雙酶法水解羅非魚下腳料制備降血糖肽的工藝研究

趙 闊，羅 山，王 濤，陳 艷，梁愛文，鄒 易，鄭聯(lián)合

（海南省糧油科學(xué)研究所，海南 瓊海571400）

糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）是一種由于胰島素生物作用受損或分泌不足而引起血液中葡萄糖水平慢性增高的代謝疾病，持續(xù)的高血糖和長(zhǎng)期代謝紊亂，會(huì)引起腎臟、眼睛、足部、神經(jīng)、心血管及其他組織器官受損，嚴(yán)重時(shí)容易引發(fā)酮癥酸中毒、高血糖高滲性昏迷等急性并發(fā)癥。近年來，由于生活水平不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)改變，生活節(jié)奏加快，精神壓力增大，同時(shí)機(jī)械化、智能化的發(fā)展，使得人類勞動(dòng)強(qiáng)度不斷降低，全球糖尿病發(fā)病率增長(zhǎng)迅速，且發(fā)病人群也逐漸趨于年輕化[1-3]。最新數(shù)據(jù)顯示，我國是全球糖尿病患者人數(shù)最多的國家，患者約1.14億人，約占全球糖尿病人總數(shù)的33%[4]。糖尿病目前沒有根治方法，最有效的方式是靠飲食、運(yùn)動(dòng)和藥物聯(lián)合控制血糖水平，應(yīng)用最普遍、藥效最明顯的主要是胰島素、磺酰脲類和雙胍類降糖藥物，但存在一定副作用[5]。

中醫(yī)學(xué)將糖尿病歸屬“消渴病”范疇，歷代醫(yī)著中記載了許多治療消渴病的良藥，我國民間也一直流傳著苦瓜、南瓜、洋蔥、玉米須等食療偏方。近代天然產(chǎn)物及中醫(yī)藥學(xué)的深入研究，揭示了許多中草藥、食品中具有降血糖功效的成分及降糖機(jī)理，按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為多糖類、黃酮類、生物堿類、皂苷類、萜類、共軛亞油酸、多肽類等。降血糖肽是一類能夠降低血糖的多肽活性物質(zhì)，來源于食物蛋白，安全性高、無毒副作用，適合長(zhǎng)期服用，除此之外，降血糖肽本身是一種多肽，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。因此，降血糖肽無論在功能性食品還是在醫(yī)藥產(chǎn)品開發(fā)方面都具有廣泛的應(yīng)用前景[6-8]。

羅非魚（Tilapia）也稱福壽魚、非洲鯽魚，肉質(zhì)厚、白潔無刺、味道鮮美，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織極力推薦養(yǎng)殖的優(yōu)良魚種，現(xiàn)已成為世界性的養(yǎng)殖魚類，養(yǎng)殖范圍覆蓋100多個(gè)國家和地區(qū)，年產(chǎn)量超過300萬t。近10年來我國的羅非魚產(chǎn)量以平均每年9%左右的速度遞增，居世界第1位?！吨袊鴿O業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒2019》數(shù)據(jù)顯示，2018年我國羅非魚淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量為162.5萬t，同比2017年的158.5萬t增長(zhǎng)4萬t，是我國水產(chǎn)加工量最多的魚種[9]。羅非魚加工主要制成魚排、魚片、魚條等，魚頭、尾、鰭、鱗、皮、內(nèi)臟、殘肉等淪為下腳料，總質(zhì)量約占整條魚的60%[10-11]，目前僅有部分被加工成魚粉添加到飼料中，大部分被丟棄，造成蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi)。筆者曾以羅非魚下腳料為原料制備過降血壓肽[12]，試驗(yàn)開展雙酶法水解羅非魚下腳料制備降血糖肽的工藝研究，以期為羅非魚下腳料的高值化綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

羅非魚下腳料：新鮮羅非魚洗凈后剔除魚肉，剩余物于-20℃下凍存，試驗(yàn)時(shí)在4℃下解凍。

α-葡萄糖苷酶、對(duì)硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），美國Sigma公司提供；堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司提供；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

S-D200型高效組織搗碎機(jī)，上海模具廠產(chǎn)品；UV-8000s型紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；Sigma 3-30k型高速冷凍離心機(jī)，上海譽(yù)鑫科技有限公司產(chǎn)品；HDK-6型數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋，常州德科儀器制造有限公司產(chǎn)品；RG-18型磁力攪拌器，上?，斈醿x器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；QDN-ll型全自動(dòng)凱氏定氮儀，杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；PB-10型pH計(jì)，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SB5200DTD型超聲波清洗機(jī)，寧波新藝生物科技有限公司產(chǎn)品；AY220型電子天平，日本島津產(chǎn)品；UPN-11-10T型超純水制造系統(tǒng)，四川優(yōu)普超純科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 羅非魚下腳料酶解

將羅非魚下腳料剪成小塊，加入蒸餾水調(diào)節(jié)底物濃度，用高速組織搗碎機(jī)絞碎，調(diào)節(jié)所需pH值，在設(shè)定溫度下加入蛋白酶水解一定時(shí)間，沸水浴滅活10 min，冷卻后離心10 min，離心機(jī)轉(zhuǎn)速3 500 r/min，中間部分的澄清液即為羅非魚水解液。

1.3.2 雙酶復(fù)合水解方案確定[13-14]

選取5種常用蛋白酶（堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶），結(jié)合廠家提供的最適酶解條件，分別對(duì)羅非魚下腳料進(jìn)行水解，比較5種蛋白酶水解液的水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率，篩選出堿性蛋白酶和胰蛋白酶作為合適用酶。將篩選出的蛋白酶復(fù)合，復(fù)合方案包括雙酶同步水解和雙酶分步水解，具體實(shí)施方案見表1，比較各方案水解液的水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率，確定雙酶水解方案。

雙酶復(fù)合水解羅非魚下腳料方案見表1。

表1 雙酶復(fù)合水解羅非魚下腳料方案

1.3.3 雙酶水解工藝優(yōu)化

根據(jù)雙酶復(fù)合水解方案，首先優(yōu)化堿性蛋白酶的水解工藝參數(shù)，再以堿性蛋白酶水解產(chǎn)物為底物進(jìn)行胰蛋白酶水解工藝優(yōu)化。堿性蛋白酶和胰蛋白酶水解工藝優(yōu)化均在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3.4 水解度測(cè)定方法

水解度（DH）指蛋白質(zhì)分子發(fā)生水解反應(yīng)后斷裂的肽鍵占蛋白質(zhì)分子中總肽鍵的比例，反映蛋白質(zhì)的水解程度。

（1）氨基酸態(tài)氮（AAN）含量的測(cè)定（參照GB 5009.235—2016中比色法）。

（2）總氮含量的測(cè)定（參照GB 5009.5—2016中凱氏定氮法）。

1.3.5 α-葡萄糖苷酶抑制率測(cè)定方法[15-17]

取2 mg/mL蛋白酶水解液100μL，加入0.16 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液50μL，于37℃下水浴10 min后，加入2.5 mmol/L的底物PNPG（對(duì)硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷）溶液50μL，在37℃下水浴15 min，隨后立即加入1 mol/L的Na2CO3溶液100μL終止反應(yīng)，測(cè)定波長(zhǎng)405 nm處的吸光度A1，另取100μL磷酸鹽緩沖溶液代替酶解液，測(cè)定其吸光度A0，再測(cè)定只有酶解液反應(yīng)體系的吸光度A2，按下式計(jì)算抑制率：

2 結(jié)果與分析

2.1 雙酶復(fù)合水解方案確定

根據(jù)蛋白酶篩選結(jié)果，將堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合后水解羅非魚下腳料，以水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo)比較各方案水解效果。

雙酶水解羅非魚下腳料效果見圖1。

圖1 雙酶水解羅非魚下腳料效果

由圖1可見，在6種水解方案中，雙酶水解（方案1-4）效果優(yōu)于單酶水解（方案5、6），且差異顯著（p<0.05），分析原因可能是雙酶復(fù)合作用，改善了單一蛋白酶的專一性，作用位點(diǎn)增多加速了羅非魚下腳料的水解，產(chǎn)生了更多的具有降血糖活性的物質(zhì)。方案1-4中，雙酶分步水解（方案3、4）效果優(yōu)于同步水解（方案1、2），可能是因?yàn)?種酶的最適條件不同，同步水解方案試驗(yàn)條件難以將蛋白酶的活性全部發(fā)揮出來，而雙酶分步水解雖然操作起來稍微麻煩一點(diǎn)，但是能確保2種蛋白酶均在最適條件下進(jìn)行水解，從而提高了水解度和產(chǎn)物α-葡萄糖苷酶抑制率。雙酶分步水解（方案3、4）中，方案3水解效果優(yōu)于方案4，分析原因可能是堿性蛋白酶的水解能力強(qiáng)于胰蛋白酶，因此第一步水解用堿性蛋白酶水解先破壞羅非魚下腳料中蛋白質(zhì)的組織機(jī)構(gòu)，第二步用胰蛋白酶進(jìn)一步水解，產(chǎn)生更多具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的物質(zhì)。由此確定，方案3為最優(yōu)方案。

2.2 雙酶水解工藝參數(shù)優(yōu)化

雙酶水解采用分步水解方式，第一步，堿性蛋白酶水解；第二步，胰蛋白酶水解。其中，堿性蛋白酶水解工藝優(yōu)化，以溫度、加酶量、pH值和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為影響因素，以水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，最終確定堿性蛋白酶水解羅非魚加工下腳料的最佳工藝參數(shù)為溫度50℃，加酶量10 000 U/g，pH值9.5，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，此工藝條件下羅非魚下腳料水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率分別為28.19%和30.12%。

胰蛋白酶水解工藝，單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，胰蛋白酶水解的最佳溫度為35℃，最佳加酶量為10 000 U/g，最佳水解時(shí)間為1.5 h，最佳pH值為8，在此基礎(chǔ)上，以溫度、加酶量、時(shí)間和pH值為影響因素，以水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，開展L16（45）正交試驗(yàn)。

胰蛋白酶水解正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，胰蛋白酶水解正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表3。

表2 胰蛋白酶水解正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 胰蛋白酶水解正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

由表2可知，影響水解度的因素主次順序?yàn)锳>D>B>C，最優(yōu)組合為A3B2C2D3，而影響抑制率的因素主次順序?yàn)镃>A>B>D，最優(yōu)組合為A3B2C3D2。2個(gè)組合的差別在于因素C（時(shí)間）、因素D（pH值）各自是取水平二還是水平三。根據(jù)方差分析結(jié)果（表3），因素C（時(shí)間）對(duì)抑制率有顯著影響，因素A（溫度）對(duì)水解度影響顯著，因素D對(duì)水解度和抑制率影響均無顯著影響，因此將反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化為100 min，將pH值優(yōu)化為8.0，優(yōu)化后的蛋白酶水解工藝組合為A3B2C3D2，即溫度37℃，加酶量10 000 U/g，時(shí)間100 min，pH值8。在最適組合條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，羅非魚下腳料水解度、抑制率分別為48.26%和41.46%，與單酶（堿性蛋白酶）水解相比，水解度提高了20.07%，α-葡萄糖苷酶抑制率提高了11.34%。

3 結(jié)論

堿性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶水解羅非魚下腳料的最佳方案是分步水解，水解順序?yàn)閴A性蛋白酶、胰蛋白酶，優(yōu)化后的水解工藝為先在堿性蛋白酶在溫度50℃，加酶量10 000 U/g，pH值9.5、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%條件下水解；再在胰蛋白酶在溫度37℃，加酶量10 000 U/g，pH值8條件下水解100 min。此工藝參數(shù)下羅非魚下腳料水解度、水解產(chǎn)物的α-葡萄糖苷酶抑制率分別為48.26%和41.46%，與單酶（堿性蛋白酶）水解相比，水解度提高了20.07%，α-葡萄糖苷酶抑制率提高了11.34%。