左旋含羞草堿下調(diào)Bcl-2的表達并促進FaDu細胞凋亡的研究

向銀洲 李雪軍 鄒玉華 陳恩耀 徐征 李建萍

下咽癌多發(fā)生于下咽區(qū)域的梨狀窩、環(huán)狀軟骨后區(qū)和下咽后壁等處，其中約95%屬于鱗狀細胞癌[1]，約占頭頸部鱗狀細胞癌的3%～5%[2]。預(yù)后較差[3]。研究發(fā)現(xiàn)左旋含羞草堿能夠抑制多種腫瘤細胞的生長增殖，促進腫瘤細胞的凋亡，其作用機制尚未明了[4,5]。本次研究旨在觀察鐵對左旋含羞草堿誘導(dǎo)人下咽鱗狀細胞癌FaDu細胞凋亡的影響，以及Bcl-2 家族蛋白在凋亡過程中的變化，為下咽癌的防治提供一定的實驗依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 選擇武漢大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科研究所2018年4月至2019年1月期間的人咽鱗狀細胞癌FaDu細胞株（由武漢大學(xué)耳鼻咽喉頭頸外科研究所提供）。FaDu細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基（由美國Sigma 公司生產(chǎn)），放置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2 細胞的形態(tài)學(xué)觀察 人咽鱗狀細胞癌FaDu 細胞均勻加入到6 孔板中，添加適量RPMI-1640培養(yǎng)液，在5%CO2、37 ℃、飽和濕度條件下的恒溫培養(yǎng)箱中孵育過夜，細胞貼壁后，加入終濃度為0 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L 的左旋含羞草堿（由美國Sigma 公司生產(chǎn)）培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h 后，取出放在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀況。

1.3 流式細胞儀檢測FaDu 細胞的凋亡 選擇枸櫞酸鐵銨（ferric ammonii citras，F(xiàn)AC）（由武漢友名生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）實驗濃度分別為0 μmol/L、100 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L，分別加入FaDu細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后收集細胞。-20 ℃預(yù)冷70%酒精固定細胞30 min，4 ℃冰箱冷藏過夜。次日取出細胞，倒去酒精，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）（由吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司生產(chǎn)）洗滌細胞3次，100 μmol/L 的RNA 酶（由美國Sigma 公司生產(chǎn)）200 μl 消化細胞，37 ℃恒溫水浴箱水浴30 min，滴加20 μmol/L碘化丙啶（由Sigma公司生產(chǎn)）1 ml，4 ℃冰箱并遮光染色30 min，流式細胞儀檢測不同濃度FAC 對FaDu 細胞凋亡的影響。另一組實驗將FaDu 細胞分為左旋含羞草堿200 μmol/L組、FAC 50 μmol/L組、FAC 100 μmol/L組、左旋含羞草堿200 μmol/L+FAC 50 μmol/L 組、左旋含羞草堿200 μmol/L +FAC100 μmol/L組。同法處理細胞后流式細胞儀檢測FAC 聯(lián)合左旋含羞草堿對FaDu 細胞凋亡的影響。以上實驗每組設(shè)3 個復(fù)孔，以0.9%氯化鈉注射液作為對照組，實驗重復(fù)3次。

1.4 CCK-8 檢測FaDu 細胞活性 FaDu 細胞接種于96 孔板，放置到含5% CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗分為左旋含羞草堿200 μmol/L組、FAC 50 μmol/L 組、FAC 100 μmol/L 組、左旋含羞草堿200 μmol/L+FAC 50 μmol/L 組、左旋含羞草堿200 μmol/L +FAC100 μmol/L組，并設(shè)置陰性對照孔為對照組，每種濃度均設(shè)3個復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h 時取出培養(yǎng)板加入CCK8 試劑（由江蘇碧云天生物技術(shù)公司生產(chǎn)）10 μl 繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測450 nm處OD值，每次實驗重復(fù)3次。

1.5 Western-blot 法檢測Bcl-2、Bax 等凋亡相關(guān)蛋白的表達 將FaDu細胞接種于100 ml 培養(yǎng)瓶內(nèi)，放置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，見細胞貼壁生長，加入左旋含羞草堿，終濃度分別為0 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞，離心5 min，倒去上清液，PBS 液洗滌3次，分別轉(zhuǎn)移到1.5 ml Ep 管中，100 μl蛋白質(zhì)裂解液Buffer（由Sigma 公司生產(chǎn)）處理細胞，-20℃冰箱保存待測。次日用10% SDS-PAGE處理細胞樣品，SDS 聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，4 ℃冰箱封閉過夜。次日取出硝酸纖維素膜放進含一抗抗體（Bcl-2 兔抗人單克隆抗體、Bax 兔抗人單克隆抗體、Bak 兔抗人單克隆抗體等由上?？泼羯锕旧a(chǎn)）的封閉液中，4 ℃冰箱孵育過夜。次日取出膜電轉(zhuǎn)液洗滌3次，每次10 min。將膜放入含二抗抗體的封閉液中，室溫下孵育2 h，電轉(zhuǎn)液洗滌3次，每次10 min。最后將膜放在保鮮膜上，電化學(xué)發(fā)光法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Bak、Bik、Bid的表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0 版軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示。計量資料比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學(xué)的影響 常規(guī)培養(yǎng)24 h、48 h 后，倒置顯微鏡下觀察正常培養(yǎng)的FaDu細胞，見細胞貼壁生長，連接緊密，密集成片生長，輪廓欠清，透明度大，折光性強，大小均勻。經(jīng)不同濃度左旋含羞草堿作用后，可見細胞相互離散，細胞皺縮，體積變小，間隙增寬，細胞固縮深染，折光性減弱，細胞數(shù)目明顯減少。隨著左旋含羞草濃度的增加和作用時間延長，培養(yǎng)液中懸浮細胞增多，貼壁生長的細胞減少，培養(yǎng)液變渾濁。

2.2 FAC對FaDu細胞的凋亡的影響見表1

表1 FAC對FaDu細胞凋亡的影響/%

由表1 可見，不同濃度FAC 對FaDu 細胞凋亡有顯著性差異（F=6.54，P＜0.05）。FaDu 細胞在FAC 100 μmol/L 作用下，其凋亡率低于FAC 0 μmol/L組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.25，P＜0.05），F(xiàn)AC 500 μmol/L、FAC 1000 μmol/L 作用下的FaDu 細胞的凋亡率則高于FAC 0 μmol/L，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別=3.63、3.97，P均＜0.05）。

2.3 左旋含羞草堿聯(lián)合FAC 對FaDu 細胞凋亡的影響見表2

由表2 可見，不同濃度左旋含羞草堿聯(lián)合FAC對FaDu 細胞凋亡有顯著性差異（F=5.78，P＜0.05），左旋含羞草堿200 μmol/L 組FaDu 細胞凋亡最顯著。左旋含羞草堿200 μmol/L+FAC 50 μmol/L 組和左旋含羞草堿200 μmol/L +FAC 100 μmol/L 組與對照組比較，細胞凋亡率無統(tǒng)計學(xué)意義（t分別=2.64、2.13，P均＞0.05），F(xiàn)AC 50 μ mol/L 組和FAC 100 μmol/L組FaDu細胞凋亡率均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別=3.61、3.98，P均＜0.05）。

表2 左旋含羞草堿聯(lián)合FAC對FaDu細胞凋亡的影響/%

2.4 左旋含羞草堿聯(lián)合FAC 對FaDu 細胞增殖活性的影響見表3

表3 左旋含羞草堿聯(lián)合FAC對FaDu細胞活性的影響

由表3 可見，左旋含羞草堿200 μmol/L 對FaDu細胞生長增殖活性的抑制作用最顯著，然后由強到弱依次為左旋含羞草堿200 μmol/L +FAC 50 μmol/L、左旋含羞草堿200μmol/L+FAC 100μmol/L。

2.5 左旋含羞草堿對FaDu 細胞Bcl-2、Bax 等凋亡相關(guān)蛋白表達的影響見圖1

由圖1 可見，隨著左旋含羞草堿濃度的增加，Bcl-2 蛋白家族中具有抑制凋亡作用的Bcl-2 蛋白的表達顯著降低，促進凋亡作用的Bax、Bak、Bik、Bid等蛋白的表達明顯增強。

3 討論

圖1 不同濃度左旋含羞草堿對FaDu細胞Bax、Bik、Bid、Bak、Bcl-2蛋白表達的影響

鐵元素是細胞生存的關(guān)鍵元素，鐵作為輔助因子參與多種氧化還原酶的分子特性也賦予其損傷細胞的能力。不恰當(dāng)?shù)臏翳F催化產(chǎn)生高度有毒的活性氧物質(zhì)羥基自由基等，過量的自由基可通過DNA 氧化、線粒體損傷、膜脂過氧化等刺激細胞凋亡和基因突變。鐵螯合劑通過螯合細胞內(nèi)鐵影響了癌細胞生物學(xué)行為，抑制了核糖核苷酸還原酶活性，進而影響脫氧核糖核酸的合成和修復(fù)，抑制腫瘤細胞的生長。

本次實驗結(jié)果顯示，左旋含羞草堿能夠顯著抑制FaDu 細胞的生長，表現(xiàn)在與正常培養(yǎng)的FaDu 細胞相比，左旋含羞草堿作用下的FaDu細胞生長狀況差，折光性變?nèi)酰喞鰪?，胞漿中常出現(xiàn)空泡，部分貼壁細胞收縮變圓，甚至從瓶壁脫落，證明左旋含羞草堿對人咽鱗狀細胞癌FaDu 細胞生長有明顯的抑制作用。

有研究表明，左旋含羞草堿是一種鐵螯合劑，可以螯合細胞內(nèi)的二價鐵離子[6]。本次實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)aDu 細胞在FAC 100 μmol/L 作用下，細胞的凋亡率低于FAC 0 μmol/L；FAC 500 μmol/L、FAC 1 000 μmol/L 作用下，F(xiàn)aDu 細胞的凋亡率則高于FAC 0 μmol/L（P均＜0.05），表明一定量的FAC 對FaDu 細胞的凋亡具有抑制作用，缺鐵或鐵過量對細胞凋亡具有促進作用。左旋含羞草堿能夠促進FaDu 細胞的凋亡，加入適量的FAC 后，左旋含羞草堿促進FaDu 細胞凋亡的作用近乎消失，與江哲珍等[6]研究結(jié)果相似。CCK-8 法實驗結(jié)果顯示，左旋含羞草堿單獨作用于FaDu 細胞，其抑制細胞生長作用顯著，加入一定量的FAC 后，其抑制FaDu 細胞生長的作用明顯減弱。表明左旋含羞草堿誘導(dǎo)FaDu 細胞凋亡的作用與其鐵螯合作用密切相關(guān)，與Panopoulos等[7]的研究結(jié)果基本一致。

目前關(guān)于細胞凋亡途徑主要有三條，即死亡受體通路[8]、線粒體通路[9]和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路[10]。線粒體凋亡途徑是最重要的凋亡途徑之一，而線粒體內(nèi)膜和外膜的通透性又主要由Bcl-2 家族蛋白控制，因此Bcl-2 家族蛋白是線粒體凋亡途徑的主要調(diào)控者[11]。本次實驗結(jié)果顯示，隨著左旋含羞草堿干預(yù)濃度的升高，F(xiàn)aDu 細胞中Bcl-2 蛋白家族中具有抑制凋亡作用的Bcl-2 蛋白的表達降低，而具有促進凋亡作用的Bax、Bak、Bik、Bid 等蛋白的表達增強，說明左旋含羞草堿促進FaDu細胞凋亡，主要是通過Bcl-2家族蛋白介導(dǎo)的線粒體通路實現(xiàn)的[12]。

綜上所述，左旋含羞草堿可能通過干擾人咽鱗狀細胞癌FaDu 細胞的鐵代謝，激活Bcl-2 家族蛋白發(fā)揮著重要調(diào)控作用的線粒體通路，引起細胞色素C 和凋亡誘導(dǎo)因子的釋放，影響癌細胞生物學(xué)行為，最終促進了癌細胞凋亡，為中醫(yī)藥治療咽鱗狀細胞癌提供了重要的依據(jù)，其具體的抗腫瘤機制有待進一步研究。另外，本次實驗有關(guān)左旋含羞草堿對Fa-Du 細胞活性氧物質(zhì)、血管生成等方面的影響未進行研究，還需要進行這些方面的研究。