超聲輔助離子液體提取柚子皮總黃酮及其抗氧化研究

★ 李國(guó)峰 陳海芳 杜文迪 郭瑩帆 蔡錦洪 張武崗（.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心 南昌 0006；.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 0004 ；.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南昌 0004）

柚子（Citrus grandisL.）為藥食同源藥材，屬于蕓香科常綠喬木植物，又稱胡欒、文旦等，柚子皮資源分布極其廣泛，在我國(guó)長(zhǎng)江流域以南各省均有栽培［1］。其藥用和食用部位主要是果肉，而“柚子皮”經(jīng)常作為廢物被直接丟棄，既浪費(fèi)資源，又污染環(huán)境。近年來(lái)，大量實(shí)驗(yàn)研究證明總黃酮具有一定的藥理作用，王曉波等［2］實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，雞骨草總黃酮具有清除自由基及抑制亞硝化作用。王占一等［3］實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，石榴根皮總黃酮具有較強(qiáng)的清除亞硝酸鹽能力和抑制亞硝胺合成能力。

離子液體作為一種新型的綠色溶劑，能夠明顯的提高活性成分的提取率，而且可以循環(huán)利用，可以減少溶劑的消耗量，避免了環(huán)境的污染等優(yōu)點(diǎn)［4］。超聲波輔助離子液體提取已經(jīng)應(yīng)用于石榴籽中原花青素［5］、山楂綠原酸［6］、葛根總黃酮［7］、籽瓜果膠［8］等活性成分的分離提取中，但是采用超聲波輔助離子液體提取柚皮中總黃酮成分的研究，國(guó)內(nèi)還未見文獻(xiàn)報(bào)道。經(jīng)過(guò)前期實(shí)驗(yàn)和從經(jīng)濟(jì)成本上考慮，選擇 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體為提取溶劑。

因此本研究以柚子皮為材料，采用超聲波輔助提取柚子皮總黃酮，并測(cè)定提取、純化后的產(chǎn)物對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力，為該成分的工業(yè)化生產(chǎn)及保健品的研發(fā)提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料 新鮮的柚子購(gòu)自于福建琯溪沙田柚，蘆丁對(duì)照品（純度>98%，批號(hào)100080-201202）由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；VC對(duì)照品（純度>98 %，批號(hào)C10250787）由上海麥克林生化科技有限公司提供；離子液體由上海源葉生物科技有限公司提供；石油醚、 無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鄰二氮菲、過(guò)氧化氫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、鄰苯三酚、Tris、鹽酸等均為分析純，超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器 SHZ-DIII予華牌循壞水式真空泵 （鞏義市予華儀器制造有限責(zé)任公司）；JA5003B型電子分析天平 （上海精科儀器有限公司）；UV-2000紫外-可見分光光度計(jì) （上海尼龍柯儀器有限公司）；SB25-12DTN型超聲波清洗機(jī) （寧波新芝生物科技股份有限公司）；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；XFB-200型小型多功能粉碎機(jī) （永康市小寶電器有限公司）；TDL－40B低速臺(tái)式大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；RE52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

2 方法

2.1 柚子皮的預(yù)處理 將柚子果皮與果肉分開，留下果皮，置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中，于65 ℃條件下烘至恒重，放入干燥器中備用。取干燥后的柚子皮粉碎置于索氏提取器中，加入8倍體積的石油醚，加熱回流脫脂兩次，每次脫脂時(shí)間30 min，抽濾，除去石油醚，將得到的柚皮粉末置于在陰涼通風(fēng)處自然陰干，收集殘?jiān)b入密封袋中備用。

2.2 柚皮總黃酮提取與純化 稱取粉碎至規(guī)定粒度的經(jīng)過(guò)脫脂處理好的柚皮粉末2.0 g，置于100 mL干燥具塞錐形瓶中，加入0.2 mol/L的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體的乙醇溶液至設(shè)定料液比例。設(shè)定超聲波輸出功率，在規(guī)定的溫度下提取至設(shè)定時(shí)間后，提取液在3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，得到上清液，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上適當(dāng)濃縮后定容，作為供試品溶液。將供試液置于250 mL具塞錐形瓶中，用預(yù)處理好的AB-8大孔吸附樹脂進(jìn)行搖床吸附 40 min（300 r/min，25 ℃），抽濾，得到含藥樹脂。含藥樹脂用75 %乙醇超聲處理后，抽濾，濾液減壓濃縮，最后用超純水定容至100 mL容量瓶中，用于后續(xù)的抗氧化實(shí)驗(yàn)。

2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品20.0 mg，置于100 mL容量瓶，加30 %乙醇適量使其溶解，放冷，定容，搖勻，即得對(duì)照品溶液（0.20 mg/mL）。精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL 于 25 mL 容量瓶中。各加入 5 % 亞硝酸鈉溶液 1.00 mL，搖勻，放置 6 min。加入 10 %硝酸鋁溶液 1.00 mL，搖勻，放置 6 min。加入 4 %氫氧化鈉6 mL，用30 %乙醇定容，搖勻，放置15 min。以30 %乙醇同法制備空白對(duì)照，在510 nm處用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，重復(fù)3次取平均值，以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

2.4 柚皮總黃酮含有量測(cè)定 將純化后的提取液用超純水定容100 mL容量瓶中，作為供試品試液。按照2.3的方法，測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程得出柚皮黃酮的濃度，計(jì)算，即得。公式如下：

式中w為柚皮黃酮得率（%），c為測(cè)定黃酮的濃度（mg/mL），V為供試液的體積（mL），n為稀釋倍數(shù)，M為柚皮的質(zhì)量（g）。

2.5 工藝優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)中，考察料液比（A，1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24） 、超聲功率（B，100、150、200、250、300 W） 、超聲時(shí)間（C，20、30、40、50、60 min）對(duì)總黃酮提取率的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，采用三因素三水平的正交試驗(yàn)法，不考慮各因素間的相互影響，對(duì)柚子皮總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，因素-水平表見表1

表1 因素水平表

2.6 柚皮總黃酮體外抗氧化活性

2.6.1 樣品溶液的配制 以純化的柚皮黃酮提取液為樣品，測(cè)定提取液中總黃酮的濃度。以VC為對(duì)照品，配制成與提取液總黃酮的濃度相同的對(duì)照品溶液，然后依次倍數(shù)稀釋成五個(gè)樣品液，用于后續(xù)的體外抗氧化試驗(yàn)。

2.6.2 柚皮總黃酮對(duì)·O2-自由基清除力的測(cè)定 參考文獻(xiàn)［9-10］方法。精密吸取5.0 mL配制好的Tris-HCl緩沖液（pH值8.2）于10 mL具塞刻度試管中，滴加對(duì)應(yīng)濃度的待測(cè)供試液，用超純水補(bǔ)至 9.7 mL，于 25 ℃的恒溫水浴鍋中保溫 20 min，取出后加入同溫水浴中預(yù)熱后的3mmol/L鄰苯三酚試液0.3 mL。立刻混勻，倒入比色皿中，以10 mmol/L HCl溶液作為空白對(duì)照，在325 nm波長(zhǎng)下以30 s為一區(qū)間測(cè)吸光度A，一共測(cè)定4 min，繪制吸光度A與作用時(shí)間t相關(guān)聯(lián)的線性圖，所得的關(guān)聯(lián)圖中縱橫坐標(biāo)比值即為樣品的自氧化速率ΔA1/Δt。用超純水代替樣品液，所得的關(guān)聯(lián)圖中縱橫坐標(biāo)比值即為鄰苯三酚的自氧化速率ΔA2/Δt，以VC作為對(duì)照。

按照下列公式計(jì)算清除率。

式3-1中：D1%為羥基自由基清除率；ΔA1/Δt為加入藥品后的鄰苯三酚自氧化速率；ΔA2/Δt為鄰苯三酚自氧化速率；ΔA為差的平均值。

2.6.3 柚皮總黃酮對(duì)·OH自由基清除率的測(cè)定 參考文獻(xiàn)［11-12］方法。精密吸取1.0 mL的0.75 mmol/L鄰二氮菲試液于10 mL具塞刻度試管中，然后分別加入0.2 mol/L磷酸緩沖溶液（pH值7.4）1.0 mL 和超純水 1.0 mL，立即混勻，在吸取 1.0 mL的 0.75 mmol/L 的 FeSO4，搖勻后加入 3%H2O2分別1.0 mL啟動(dòng)反應(yīng)，輕輕振搖使混勻，再將混合溶液在 37 ℃水浴溫?zé)?60 min，于波長(zhǎng) 511 nm 處測(cè)定吸光度AB。將H2O2代替樣品溶液1.0 mL，按照上述過(guò)程測(cè)定AS。將等同體積的樣品液代替超純水，按照上述流程測(cè)定AP。以VC作為對(duì)照，各組試驗(yàn)平行3次， 以蒸餾水為空白，然后在536 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定各個(gè)試管中混合溶液的吸光度，按照下列公式計(jì)算清除率

式3-3中：D2%為羥基自由基清除率；AP為樣品液所測(cè)吸光度；AB為不加樣品所測(cè)吸光度；AS為不加H2O2所測(cè)吸光度。

3 結(jié)果

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 以蘆丁的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程為Y=10.484X-0.0042，R2=0.999 7。 在 蘆 丁 濃 度 在0.016～0.08 mg/mL的范圍內(nèi)，蘆丁濃度與吸光度呈良好的線性相關(guān)。

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 超聲功率對(duì)總黃酮提取率的影響 結(jié)果見圖1，隨著超聲功率的增大，柚皮黃酮得率也隨之增大，當(dāng)超聲功率超過(guò)200 W后，柚皮黃酮得率隨超聲功率增加變化并不明顯，從節(jié)約能源角度考慮，確定超聲功率為200 W。

圖1 超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響

3.2.2 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響 結(jié)果見圖2，在20～40 min提取時(shí)間范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，柚皮總黃酮含量逐漸增加，40 min時(shí)，達(dá)到峰值，超過(guò)40 min時(shí)，柚皮總黃酮含量略微下降。提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都會(huì)影響柚皮總黃酮的含量，提取時(shí)間過(guò)短，總黃酮溶出的不充分，提取時(shí)間延長(zhǎng)，總黃酮含量略有降低。因此，綜合考慮能源和時(shí)間成本，選擇超聲提取時(shí)間為40 min。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

3.2.3 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響 結(jié)果見圖3，當(dāng)料液比增加時(shí)，柚皮總黃酮的含量明顯升高，當(dāng)料液比1∶16（g/mL）時(shí)，柚皮總黃酮含量最高，再持續(xù)增加溶劑量不會(huì)持續(xù)增加柚皮總黃酮得率反而會(huì)降低。料液比越小，溶劑不足，無(wú)法完全提取出總黃酮，料液比越大，溶劑用量越大，在后續(xù)濃縮處理中會(huì)有部分損失，而且成本也會(huì)增加。從試驗(yàn)工藝和經(jīng)濟(jì)成本考慮，因此選擇料液比為1∶20（g/mL）。

圖3 料液比對(duì)總黃酮提取的影響

3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果見表2。表2直觀分析可以知，料液比對(duì)柚皮總黃酮含量的影響最大。極差R的大小順序?yàn)锳>B>C，即影響柚皮總黃酮提取率各因素中的主次關(guān)系依次是料液比>超聲功率>超聲時(shí)間。柚皮粗黃酮的最佳提取工藝條件為 A3B2C3。即料液比 1∶20，超聲功率 200 W，超聲時(shí)間50min。

表2 正交試驗(yàn)表

3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按照優(yōu)選出來(lái)的工藝進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，提取率分別為 1.18 %、1.12 %、1.15 %，平均值為1.16 %。結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行。

3.5 柚皮總黃酮體外抗氧化活性結(jié)果

3.5.1 柚皮總黃酮對(duì).O2-自由基清除的測(cè)定 結(jié)果見圖4，柚皮黃酮和VC對(duì)·O2-有一定的清除作用，并且清除率隨供試液質(zhì)量濃度的提高逐漸增加。當(dāng)柚皮黃酮質(zhì)量濃度在0～0.5 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，其清除率水平與VC幾乎相近；大于此值后，VC對(duì)·O2-的清除率明顯大于柚皮黃酮的清除率。在質(zhì)量濃度為0.5～2.5 μg/mL時(shí)，VC對(duì)·O2-的清除率為52.2 %，柚皮黃酮對(duì)·O2-的清除率為41.4 %，說(shuō)明柚皮黃酮對(duì)·O2-有一定的清除作用，但其清除效果低于同濃度的VC。

圖4 總黃酮和VC對(duì).O2-自由基的清除作用

3.5.2 柚皮總黃酮對(duì)·OH自由基清除的測(cè)定 結(jié)果見圖5，柚皮黃酮和VC對(duì)·OH均有一定的清除作用，并且清除率隨柚皮黃酮和VC濃度的升高而逐漸上升。在質(zhì)量濃度為0～1 μg/mL時(shí)，柚皮黃酮和VC對(duì)·OH清除率隨柚皮總黃酮和VC濃度的增加上升明顯；在質(zhì)量濃度為1～2.5 μg/mL時(shí)，VC對(duì)·OH的清除率為68.8 %，柚皮黃酮對(duì)·OH的清除率為43.8 %，說(shuō)明柚皮黃酮對(duì)·OH有一定的清除作用，但其清除效果低于同濃度的VC。

圖5 總黃酮和VC對(duì)·OH自由基的清除作用

4 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)應(yīng)用超聲輔助離子液體提取柚子皮總黃酮，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選擇料液比、超聲時(shí)間、超聲功率作為影響因素，發(fā)現(xiàn)三者對(duì)總黃酮提取率的影響程度依次為料液比>超聲功率>超聲時(shí)間，所得最優(yōu)工藝下總黃酮穩(wěn)定可行。再對(duì)該成分進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)在 0.5～2.5 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi) 其對(duì)羥自由基、超氧陰離子均具有較強(qiáng)的清除能力，并呈一定量效關(guān)系。由于體內(nèi)自由基的積累與疾病關(guān)系密切，如癌癥、骨質(zhì)疏松等，因此應(yīng)繼續(xù)研究柚皮中具有抗氧化作用的總黃酮的提取純化工藝和其清除體內(nèi)自由基的相關(guān)機(jī)制，可為該成分提取和抗氧化活性物質(zhì)開發(fā)提供理論依據(jù)。