lncRNA LINC02418通過(guò)調(diào)控miR-940表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

方 燕,陳建歐,鄭旭旭

方燕,陳建歐,鄭旭旭,溫州市中醫(yī)院病理科 浙江省溫州市 325000

0 引言

肝癌治療困難,易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1],其發(fā)生發(fā)展與癌基因或抑癌基因的異常表達(dá)密切相關(guān)[2],探討肝癌患者體內(nèi)異常表達(dá)的基因及其對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的影響對(duì)于肝癌治療靶點(diǎn)的尋找具有重要意義.長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)是兩類參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等生命過(guò)程的非編碼RNA,且兩者可靶向結(jié)合,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3-5].LINC02418是一種lncRNA,在非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和結(jié)直腸癌等腫瘤中表達(dá)上調(diào),下調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤的發(fā)展進(jìn)程[6-8].但目前,LINC02418在肝癌中的表達(dá)及其作用還未知.LncBase Predicted v.2生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示,miR-940可能是LINC02418的靶基因.miR-940在肝癌中表達(dá)下調(diào),上調(diào)miR-940表達(dá)可降低體外肝癌細(xì)胞的活力和侵襲性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)[9].因此,本研究首先檢測(cè)了肝癌組織中LINC02418和miR-940表達(dá),并以肝癌細(xì)胞HCCLM3為研究對(duì)象,觀察了下調(diào)LINC02418能否靶向調(diào)控miR-940影響HCCLM3細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡,以期為肝癌的靶向分子治療提供新靶點(diǎn).

1 材料和方法

1.1 材料 選取2017-01/2018-04于本院手術(shù)切除的25例肝癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織,液氮中保存.其中男性16例,女性9例,平均年齡56.38歲±5.79歲.參照2010年國(guó)際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ期和Ⅱ期共13例,Ⅲ和Ⅳ期共12例;低分化9例,中分化10例,高分化6例; 14例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,11例未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移.納入標(biāo)準(zhǔn):首次確診; 經(jīng)病理確診均為肝細(xì)胞癌; 所有患者術(shù)前未行放療和化療等治療.排除標(biāo)準(zhǔn):合并其他惡性腫瘤患者; 合并心臟、腎臟等重要臟器功能障礙者; 合并高血壓、糖尿病等慢性疾病患者.本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意,患者自愿簽署知情同意書(shū).

細(xì)胞和試劑:肝癌細(xì)胞系HCCLM3,中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù); RPMI 1640培養(yǎng)基、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒和膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒,北京索萊寶公司; 胎牛血清(FBS),杭州四季青公司; LipofectamineTM2000試劑盒、Trizol試劑,美國(guó)Invitrogen公司; PCR引物、LINC02418小干擾RNA(si-LINC02418)、亂序無(wú)意義陰性序列(si-NC)、miR-940模擬物(mimcs)、模擬對(duì)照序列(miR-NC)、LINC02418過(guò)表達(dá)載體(pcDNA-LINC02418)、空載體(pcDNA)、miR-940抑制劑(anti-miR-940)及抑制劑陰性對(duì)照序列(antimiR-NC),上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒,大連寶生物工程公司; 兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A(p21)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)和B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bax)抗體,美國(guó)Abcam公司; 雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒,美國(guó)Promega公司.

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量P C R(RT-q P C R)檢測(cè)組織中LINC02418和miR-940表達(dá):Trizol試劑提取組織中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,行PCR擴(kuò)增.引物序列LINC02418上游5’-TGTCAGGGATAGGGTGGAGA-3’,下游5’-GGTGGTTACTCTTCT GGCCT-3’; GAPDH上游5’-ACATCGCTCAGACACCATGG-3’,下游5’-GTAGTTGAGGTCAA TGAAGGG-3’; miR-940上游5’-TGCGCAAGCTGCCAACGCG-3’,下游5’-CGCGCTGAATA GAAGCTAGTGT-3’; U6上游5’-CGCGTTGTGAACGACGTG-3’,下游5’-CGGTGTAAGCTAG CTGATCGCCC-3’.2－△△Ct法計(jì)算LINC02418相對(duì)于GAPDH、miR-940相對(duì)于U6的表達(dá)水平.

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HCCLM3細(xì)胞.取對(duì)數(shù)增殖期的HCCLM3細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中,用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法,分別轉(zhuǎn)染s i-N C(s i-N C組)、s i-LINC02418(si-LINC02418組)、pcDNA(pcDNA組)、pcDNA-LINC02418(pcDNA-LINC02418組)、miR-940 mimcs(miR-940組)、miR-NC(miR-NC組)、共轉(zhuǎn)染si-LINC02418與anti-miR-940(si-LINC02418+antimiR-940組)、si-LINC02418與anti-miR-NC(si-LINC02418+anti-miR-NC組).轉(zhuǎn)染12 h后,更換培養(yǎng)基.再培養(yǎng)24 h,0.25%胰蛋白酶消化,RT-qPCR法檢測(cè)各組中LINC02418或miR-940表達(dá)水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果,并收集細(xì)胞備用.

1.2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性:將si-NC組、si-LINC02418組、miR-940組、miR-NC組、si-LINC02418+antimiR-940組和si-LINC02418+anti-miR-NC組細(xì)胞均以5×103個(gè)/孔接種于96孔板中,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h.加10 μL CCK-8試劑,再孵育2 h,于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)光密度(OD)值.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值.

1.2.4 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲:將si-NC組、si-LINC02418組、miR-940組、miR-NC組、si-LINC02418+anti-miR-940組和si-LINC02418+antim iR-N C組細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個(gè)/mL.遷移實(shí)驗(yàn):Transwell上室加100 μL細(xì)胞懸液,下室加500 μL培養(yǎng)基.培養(yǎng)48 h后,棄培養(yǎng)基,經(jīng)多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色后,顯微鏡觀察,隨機(jī)取5個(gè)視野,計(jì)數(shù).侵襲實(shí)驗(yàn):先在Transwell上室鋪Matrigel膠,晾干后再加100 μL細(xì)胞懸液,剩余步驟同遷移實(shí)驗(yàn).

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡:將s i-N C組、si-LINC02418組、miR-940組、miR-NC組、si-LINC02418+anti-miR-940組和si-LINC02418+anti-miR-NC組細(xì)胞細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于24孔板中,培養(yǎng)48 h.棄培養(yǎng)基,收集細(xì)胞,PBS清洗2次.參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說(shuō)明書(shū),采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡.

1.2.6 蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá):將si-NC組、si-LINC02418組、miR-940組、miR-NC組、si-LINC02418+anti-miR-940組和si-LINC02418+antimiR-NC組細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于24孔板中,培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞.RIPA試劑細(xì)胞中總蛋白,BCA法對(duì)蛋白定量,行10% SDS-PAGE電泳,并將分離蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜.置于5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h后,分別于CyclinD1(1:1000)、p21(1:1000)、MMP-2(1:500)、MMP-9(1:500)、Bcl-2(1:1000)和Bax(1:1000)一抗孵育液中4 ℃過(guò)夜.再于山羊抗兔二抗(1:2000)孵育液中37 ℃孵育1 h.最后加顯影液,避光顯影后曝光拍照.

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):取對(duì)數(shù)增殖期的HCCLM3細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中,用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法,分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)TLINC02418與miR-940 mimic或miR-NC、MUTLINC02418與miR-940 mimic、miR-NC.轉(zhuǎn)染12 h后,更換培養(yǎng)基.再培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞并裂解,3500 r/min離心收集上清,檢測(cè)上清熒光素酶活性.以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參,計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶活性.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.計(jì)量資料以mean±SD表示.兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組間比較用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn).以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 LINC02418和miR-940在肝癌組織中的表達(dá) 如表1所示,肝癌組織中LINC02418表達(dá)高于癌旁組織(P＜0.05),而miR-940表達(dá)低于癌旁組織(P＜0.05).

2.2 下調(diào)LINC02418對(duì)肝癌HCCLM3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 如圖1和表2所示,轉(zhuǎn)染si-LINC02418后,HCCLM3細(xì)胞中LINC02418表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05),HCCLM3細(xì)胞活性、遷移數(shù)和侵襲數(shù)降低(P＜0.05),同時(shí),與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)的蛋白CyclinD1、MMP-2和MMP-9表達(dá)降低(P＜0.05),而p21表達(dá)升高(P＜0.05).

2.3 下調(diào)LINC02418對(duì)肝癌HCCLM3細(xì)胞凋亡的影響如圖2和表3所示,轉(zhuǎn)染si-LINC02418后,HCCLM3細(xì)胞凋亡率升高(P＜0.05),Bax蛋白表達(dá)升高(P＜0.05),而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)降低(P＜0.05).

2.4 上調(diào)miR-940對(duì)肝癌HCCLM3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 如圖3、圖4、表4和表5所示,轉(zhuǎn)染miR-940 mimics后,HCCLM3細(xì)胞活性、遷移數(shù)、侵襲數(shù)降低(P＜0.05),細(xì)胞凋亡率升高(P＜0.05),且與增殖、遷移、侵襲及凋亡相關(guān)的蛋白CyclinD1、MMP-2、MMP-9和Bcl-2表達(dá)降低(P＜0.05),而p21和Bax表達(dá)升高(P＜0.05).

2.5 LINC02418靶向調(diào)控miR-940的表達(dá) LINC02418與miR-940的核苷酸序列結(jié)合位點(diǎn),見(jiàn)圖5A.共轉(zhuǎn)染W(wǎng)TLINC02418與miR-940 mimics的細(xì)胞熒光素酶活性低于共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-LINC02418與miR-NC的細(xì)胞(0.42±0.04比1.00±0.09,P＜0.05),但共轉(zhuǎn)染MUT-LINC02418與miR-940 mimics的細(xì)胞熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染W(wǎng)TLINC02418與miR-NC的細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)顯著差異(0.99±0.09比0.97±0.08,P＞0.05),見(jiàn)圖5B.pcDNALINC02418組細(xì)胞中miR-940表達(dá)水平低于pcDNA組(0.41±0.04比1.00±0.07,P＜0.05),si-LINC02418組細(xì)胞中miR-940表達(dá)水平高于si-NC組(2.78±0.27比1.01±0.08,P＜0.05),見(jiàn)圖5C.

表1 LINC02418和miR-940在肝癌組織中的表達(dá)(mean±SD,n=25)

2.6 下調(diào)m i R-940逆轉(zhuǎn)了下調(diào)L I N C02418對(duì)肝癌HCCLM3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用 如圖6、圖7、表6和表7所示,與共轉(zhuǎn)染si-LINC02418與anti-miR-NC的細(xì)胞比較,共轉(zhuǎn)染si-LINC02418與antimiR-940的HCCLM3細(xì)胞活性、遷移數(shù)、侵襲數(shù)升高(P＜0.05),細(xì)胞凋亡率降低(P＜0.05),且CyclinD1、MMP-2、MMP-9和Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P＜0.05),而p21和Bax蛋白表達(dá)降低(P＜0.05).

3 討論

lncRNA是真核生物體內(nèi)廣泛存在的長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)控作用.研究已顯示,多個(gè)lncRNA在肝癌中異常表達(dá),參與肝癌的發(fā)生發(fā)展.Li等[10]研究顯示,lncRNA HCG11在肝癌組織中表達(dá)升高,其高表達(dá)與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān),其通過(guò)下調(diào)miR-26a-5p表達(dá)并促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白-12(ATG12)表達(dá)來(lái)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及鼠異種移植腫瘤的生長(zhǎng),可能是治療肝癌的潛在治療靶標(biāo).Zhuang等[11]研究顯示,lncRNA CDKN2B-AS1在肝癌中的表達(dá)明顯高于正常組織,其高表達(dá)與患者總生存期、腫瘤大小和TNM分期密切相關(guān),過(guò)表達(dá)CDKN2B-AS1可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖.Sun等[12]研究顯示,與鄰近的正常組織相比,lncRNA FER1L4在肝癌組織中表達(dá)較低,上調(diào)其表達(dá)可抑制體外肝癌細(xì)胞增殖及體內(nèi)肝癌腫瘤生長(zhǎng),其可能是肝癌的有效治療靶標(biāo).Sheng等[13]研究顯示,lncRNA RGMB-AS1在肝癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)明顯降低,上調(diào)lncRNA RGMB-AS1可明顯減弱肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,其在肝癌中具有抗癌作用.這些研究表明不同的lncRNA在肝癌中發(fā)揮的作用不同,探究肝癌中異常表達(dá)的lncRNA及其對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的影響可為肝癌治療提供新的分子靶標(biāo).

表2 下調(diào)LINC02418對(duì)肝癌HCCLM3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響(mean±SD,n=9)

表3 下調(diào)LINC02418對(duì)肝癌HCCLM3細(xì)胞凋亡的影響(mean±SD,n=9)

圖1 下調(diào)LINC02418對(duì)肝癌HCCLM3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響. A:下調(diào)LINC02418后HCCLM3細(xì)胞中CyclinD1、p21、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá); B:下調(diào)LINC02418后HCCLM3細(xì)胞遷移和侵襲.

圖2 下調(diào)LINC02418對(duì)肝癌HCCLM3細(xì)胞凋亡的影響. A:下調(diào)LINC02418后HCCLM3細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá); B:下調(diào)LINC02418后HCCLM3細(xì)胞凋亡流式圖.

圖3 上調(diào)miR-940對(duì)肝癌HCCLM3細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡的影響. A:上調(diào)miR-940后HCCLM3細(xì)胞遷移和侵襲情況; B:上調(diào)miR-940后HCCLM3細(xì)胞凋亡流式圖.

圖4 上調(diào)miR-940后HCCLM3細(xì)胞中增殖、遷移、侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá).

作為一種lncRNA,LINC02418參與多種腫瘤發(fā)展進(jìn)程.例如,Tian等[14]研究顯示,LINC02418在結(jié)腸癌組織中表達(dá)升高,其高表達(dá)與患者預(yù)后不良密切相關(guān),其可靶向miR-34b-5p/Bcl-2軸增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲性.本研究以癌旁組織為對(duì)照,RT-qPCR檢測(cè)了肝癌組織中LINC02418表達(dá)水平,結(jié)果顯示肝癌組織中LINC02418表達(dá)水平明顯高于癌旁組織,提示LINC02418可能促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展.進(jìn)一步轉(zhuǎn)染LINC02418小干擾RNA至肝癌細(xì)胞下調(diào)LINC02418表達(dá)降低了肝癌細(xì)胞的活性、遷移和侵襲數(shù)降低,而凋亡率升高,說(shuō)明下調(diào)LINC02418可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,提示LINC02418可能是肝癌的潛在治療靶點(diǎn).

CyclinD1參與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程,可促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)變,加速細(xì)胞周期進(jìn)程,促進(jìn)細(xì)胞增殖[15].p21是目前已知的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子,其表達(dá)增加可降低細(xì)胞增殖能力.MMP-2和MMP-9參與降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜,對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲起促進(jìn)作用[16].Bax/Bcl-2參與調(diào)控細(xì)胞凋亡,其中Bax表達(dá)增加時(shí)可形成通源二聚體,改變細(xì)胞線粒體膜通透性,引起細(xì)胞色素C釋放量增加,導(dǎo)致下游caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活,進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡; 而B(niǎo)cl-2是抗凋亡分子,其表達(dá)增加時(shí)與Bax形成異源二聚體,減弱Bax的促凋亡作用[17].本研究顯示,下調(diào)LINC02418表達(dá)抑制了肝癌細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9和Bcl-2的蛋白表達(dá),而促進(jìn)了p21和Bax蛋白表達(dá),進(jìn)一步說(shuō)明LINC02418可能通過(guò)直接或間接調(diào)控與增殖、凋亡、遷移和侵襲相關(guān)蛋白分子的表達(dá)來(lái)影響肝癌細(xì)胞的惡性表型.

表4 上調(diào)miR-940對(duì)肝癌HCCLM3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響(mean±SD,n=9)

表5 上調(diào)miR-940對(duì)肝癌HCCLM3細(xì)胞中增殖、遷移、侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(mean±SD,n=9)

表6 下調(diào)miR-940逆轉(zhuǎn)下調(diào)LINC02418對(duì)肝癌HCCLM3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用(mean±SD,n=9)

圖5 LINC02418靶向調(diào)控miR-940的表達(dá). A:LINC02418的序列中含有與miR-940互補(bǔ)的核苷酸序列; B:雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn); C:LINC02418調(diào)控miR-940表達(dá).aP＜0.05,與miR-NC組比較; cP＜0.05,與pcDNA組比較; eP＜0.05,與si-NC組比較.

表7 下調(diào)miR-940表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制LINC02418表達(dá)對(duì)肝癌HCCLM3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的作用(mean±SD,n=9)

圖6 下調(diào)miR-940逆轉(zhuǎn)下調(diào)LINC02418對(duì)肝癌HCCLM3細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡的作用.A:肝癌HCCLM3細(xì)胞的遷移侵襲; B:細(xì)胞凋亡流式圖.

圖7 大鼠 下調(diào)miR-940逆轉(zhuǎn)下調(diào)LINC02418對(duì)肝癌HCCLM3細(xì)胞中增殖、遷移、侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá).

lncRNA可靶向結(jié)合miRNA,共同影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[18].生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示,LINC02418可能與miR-940靶向結(jié)合.為了進(jìn)一步探討LINC02418影響肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的作用機(jī)制,本研究利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和RT-qPCR檢測(cè)LINC02418對(duì)miR-940表達(dá)的影響證實(shí)了LINC02418靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-940表達(dá).研究顯示,miR-940在非小細(xì)胞肺癌[19]、膠質(zhì)瘤[20]和乳腺癌[21]等腫瘤中表達(dá)降低,上調(diào)miR-940表達(dá)可抑制腫瘤發(fā)展進(jìn)程.本研究顯示,miR-940在肝癌組織中表達(dá)下調(diào),上調(diào)其表達(dá)可有效降低肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,同時(shí)加劇肝癌細(xì)胞凋亡,與Yuan等[22]報(bào)道的結(jié)果一致,說(shuō)明miR-940作為抑癌基因參與肝癌發(fā)生發(fā)展,靶向上調(diào)其表達(dá)可延緩肝癌發(fā)展進(jìn)程.本研究還顯示,下調(diào)miR-940表達(dá)逆轉(zhuǎn)了下調(diào)LINC02418表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響,進(jìn)一步說(shuō)明下調(diào)LINC02418表達(dá)通過(guò)靶向上調(diào)miR-940表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗肝癌作用.

4 結(jié)論

綜上所述,LINC02418在肝癌組織中表達(dá)明顯上調(diào),下調(diào)LINC02418可有效減弱肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,并促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制與靶向上調(diào)miR-940表達(dá)有關(guān),LINC02418/miR-940軸可能為肝癌的治療提供了潛在靶點(diǎn).但是,本研究還存在一定的不足之處,僅在體外細(xì)胞層面探討了LINC02418對(duì)肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及可能機(jī)制,未通過(guò)體內(nèi)裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LINC02418/miR-940軸對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的影響,且LINC02418/miR-940軸下游靶基因及信號(hào)通路也還尚未進(jìn)行探究,因此,接下來(lái)將利用裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)探究LINC02418對(duì)肝癌腫瘤生長(zhǎng)的影響及其他可能的作用機(jī)制.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

肝癌發(fā)病機(jī)制尚未明確,已有研究顯示lncRNA參與調(diào)控肝癌細(xì)胞惡性表型(增殖、凋亡、遷移和侵襲),但LINC02418對(duì)肝癌細(xì)胞惡性表型的影響機(jī)制尚未可知.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

LINC02418在等腫瘤中表達(dá)升高,參與調(diào)控腫瘤增殖、遷移和侵襲等惡性表型,但其對(duì)肝癌細(xì)胞惡性表型的影響及作用機(jī)制尚未可知.LncBase Predicted v.2靶基因預(yù)測(cè)顯示,LINC02418可能靶向結(jié)合miR-940.以有報(bào)道稱,miR-940在肝癌中呈低表達(dá),上調(diào)miR-940可減弱肝癌細(xì)胞的活力和侵襲性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,且抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng).但LINC02418能否靶向調(diào)控miR-940影響肝癌細(xì)胞的惡性表型也還未知.因此,探究LINC02418對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及其能否靶向miR-940發(fā)揮作用,以期為肝癌的靶向分子治療提供新靶點(diǎn).

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探究LINC02418對(duì)肝癌細(xì)胞惡性表型(增殖、遷移、侵襲和凋亡)的影響及其能否靶向miR-940發(fā)揮作用,為肝癌的靶向治療提供新的分子靶點(diǎn).

實(shí)驗(yàn)方法

RT-qPCR檢測(cè)肝癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中LINC02418和miR-940表達(dá).分別轉(zhuǎn)染LINC02418小干擾RNA、miR-940模擬物至肝癌細(xì)胞HCCLM3,RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中LINC02418或miR-940表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果,CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖,Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞中CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá).雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-940與LINC02418靶向調(diào)控關(guān)系.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

肝癌組織中LINC02418呈高表達(dá),miR-940呈低表達(dá).下調(diào)LINC02418或上調(diào)miR-940可降低肝細(xì)細(xì)胞活性、遷移和侵襲數(shù)及CyclinD1、MMP-2、MMP-9和Bcl-2的蛋白表達(dá),但促進(jìn)細(xì)胞凋亡率及p21和Bax蛋白表達(dá).LINC02418可靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-940,下調(diào)miR-940逆轉(zhuǎn)下調(diào)LINC02418對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用及凋亡促進(jìn)作用.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

肝癌組織中LINC02418表達(dá)升高,下調(diào)LINC02418表達(dá)可降低肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,并加劇肝癌細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制可能與靶向上調(diào)miR-940表達(dá)有關(guān),為肝癌的靶向分子治療提供了新的分子靶點(diǎn).

展望前景

miR-940下游靶基因及信號(hào)通路在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用還未知,且本研究?jī)H通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了初步探究,尚需進(jìn)一步通過(guò)裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)驗(yàn)證LINC02418/miR-940軸對(duì)肝癌發(fā)展的影響.LINC02418/miR-940軸可能為肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制的闡明提供了新思路并為其治療提供了新的分子靶點(diǎn).