豬瘟野毒感染抗體阻斷ELISA檢測方法的建立與初步評價

周景云，劉百紅，劉雪微，楊欣艷，李寶春，陳西釗

(北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司，北京 100094)

豬瘟是豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，具有高傳染性和高致病性的特點，嚴(yán)重阻礙我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[1]。豬瘟被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為通報疫病之一，我國將其列為一類動物傳染病[2-3]。豬瘟的出現(xiàn)距今已有200多年，目前雖然很多國家已經(jīng)消滅了豬瘟，但近期，日本26年來再次暴發(fā)該病[4-5]，因此它仍然是危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病。目前對豬瘟的防控主要是疫苗免疫，但受各方面因素影響，豬瘟疫苗免疫失敗現(xiàn)象時有發(fā)生，豬瘟在局部地區(qū)仍有發(fā)生與流行[6-7]。近年來，豬瘟的流行形式已從頻發(fā)的大流行轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗟貐^(qū)散發(fā)性流行，大多數(shù)表現(xiàn)為溫和型豬瘟，臨床癥狀減輕，呈現(xiàn)亞臨床感染。母豬感染豬瘟，導(dǎo)致長期帶毒、散毒，成為豬瘟預(yù)防免疫效果差、反復(fù)發(fā)生的重要原因。

CSFV屬于黃病毒科瘟病毒屬。該病毒基因組為單股正鏈RNA，基因組的中間部分是編碼多聚蛋白的開放閱讀框[8-9]，從 5′→3′依次編碼的結(jié)構(gòu)蛋白為 Npro、C、 E0、E1、 E2 和 非結(jié)構(gòu)蛋白P7、NS2、 NS3、 NS4A、NS4B、 NS5A 和 NS5B，其中 C、 E0、E1、 E2 為重要的結(jié)構(gòu)蛋白，尤其是E2蛋白，是主要的保護性抗原結(jié)構(gòu)蛋白，具有較強的免疫原性和反應(yīng)原性[10-11]，可誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生[12-14]。

目前，國內(nèi)外市售豬瘟檢測試劑盒較多，均為檢測豬瘟抗體，用來評估豬場疫苗免疫效果。為配合豬瘟凈化政策，需要研制豬瘟野毒抗體檢測試劑盒。本項目利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的豬瘟野毒E2蛋白作為包被抗原，用針對豬瘟野毒的單克隆抗體經(jīng)過辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記后作為酶標(biāo)抗體建立阻斷ELISA檢測方法。本研究中使用的豬瘟野毒單克隆抗體為豬瘟野毒株E2蛋白作為免疫原而制備的，其只與不同亞型的豬瘟野毒株發(fā)生反應(yīng)，與豬瘟兔化弱毒疫苗株(C株)不反應(yīng)[15-16]。因此，該單抗可與臨床樣本中感染豬瘟野毒后產(chǎn)生的抗體競爭性結(jié)合包被于抗原板上的豬瘟野毒E2蛋白，有效阻斷樣本中的野毒抗體與包被抗原的反應(yīng)，通過計算阻斷率判定樣本中豬瘟野毒感染情況。該方法可用于臨床上豬瘟野毒感染豬的篩查，為豬瘟凈化計劃提供真實的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

酶標(biāo)板購自廈門怡佳美實驗器材有限公司；豬瘟野毒陽性參考品、豬瘟陰性參考品、豬瘟免疫參考品、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)陽性血清、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)陽性血清、豬細(xì)小病毒(PPV)陽性血清、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)陽性血清均購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；辣根過氧化物酶購自SIGMA公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗豬IgG多抗購自SIGMA公司；豬瘟野毒單抗細(xì)胞株購自廣州伯尼茲生物科技有限公司[17]；豬瘟野毒E2蛋白、豬瘟野毒單抗和酶標(biāo)野毒單抗為世紀(jì)元亨自制；369份豬瘟陰性血清、84份臨床豬血清由世紀(jì)元亨檢測中心提供(其中78份免疫血清，為免疫哈爾濱元亨藥業(yè)有限公司的豬瘟活疫苗的豬場中獲得；6份豬瘟野毒血清為有豬瘟感染的豬場獲得)；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 豬瘟野毒E2蛋白特異性鑒定

采用間接ELISA方法對豬瘟野毒E2蛋白的特異性進(jìn)行鑒定。將豬瘟野毒E2蛋白稀釋至0.1 μg/mL的包被濃度，100 μL/孔，加樣完畢后用封板膜覆蓋反應(yīng)板，2～8 ℃放置16～18 h。用PBST洗板1次，每孔加5% 脫脂奶粉，2～8 ℃封閉24 h。將豬瘟野毒陽性參考品、豬瘟免疫參考品、豬瘟陰性參考品、PRRSV陽性血清、PCV2陽性血清、PPV陽性血清、BVDV陽性血清分別進(jìn)行1∶10稀釋，100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)1 h，PBST洗5次。將辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗豬IgG多抗1∶5 000進(jìn)行稀釋，100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)30 min，PBST洗5次。每孔先加入50 μL 的底物A再加入50 μL 底物B，37 ℃反應(yīng)10 min，每孔加入50 μL終止液，讀取OD450值，計算阻斷率。

1.2.2 抗原最佳包被濃度和酶標(biāo)單抗最佳稀釋度的確定

采用棋盤滴定法。將豬瘟野毒E2蛋白用CB包被液按照1∶500、1∶1 000、1∶3 000、1∶5 000、1∶7 000、1∶10 000進(jìn)行稀釋，充分混勻后于96孔微量反應(yīng)板上橫向包被，100 μL/孔，加樣完畢后將反應(yīng)板貼上封板膜，2～8 ℃放置16～18 h。用PBST洗板1次，每孔加5% 脫脂奶粉，2～8 ℃封閉24 h。豬瘟野毒陽性參考品、豬瘟陰性參考品按照1∶1進(jìn)行稀釋，100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)1 h，PBST洗5次。將豬瘟野毒酶標(biāo)單抗進(jìn)行1∶500、1∶1 000、1∶2 000稀釋后自上而下加入到反應(yīng)板內(nèi)，100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)30 min，PBST洗滌5次，每孔先加入50 μL 的底物A再加入50 μL 底物B，37 ℃反應(yīng)10 min，每孔加入50 μL終止液，讀取OD450值，計算阻斷率，選擇豬瘟野毒陽性參考品阻斷率最高點對應(yīng)的E2抗原包被濃度和酶標(biāo)單抗?jié)舛葹樽罴褩l件。

1.2.3 包被條件確定

1.2.3.1 包被液的選擇

按照已確定好的E2蛋白最佳包被濃度，分別選用碳酸鹽緩沖液(pH=9.6)、Tris-HCl(pH=8.0)、磷酸鹽緩沖液(pH=7.2)作為包被液進(jìn)行包被，100 μL/孔，經(jīng)封閉液封閉后，與豬瘟陰性參考品反應(yīng)OD450值最高者即為蛋白吸附效果最好的包被液。

1.2.3.2 包被條件的摸索

按照已確定好的試驗條件，分別選擇2～8 ℃ 10 h、2～8 ℃ 14 h、2～8 ℃ 18 h、2～8 ℃ 24 h、37 ℃ 2 h、37 ℃ 4 h，6個包被條件進(jìn)行包被，100 μL/孔，經(jīng)封閉液封閉后，與陰性參考品進(jìn)行反應(yīng)，選擇陰性參考品OD450值高且孔間變異系數(shù)小的包被條件進(jìn)行包被。

1.2.4 封閉液的選擇

按照已確定好的試驗條件，分別選擇5% BSA、10%脫脂奶粉、10%馬血清、10% 新生牛血清、1%酪蛋白作為封閉液進(jìn)行封閉，封閉條件為2～8 ℃ 24 h。比較豬瘟陰性參考品的OD450值及N/P值，確定最佳封閉液的成分。

1.2.5 血清稀釋液的選擇

按照已確定好的試驗條件，分別比較5% BSA、5%新生牛血清、10%馬血清、10%脫脂奶粉、10%新生牛血清作為稀釋液的效果。用上述稀釋液分別對豬瘟野毒陽性參考品和豬瘟陰性參考品進(jìn)行稀釋，比較豬瘟野毒陰性參考品的OD450值、豬瘟野毒陽性參考品的阻斷率及N/P值，從中選擇陰性參考品OD450值高、陽性參考品阻斷率高及N/P值高的稀釋液作為血清稀釋液。

1.2.6 血清稀釋倍數(shù)的選擇

用確定好的包被條件和封閉條件進(jìn)行包被板制備，將豬瘟野毒陽性參考品、豬瘟免疫參考品和豬瘟陰性參考品分別按照1∶1、1∶4、1∶8進(jìn)行稀釋，每孔加100 μL，37 ℃反應(yīng)1 h，PBST洗板5次，每孔加入100 μL豬瘟野毒酶標(biāo)單抗，37 ℃反應(yīng)30 min，PBST洗板5次，每孔先加入50 μL 的底物A再加入50 μL 底物B，37 ℃反應(yīng)10 min，每孔加入50 μL終止液，讀取OD450值，計算豬瘟野毒陽性參考品、豬瘟免疫參考品阻斷率。

1.2.7 底物反應(yīng)時間的確定

將豬瘟陰性參考品和豬瘟野毒陽性參考品加到微量反應(yīng)板中，37 ℃反應(yīng)1 h。PBST洗滌5次，每孔加入100 μL豬瘟野毒酶標(biāo)單抗，37 ℃反應(yīng)30 min。PBST洗滌5次后，加入底物液，設(shè)置5個顯示條件，分別為室溫10 min、37 ℃ 5 min、37 ℃ 10 min、37 ℃ 15 min、37 ℃ 20 min，比較陰性參考品與野毒陽性參考品的比值，選擇比值最高的反應(yīng)時間作為顯色時間。

1.2.8 陰陽臨界值的確定

用以上建立的阻斷ELISA方法，檢測369份豬瘟野毒陰性血清，該血清為世紀(jì)元亨于合作豬場中收集的未免疫豬瘟疫苗的血清，其經(jīng)過國際貿(mào)易指定的熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)[18]進(jìn)行驗證，均為豬瘟抗體陰性。計算阻斷率(%)=(陰性對照OD450平均值-樣品OD450值)/陰性對照OD450平均值×100%，測定血清樣本阻斷率的平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。確立陰陽判界為(X+3SD)，當(dāng)血清樣本阻斷率>(X+3SD)時判為陽性；當(dāng)血清樣本阻斷率≤(X+3SD)時判為陰性。

1.2.9 初步臨床應(yīng)用

用建立的阻斷ELISA檢測方法檢測84份臨床豬血清，驗證該方法的應(yīng)用情況。其中78份為免疫世紀(jì)元亨的豬瘟活疫苗的血清，其采自正規(guī)豬場，該豬場免疫背景清晰，并且每年定期采樣進(jìn)行RT-PCR檢測，CSFV均為陰性，無豬瘟感染史。78份血清經(jīng)過世紀(jì)元亨的CSFV抗體間接ELISA檢測試劑盒(用于疫苗評估)測定，抗體水平一致，離散度均一，免疫效果較好。該血清同時由FAVN試驗測定，均為免疫抗體陽性；另6份為CSFV感染血清，來自有豬瘟感染的豬場。6頭豬用RT-PCR方法進(jìn)行了扁桃體帶毒情況檢測，均為陽性。用FAVN試驗檢測該6頭豬采取的血清，均為陽性，證實該6份血清為豬瘟野毒感染血清。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬瘟野毒E2蛋白特異性鑒定

采用間接ELISA方法對豬瘟野毒E2蛋白的特異性進(jìn)行鑒定。豬瘟野毒E2蛋白以0.1 μg/mL包被，制備反應(yīng)板，分別將豬瘟野毒陽性參考品、豬瘟免疫參考品、豬瘟陰性參考品、PRRSV陽性血清、PCV2陽性血清、PPV陽性血清、BVDV陽性血清以1∶10稀釋進(jìn)行試驗，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，豬瘟野毒E2可與豬瘟野毒陽性參考品發(fā)生較強的特異性反應(yīng)，與豬瘟陰性參考品及其他病毒陽性血清無反應(yīng)。

+為陽性，-為陰性

2.2 豬瘟野毒E2最佳包被濃度和酶標(biāo)單抗最佳稀釋度的確定

通過不同濃度E2包被，確定本檢測方法的豬瘟野毒E2蛋白最佳包被量以及豬瘟野毒酶標(biāo)單抗的最佳使用濃度。由圖2可知，當(dāng)豬瘟野毒酶標(biāo)單抗使用濃度為1∶1 000、野毒E2包被濃度為1∶5 000(對應(yīng)的包被濃度為0.03 μg/mL)時，阻斷率達(dá)到最高值，后續(xù)呈現(xiàn)水平狀態(tài)。綜合結(jié)果可見，豬瘟野毒E2最佳包被濃度為0.03 μg/mL，且豬瘟野毒酶標(biāo)單抗最佳稀釋比例為1∶1 000。

圖2 抗原包被濃度和酶標(biāo)單抗稀釋濃度的確定

2.3 包被條件確定

2.3.1 包被液的選擇

通過對3種包被液比較，表明pH=9.6的碳酸鹽緩沖液作為包被液時，檢測豬瘟陰性參考品OD450值最高，效果最好，見圖3，因此選擇pH=9.6的碳酸鹽緩沖液作為包被液。

圖3 最佳包被液的確定

2.3.2 包被條件的摸索

對6個不同包被條件進(jìn)行比較，結(jié)果見圖4，可知，2～8 ℃包被18 h時，陰性參考品OD450值最高，蛋白吸附量最好，并且包被的板子變異系數(shù)最小，最為穩(wěn)定。因此確定2～8 ℃包被18 h作為包被條件。

圖4 最佳包被條件的確定

2.4 封閉液的選擇

通過對多種封閉液的封閉效果進(jìn)行比較， 選擇陰性參考品OD450值較高且N/P值較高的作為封閉液，結(jié)果見圖5。從圖中可以看出，10%馬血清作為封閉液時，陰性參考品的OD450值和N/P值均最高，因此，選擇10%馬血清作為封閉液。

圖5 最佳封閉液的確定

2.5 血清稀釋液的選擇

通過對多種稀釋液進(jìn)行比較，選擇陰性參考品OD450值較高且N/P值較高的作為稀釋液，結(jié)果見圖6，以5%的新生牛血清作為血清和酶的稀釋液為最佳。

圖6 最佳血清稀釋液的確定

2.6 血清稀釋倍數(shù)的選擇

由圖7可知，在豬瘟野毒陽性參考品阻斷率基本不受影響的同時，當(dāng)血清稀釋比例為1∶4時，免疫血清抗體降低效果更明顯，因此最終血清稀釋比例定為1∶4。

2.7 底物反應(yīng)條件的確定

不同底物顯色時間對顯色效果進(jìn)行比較，結(jié)果見圖8。綜合考慮陰性對照OD450值、N/P值以及試驗操作的便捷性等，最終確定底物顯色條件為37 ℃，10 min為最佳。

圖7 最佳血清稀釋倍數(shù)的確定

圖8 最佳底物反應(yīng)條件的確定

2.8 陰陽臨界值的確定

用以上建立的阻斷ELISA方法，檢測369份豬瘟野毒陰性血清，計算血清樣本阻斷率的平均值為11.42和標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.36，X+3SD=39.51。因此確立陰陽判界為，當(dāng)阻斷率>40%時判為陽性，當(dāng)阻斷率≤40%時判為陰性。

2.9 初步臨床應(yīng)用

用建立的阻斷ELISA方法檢測收集的84份豬臨床血清，結(jié)果見圖9，其中6份CSFV感染血清檢測為豬瘟野毒抗體陽性，其他78份免疫血清均檢測為豬瘟野毒抗體陰性。

圖9 84份臨床血清檢測

3 討論

豬瘟是危害我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的頭號疫病。近年來在免疫壓力及各種環(huán)境變化等因素的影響下，豬瘟的流行特點發(fā)生了很大的變化，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失[19]。雖然我國應(yīng)用豬瘟兔化弱毒疫苗已有60多年，但至今仍未能根除豬瘟，其主要原因是，疫苗免疫程序混亂，帶毒種豬，免疫耐受，相應(yīng)政策法規(guī)不健全等[3]。豬瘟常和其他的疾病混合感染，造成病理變化和臨床癥狀越來越復(fù)雜，給豬瘟的臨床診斷與防治帶來極大困難[20]。目前種豬群中CSFV持續(xù)帶毒感染不僅導(dǎo)致嚴(yán)重的繁殖障礙，而且引起新生仔豬的死亡和免疫耐受，母豬的帶毒感染已成為CSFV傳播的主要原因之一。為此，開展豬群的CSFV凈化已刻不容緩。

目前關(guān)于豬瘟抗體ELISA檢測方法的研究有很多[21-24]，并且國內(nèi)外豬瘟抗體檢測試劑盒也較多，但均用于評估豬場疫苗免疫效果，沒有豬瘟野毒抗體檢測試劑盒上市，無法區(qū)分CSFV自然感染動物和C株疫苗免疫動物的血清抗體。

為查清豬群中豬瘟野毒感染情況，進(jìn)一步為制定規(guī)模化豬場豬瘟控制凈化措施做準(zhǔn)備，本項目利用豬瘟野毒E2和針對豬瘟野毒E2的單克隆抗體作為原料建立了阻斷ELISA檢測方法。該方法中的單抗僅與豬瘟野毒株反應(yīng)，與C株不反應(yīng)，因此可與樣本中的野毒抗體競爭結(jié)合包被抗原，進(jìn)而確定豬只感染豬瘟的情況。目前，雖然針對CSFV的單克隆抗體研究較多[25-28]，但均未研制成豬瘟野毒抗體檢測試劑盒。本研究建立了豬瘟野毒抗體阻斷ELISA檢測方法并進(jìn)行了初步驗證，共檢測84份臨床血清，檢測結(jié)果與血清已知背景一致。本試驗建立的抗體阻斷ELISA方法可初步用于臨床上豬瘟野毒感染豬的篩查，為豬瘟凈化計劃提供真實的參考依據(jù)。