯著升高，心肌梗塞范圍顯著增加，血清中CK、LDH活力明顯升高，提示心肌缺血造模成功。地奧心血康組，Y2T、Y3T、Y4T的高、中劑量組與模型組相比，大鼠心電圖ST段和T波的異常抬高均能顯著降低，并能顯著減少冠脈結(jié)扎所致急性心肌缺血模型大鼠心肌細胞CK、LDH的漏出，抑制血清中CK、LDH的活性，改善損傷大鼠的心肌代謝和細胞結(jié)構(gòu)破壞，降低心肌梗塞范圍，顯示重樓皂苷Ⅵ（Y2T）、偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→4）-［α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）］-β-D-吡喃葡萄糖苷（Y3T）和重樓皂苷Ⅶ（Y4T）具有抗大鼠急性心肌缺血作用。推測其可能的作用機制是擴張冠脈，改善冠脈供血供氧，減小心肌梗死面積；抑制心肌缺血導致的 ST段和T波抬高，改善心臟功能；改善心肌代謝，降低心肌氧耗，降低心肌酶學指標，減緩心肌細胞的缺血性損傷，對心肌缺血起到一定防治作用。