益生乳酸菌對肉雞骨骼發(fā)育的影響及作用機制研究進展

崔耀明 管軍軍 王金榮 齊廣海

(1.河南工業(yè)大學生物工程學院，鄭州450000；2.中國農業(yè)科學院飼料研究所，北京100081)

據(jù)中國畜牧業(yè)協(xié)會公布的數(shù)據(jù)，2019年我國商品代白羽肉雞、黃羽肉雞、肉雜雞出欄量分別為44億、49億和18億只，肉雞出欄量總量達到111億只?？梢?，肉雞產業(yè)在我國占據(jù)著非常重要的地位?，F(xiàn)代肉雞在品種選育過程中，因過分注重肉雞肌肉生長速度而導致其骨骼發(fā)育相對滯后，腿病問題嚴重[1]。因此，改善肉雞骨骼發(fā)育狀況，提高骨骼質量，對于肉雞的優(yōu)質、高效生產具有重要意義。

當前，畜牧業(yè)生產中抗生素替代已經成為行業(yè)趨勢和研究熱點。飼用益生菌作為抗生素的有效替代物，受到了越來越多的關注。益生菌定義為“一類當以足夠劑量給予宿主時，通過促進腸道微生態(tài)平衡對宿主產生有利影響的活的微生物制劑”[2]。飼用益生菌主要分為三大類[3]：1)益生乳酸菌[如嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、詹氏乳桿菌、拉曼乳桿菌等]；2)益生雙歧桿菌類(如長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、卵形雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌等)；3)益生芽孢桿菌類(如地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌等)。此外，還有一些酵母菌亦可歸入益生菌的范疇。近來研究表明，飼糧添加益生乳酸菌能夠改善骨骼發(fā)育，提高骨骼質量。然而，益生乳酸菌提高骨骼質量的機理尚不明確。因此，本文綜述了益生乳酸菌對肉雞骨骼發(fā)育的影響，并分析了益生乳酸菌影響骨骼發(fā)育的潛在作用途徑，期待為益生乳酸菌改善肉雞骨骼發(fā)育、提高骨骼質量的機制探究提供借鑒，為其更好地應用于肉雞生產實踐提供理論依據(jù)。

1 肉雞骨骼健康及其發(fā)育機制研究

1.1 肉雞骨骼健康的意義

當前，肉雞骨骼質量受到了越來越多的關注。腿骨脆弱和骨質疏松能夠造成肉雞跛足和死亡率上升，這已經成為動物福利關注的主要問題[4]。生產中，肉雞通常遭受跛腳、骨骼畸形、骨質疏松等的折磨，這也會引起抓捕和運輸過程中骨骼斷裂，后者又會在肉制品加工過程中影響肉品質[5-6]。骨骼的易碎性和多孔性也會增加去骨肉制品加工過程中骨骼斷裂發(fā)生的概率，斷裂的骨骼會刺破肌肉和血管，造成血液浸出、肉品褪色，肉制品會因此失去對消費者的吸引力?？傊?，肉雞生產中骨骼質量非常重要，與之相關的經濟損失每年高達數(shù)十億元[7]。

當代肉雞經過幾十年育種體系的不斷選擇，肌肉生長速度快，骨骼發(fā)育卻相對滯后。骨骼發(fā)育不良，由此誘發(fā)的骨骼斷裂及其相關感染引起的死亡、生產效率低和肉制品品質差等[8-9]是肉雞生產中面臨的主要難題。骨骼質量差造成肉雞腿病的發(fā)病率越來越高，嚴重影響了肉雞正常的運動和采食能力，制約了肉雞的生長、增重速度，降低了養(yǎng)殖經濟效益。因此，肉雞的骨骼健康狀況需要獲得更多關注。肉雞整個生產周期的骨骼質量主要取決于生長發(fā)育階段結構骨的形成[10]，即骨骼的發(fā)育狀況。因此，改善骨骼發(fā)育對于維持肉雞骨骼健康和促進肉雞的優(yōu)質、高效生產具有重要意義。

1.2 肉雞骨骼的發(fā)育機制研究

骨骼相關的功能失調嚴重影響肉雞生產和動物福利，這激起了人們對骨骼生物學研究的濃厚興趣。自層架式肉雞養(yǎng)殖籠具引入生產，籠養(yǎng)肉雞癱瘓問題就隨之產生。肉雞癱瘓和骨骼質量差密切相關，最典型的例子是肉雞骨質疏松[11]。

肉雞骨骼發(fā)育包括2個過程：四肢長骨縱向生長和橫向生長[10]。四肢骨骼的長骨縱向生長是軟骨成骨作用的結果。骨形成有2種模式：1)膜內成骨(圖1)，即直接將間質組織轉換成骨，該模式主要發(fā)生在顱骨；2)軟骨內成骨(圖2)，即先是間充質細胞分化形成軟骨組織，然后軟骨組織被骨取代[12]，該模式主要發(fā)生在骨盆、四肢及脊柱骨[13]。在四肢長骨中，初級骨化中心形成后，不斷向兩端生長板延伸，從而使骨骼不斷縱向加長；之后，隨著次級骨化中心、骨髓腔和骨骺端的形成以及血管進入，骨骼繼續(xù)生長[14-16]。

骨骼直徑增加是骨骼以環(huán)形擴張的方式橫向變寬的過程(在骨內膜的表面，破骨細胞分解骨骼；在骨膜，成骨細胞不斷沉積骨質形成結構骨)。長骨橫向變寬的過程中，涉及長骨內膜的成骨作用。成骨細胞在軟骨膜中發(fā)育，并形成骨針，骨針融合形成了包含空腔的網狀骨。這些空腔逐漸被成骨細胞填滿，成骨細胞在其中持續(xù)分泌同軸向的、薄片狀的皮質骨。在骨內膜的表面，破骨細胞分解骨骼；在外部，隨著結構骨形成，骨骼以環(huán)形擴張的方式橫向變寬，即內部重吸收外部骨骼形成并向外擴張[17]。在生長的早期階段，骨骼橫向生長呈環(huán)狀迅速擴張，以至于在骨內膜重吸收開始之前骨骼生長過程中空腔尚未被完全填滿。但隨生長速度減慢，骨骼空腔的填充程度不斷增加[18-19]。

改善肉雞骨骼健康狀況，獲得更好的骨骼質量，不僅與動物健康狀況及動物福利密切相關，更是關乎肉雞產業(yè)的經濟效益。然而，圍繞肉雞的研究絕大多數(shù)集中在生產性能和肉品質方面，骨骼健康尚未受到足夠的重視。因此，改善肉雞骨骼質量的研究不僅十分重要而且非常必要。了解骨骼發(fā)育機制有助于更好地改善骨骼發(fā)育，提高骨骼質量。

2 益生乳酸菌改善肉雞骨骼發(fā)育作用效果研究

乳酸菌屬于厚壁菌門，是一類革蘭氏陽性菌，主要包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、乳明串珠菌屬(Leucocostoc)、片球菌屬(Pediococcus)、酒球菌屬(Oenococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)和鏈球菌屬(Streptococcus)等。乳酸菌是一類耐酸、桿形或球形、缺乏過氧化氫酶、微量需氧的微生物，其代謝特征是能夠發(fā)酵碳水化合物產生乳酸。此外，乳酸菌適應性強，適合多種腸道微環(huán)境，能夠定植在動物口腔、胃腸道黏膜表面。

越來越多的研究表明，益生乳酸菌能夠促進骨骼發(fā)育、維護骨骼健康。將益生乳酸菌混合物[副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)DSM 13434、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)DSM 15312和LactobacillusplantarumDSM 15313]制成膠囊(1×1010CFU/粒)，絕經早期女性每天服用，持續(xù)12個月，結果表明腰椎椎間盤骨骼礦物質密度損失大幅減少，這可能是由于益生乳酸菌加速了成骨作用，促進了骨骼的形成和礦物質的沉積[20]。此外，以小鼠為動物模型的研究也得到了相似的結果?；谇捌谘芯縖21]，篩選出具有抗炎癥特性的單一乳桿菌(LactobacillusparacaseiDSM13434)和混合乳桿菌(包含LactobacillusparacaseiDSM13434、LactobacillusplantarumDSM 15312和LactobacillusplantarumDSM 15313)，通過飲水的方式飼喂卵巢切除前的小鼠，持續(xù)6周，結果表明，無論是單一乳桿菌還是混合乳桿菌，均能使小鼠免于卵巢切除造成的骨質損失和骨骼重吸收[22]。Britton等[23]研究表明，羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri，一種能夠分泌有益免疫調控因子的共生微生物)能夠改變腸道微生物的組成，并能減少因卵巢切除造成的骨質損失和骨骼重吸收。另有研究表明，口服Lactobacillusreuteri能夠減少腸道炎癥，并能夠增加性腺完整的雄性小鼠的小梁骨骨量，這可能是由于Lactobacillusreuteri在小鼠生長發(fā)育階段促進了軟骨內的成骨作用，使其體內的骨量積累增多。Lactobacillusreuteri飼喂小鼠，4周后股骨小梁骨礦物質密度及其含量顯著提高[24]；飼喂Lactobacillusreuteri、Lactobacillusparacasei或Lactobacillusparacasei與Lactobacillusplantarum的混合物均能顯著改善由于卵巢切除造成的小鼠皮質骨含量及皮質骨礦物質含量降低[25]。Amdekar等[26]研究表明，8周齡威斯塔鼠口服Lactobacilluscasei、Lactobacillusacidophilus以及兩者的混合物，能夠改善弗氏佐劑造成的骨骼損傷，這可能是由于這些益生乳酸菌加速了骨骼形成，從而促進了骨骼損傷的修復。斑馬魚幼魚飼喂鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)10周后，脊柱骨鈣化顯著提前[27]，這表明Lactobacillusrhamnosus能夠促進生長發(fā)育階段斑馬魚鈣沉積和骨骼形成。通過以上分析可以得出，益生乳酸菌能夠調控骨骼代謝，從而改善骨骼質量。

a：骨先質細胞聚集 aggregates of osteoprogenotor cells；b：在聚集的中心及細胞間形成無定型基質和膠原蛋白網狀組織 amorphous ground substance and collagen meshwork formed in the center and in between the cells；c：間充質干細胞轉變?yōu)槌晒羌毎?，繼而在聚集的中心合成類骨質 the mesenchymal stem cell transform to osteoblasts which synthesize osteoid in the center of the aggregate；d：成骨細胞形成初步的骨組織，部分成骨細胞進入類骨質成為骨細胞 a rudimentary bone tissue formed by the osteoblasts and some of these get incorporated within the osteoid to become osteocytes。

a：骨先質細胞聚集 aggregates of osteoprogenitor cells；b：透明軟骨形成 model of hyaline cartilage；c：初級骨化中心形成 primary center of ossification；d：次級骨化中心形成 secondary center of ossification；e：骨髓腔和骨骺端形成 bone with medullary cavity and epiphyseal ends；f：血管輸送增加 highlighting feeding blood vessels。

益生乳酸菌作為飼料添加劑，已經在禽類生產中得到了廣泛的應用。然而，之前的研究絕大部分集中在益生乳酸菌對禽類生產性能、蛋品質、肉品質、腸道健康、抗應激、免疫等方面，很少關注到其對禽類骨骼質量的影響。

肉雞生長過程中，營養(yǎng)物質(如鈣、磷)和能量供應充足能夠促進骨骼發(fā)育。并且，大量研究表明肉雞飼糧添加益生乳酸菌能夠改善腸道形態(tài)、微生物菌群，提高營養(yǎng)物質的消化吸收效率[3]。據(jù)此可推測飼糧添加益生乳酸菌能夠促進肉雞骨骼發(fā)育、提高骨骼質量。并且已經有大量的研究以多種動物為模型驗證了該推測。事實上，肉雞飼糧添加益生乳酸菌取得了很好的改善骨骼質量的效果：飼糧添加6×107CFU/kg芽胞乳酸菌(Lactobacillussporogenes)顯著提高43日齡肉雞脛骨強度和灰分含量[28]；飲水添加乳酸菌(106CFU/只)顯著提高了30日齡肉雞脛骨指數(shù)、強度、直徑以及總灰分、鈣、磷含量[29]。飼糧添加Lactobacillusplantarum和Lactobacillusacidophilus顯著增加了肉雞脛骨磷(21日齡)和鈣(40日齡)的含量[30]?？梢姡暭Z添加益生乳酸菌能夠促進肉雞軟骨內的成骨作用、脛骨橫向生長、骨量增加以及礦物質在骨骼中沉積，進而改善骨骼發(fā)育，提高骨骼質量。

3 益生乳酸菌調控肉雞骨骼發(fā)育的潛在機理研究

探究益生乳酸菌調控肉雞骨骼發(fā)育的機制有助于更好地利用益生乳酸菌改善肉雞骨骼質量，進而提高肉雞生產效率。大量研究表明，益生乳酸菌改善骨骼健康狀況很可能是通過改變腸道微生物實現(xiàn)的[31-32]。腸道微生物影響骨骼組織潛在的途徑主要有3條：1)調節(jié)腸上皮細胞的營養(yǎng)素吸收；2)調節(jié)黏膜和全身的免疫反應；3)微生物及其小分子代謝產物穿過腸道內皮屏障，通過循環(huán)系統(tǒng)遷移至骨骼組織[33-34](圖3)。

3.1 益生乳酸菌通過調控營養(yǎng)物質吸收影響肉雞骨骼發(fā)育

目前為止，已有大量研究表明，益生乳桿菌能夠改變腸道微生物菌群，降低腸道pH，抑制有害菌群生長，改善腸道形態(tài)，維持腸道黏膜的完整性，促進鈣、磷等營養(yǎng)物質和能量的吸收[35]。

據(jù)此推測益生乳酸菌很可能是通過調節(jié)腸道微生物改善營養(yǎng)物質(包括能量)的吸收，繼而調控肉雞骨骼發(fā)育。例如，改善鈣吸收能夠促進骨骼發(fā)育，其主要途徑為以下2條：1)鈣離子通過誘導runt相關轉錄因子2(Runx2)和骨鈣素基因表達上調，促進成骨細胞的增殖和分化，從而促進骨骼形成；2)鈣增加能夠減少破骨細胞的活性，進而減少骨骼重吸收[34]。研究表明，改變腸道微生物能夠促進營養(yǎng)物質和能量吸收，進而促進動物生長和骨骼發(fā)育[36]。

3.2 益生乳酸菌通過調控免疫反應影響肉雞骨骼發(fā)育

腸道是動物體最大的免疫器官，集中了約80%的免疫細胞，產生全身將近80%的抗體。益生乳酸菌進入消化道后，能夠通過調控腸道免疫反應，最終影響骨骼代謝活動。許多免疫因子參與調控成骨和破骨作用。

腸道微生物及其代謝產物刺激腸道內皮免疫細胞，被激活的免疫細胞釋放抗炎或促炎介導因子(或細胞因子)，這些因子能夠通過循環(huán)系統(tǒng)作用于骨組織，通過成骨或破骨作用調節(jié)骨骼的形成和分解[35]；激活的免疫細胞還能夠遷移至骨髓組織，釋放免疫反應產物，如核因子-κB(NF-κB)配體激活受體(RANKL)，直接作用于骨組織，調節(jié)骨骼代謝[37]。

3.3 益生乳酸菌通過調控微生物相關模式分子(MAMPs)遷移影響肉雞骨骼發(fā)育

飼喂益生乳酸菌能夠改變腸道微生物，繼而引起腸道內MAMPs的種類和數(shù)量發(fā)生改變。MAMPs包括脂多糖、肽聚糖、鞭毛蛋白和游離DNA，它們是細菌分泌或者細胞死亡后保留下來的，體積足夠小能夠穿過腸道內皮屏障，進入循環(huán)系統(tǒng)，到達遠離腸道的器官(如骨骼)。因此，益生乳酸菌很可能通過MAMPs進入循環(huán)系統(tǒng)對骨骼組織發(fā)揮調節(jié)作用。MAMPs可以直接刺激骨細胞的免疫受體，包括Toll樣受體2(TLR2，與肽聚糖反應)[38]、Toll樣受體4(TLR4，與脂多糖反應)[39]和Toll樣受體5(TLR5，與肽鞭毛蛋白反應)[40]，進而調節(jié)骨骼代謝。

然而，目前為止，關于益生乳酸菌影響骨骼發(fā)育機理的研究非常有限，僅有的報道又不夠系統(tǒng)。因此，需要做更多工作來探究益生乳酸菌改善骨骼發(fā)育的機理，為更好地將益生乳酸菌應用于改善肉雞骨骼質量的生產實踐提供理論指導。

4 小 結

綜上可知，骨骼健康對肉雞生產意義重大，深入了解骨骼發(fā)育機制有助于采用適當?shù)臓I養(yǎng)策略調控骨骼代謝，維持骨骼健康。益生乳酸菌作為抗生素的有效替代物，能夠促進骨骼發(fā)育，提高骨骼質量，然而，其對骨骼質量的有益影響尚未受到足夠的重視。本文詳述了益生乳酸菌對肉雞骨骼質量的影響，并在此基礎上分析了益生乳酸菌影響骨骼代謝的潛在途徑。在這方面仍需要進行大

量的研究工作去探究和深化益生乳酸菌影響骨骼代謝的機制。本文將為益生乳酸菌改善肉雞骨骼質量的生產實踐提供理論指導。

DC：樹狀細胞 dendritic cell；EC：腸道內皮細胞 endothelial cell；MAMPs：微生物相關模式分子microbial-associated molecular patterns；Nutrients：營養(yǎng)素；Vitamins：維生素；Metabolites：代謝物；Cytokines：細胞因子；Systemic circulation：體循環(huán)。