結(jié)核分枝桿菌實驗室檢測產(chǎn)品和技術(shù)應(yīng)用進展

逄 宇，王玉峰，高興輝，湯一葦

結(jié)核病是全球面臨的重大公共衛(wèi)生問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，2019年全球新發(fā)結(jié)核病患者1 000萬例，死亡141萬例[1]。結(jié)核病患者的早期快速檢測對提高患者的療效，并有效阻斷結(jié)核人際傳播至關(guān)重要，但目前病例發(fā)現(xiàn)率和報告率仍然較低，特別是在結(jié)核病高負擔國家，估算超過1/3的病例并未被登記報告[1,2]。結(jié)核病診斷能力不足是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的根本原因，尤其在患者面對交通、經(jīng)濟負擔等一系列問題時，進一步加劇患者的漏診[3]。此外，當患者感染利福平耐藥或耐多藥(同時對利福平和異煙肼耐藥)的結(jié)核分枝桿菌時，患者的臨床管理將更為復(fù)雜，但是全球僅有33%的新發(fā)菌陽結(jié)核患者開展了抗結(jié)核藥物敏感性檢測，提高對結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的快速診斷迫在眉睫[1,4]。然而傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測方法已無法滿足臨床的實際需求，亟待在結(jié)核病高負擔國家使用和推廣新型診斷技術(shù)。近年來隨著分子生物學(xué)及免疫學(xué)的發(fā)展，涌現(xiàn)出一批結(jié)核病快速檢測產(chǎn)品和技術(shù)(見表1)[5～7]，本文就這些產(chǎn)品的主要研究應(yīng)用進展進行系統(tǒng)回顧。

表1 結(jié)核病診斷路徑(翻譯和修改于參考文獻[6]的圖1)

續(xù)表1

1 傳統(tǒng)病原學(xué)實驗室檢測

直接觀察到結(jié)核分枝桿菌或者分離到結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核診斷的重要方法，特別是痰涂片和痰培養(yǎng)在結(jié)核病防治歷程中發(fā)揮了重要的作用，然而受限于痰涂片的靈敏度以及痰培養(yǎng)時效性，限制了其在結(jié)核診斷中的應(yīng)用，如何充分發(fā)揮其優(yōu)勢服務(wù)臨床檢測是傳統(tǒng)病原學(xué)診斷的基礎(chǔ)。近年來結(jié)核特有的抗原也可作為結(jié)核診斷的重要標志物之一，其在特殊人群的應(yīng)用得到世界衛(wèi)生組織的認可和推薦，下面主要對四類技術(shù)進行系統(tǒng)介紹。

1.1痰涂片鏡檢 痰涂片鏡檢作為結(jié)核病診斷的主要手段，應(yīng)用時間已經(jīng)超過120年[8]。它操作相對簡單且對實驗室的要求較低，目前仍是許多結(jié)核病高負擔國家的主要診斷技術(shù)。大多數(shù)實驗室采用直接涂片聯(lián)合萋尼氏染色的方法。通過收集晨痰、夜痰和即時痰等方式提高患者發(fā)現(xiàn)率，但是由于需要多次往返醫(yī)療機構(gòu)，世界衛(wèi)生組織建議在醫(yī)院采集兩份質(zhì)量良好的痰標本也可滿足檢測要求。多種對涂片和染色方法的改進，包括離心集菌、熒光染色、添加漂白劑等，可以提高痰涂片的檢測靈敏度[9]。但是痰涂片檢測陽性的標本需要痰中菌的濃度達到10 000個結(jié)核桿菌/ml，對于含菌量較少的患者，如兒童結(jié)核、HIV/TB雙感、肺外結(jié)核患者，痰涂片診斷能力較差[10]。來自不同研究結(jié)果表明，痰涂片鏡檢在培養(yǎng)陽性的肺結(jié)核患者中的陽性率為20%～70%[11]，提示不同實驗室人員能力對于痰涂片鏡檢產(chǎn)生明顯的影響。痰涂片顯微鏡還有多項其他缺點，包括不能區(qū)分菌體的死活，不能區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌，無法開展后續(xù)的藥物敏感性試驗(以下簡稱藥敏試驗)等。因此，世界衛(wèi)生組織推薦采用快速的分子生物學(xué)方法作為痰涂片的替代方法用于結(jié)核病及耐藥結(jié)核病的患者篩查[12～14]。

1.2分枝桿菌培養(yǎng) 結(jié)核分枝桿菌最快分裂增殖速度為18 h一代，培養(yǎng)時長一般為2～6周，因此結(jié)核分枝桿菌的分離培養(yǎng)時間相比普通微生物耗時更長。此外，由于生物安全原因，分枝桿菌的培養(yǎng)需在生物安全Ⅱ級及以上級別實驗室才可以開展。在中低收入國家，一般在結(jié)核病參比實驗室開展培養(yǎng)，主要包括固體培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法(MGIT)兩種，從采集樣本至報告陽性培養(yǎng)結(jié)果，固體培養(yǎng)法一般需4～6周，而MGIT由于培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，可能提前到1～2周上報陽性結(jié)果[15]。我國大多數(shù)結(jié)核病實驗室使用羅氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)分枝桿菌，在結(jié)核病可疑癥狀者中陽性率為28%～34%，其所需時間較長，不利于早期發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核病患者和早期診斷耐藥肺結(jié)核病患者[16]。Brum等[17]評估了MGIT320診斷結(jié)核病的價值，在涂片陽性的患者中，固體培養(yǎng)和MGIT的報陽時間分別為17.3 d和8.8 d，在涂片陰性的患者中分別為24.1 d和13.2 d?？梢奙GIT診斷結(jié)核病陽性率更高，用時更短，在結(jié)核病早期診斷非常有效。

1.3藥敏試驗 表型藥敏試驗(phenotypic drug sensitivity test，PDST)是在含一定藥物濃度的固體培養(yǎng)基上接種一定數(shù)量的分枝桿菌，當分枝桿菌能在該培養(yǎng)基上生長時被界定為耐藥菌株，反之則定為敏感菌株。目前結(jié)核分枝桿菌PDST方法有絕對濃度法、固體比例法、液體藥敏法以及7H10或7H11瓊脂法。固體法藥敏試驗根據(jù)操作方法不同分為絕對濃度法和比例法，丁北川等[18]按照世界衛(wèi)生組織規(guī)定的絕對濃度法進行藥敏試驗，結(jié)果與比例法差異無統(tǒng)計學(xué)意義。劉宇紅等[19]研究表明比例法和國內(nèi)絕對濃度法結(jié)果存在明顯差異的藥物是異煙肼、乙胺丁醇，而濃度界限接近的利福平則差異不明顯，有差異的菌株最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)均在比例法和絕對濃度法濃度界限之間。說明兩種檢測方法之間主要差異是耐藥界限。液體藥敏試驗作為比例法藥敏試驗的一種，因培養(yǎng)和藥敏檢測到出報告的時間大大縮短，而被越來越多的實驗室采用。但液體藥敏試驗需專用設(shè)備和專用試劑，成本較高，因此，限制了液體藥敏方法的廣泛推廣，尤其是在中低收入國家或地區(qū)[7]。目前，世界衛(wèi)生組織推薦用于結(jié)核分枝桿菌藥敏檢測的方法中，可進行MGIT液體法藥敏的檢測藥物為11種，多于其他LJ固體法和7H10/7H11法。目前基于MGIT的液體藥敏是診斷二線抗結(jié)核藥物，特別是貝達喹啉、利奈唑胺等藥物耐藥性的核心方法。

1.4結(jié)核抗原檢測 脂阿拉伯糖(lipoarabinomannan,LAM)是分枝桿菌細胞壁脂多糖的組成成分，其核心骨架為甘露聚糖，側(cè)鏈為甘露糖、阿拉伯糖單位，分子以磷脂酰肌醇錨定在胞質(zhì)膜上，具有高免疫原性。具有免疫缺陷癥狀的HIV-TB共感染患者的尿液中可檢測到LAM抗原，使用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法或者TB-LAM檢測試紙條，這種檢測試紙條造價便宜且在30 min內(nèi)可以獲得結(jié)果[20,21]。在HIV-TB共感染、免疫缺陷(CD4<200個/μl)人群，其診斷結(jié)核病靈敏度超過70%[7]。Broger等[22]研究了檢測感染HIV患者使用便攜式的商業(yè)化LAM檢測試劑盒進行尿檢，發(fā)現(xiàn)改進后的SILVAMP-LAM在檢測CD4細胞數(shù)量≤100個/μl時靈敏度為87.1%(95%CI：79.3%～93.6%)，高于未改進的LF-LAM檢測方法，同時比較了感染HIV患者CD4細胞數(shù)量分布為≤100個/μl，101～200個/μl和>200個/μl時SILVAMP-LAM檢測靈敏度，發(fā)現(xiàn)在CD4≤100個/μl時靈敏度最高。世界衛(wèi)生組織推薦其用于HIV陽性住院患者有結(jié)核病癥狀，伴CD4≤100個/μl或者重癥HIV陽性患者[23]。

2 免疫學(xué)檢測

傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法效果有限，無法真正滿足臨床需求，基于宿主和病原相互作用的免疫學(xué)檢測技術(shù)在結(jié)核病輔助診斷中可能具有重要作用，傳統(tǒng)的檢測方法包括結(jié)核抗體、結(jié)核菌素皮膚試驗(TST)、γ干擾素釋放試驗(interferon-γ release assay,IGRA)等，其中后兩種方法對于區(qū)分潛伏感染和健康人群具有重要價值，近年來基于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的新型宿主診斷標志物的篩選和應(yīng)用為結(jié)核病免疫學(xué)診斷提供了新的思路，下面主要對此類技術(shù)進行介紹。

2.1結(jié)核抗體檢測 基于血液標本的活動結(jié)核診斷產(chǎn)品已應(yīng)用多年，特別是在結(jié)核病高負擔國家。世界衛(wèi)生組織于2008年對不同國家報送的19種結(jié)核病血清學(xué)快速診斷產(chǎn)品進行系統(tǒng)評估，結(jié)果表明，與痰培養(yǎng)相比，這些試劑盒在涂陽患者中檢測的靈敏度在1%～60%之間，特異度在53%～99%之間[24]。在涂陰患者和HIV陽性患者的靈敏度和特異度比涂陽患者平均低22%左右。后續(xù)的對抗體檢測方法的薈萃分析也表明這類檢測方法準確性偏低，因此，世界衛(wèi)生組織不建議將抗體檢測方法用于活動性結(jié)核的診斷[25]。盡管有學(xué)者認為這種靈敏度的差別是由于結(jié)核感染的不同階段分泌不同的蛋白從而產(chǎn)生不同抗體，并建議使用多種抗體的組合以提升試劑盒檢測的靈敏度，但是這種改良方法在提高靈敏度的同時，導(dǎo)致檢測特異度的顯著下降，因此，對基于抗體的免疫學(xué)診斷方法需要不斷的改進和優(yōu)化。

2.2TST 在IGRA出現(xiàn)前，TST一直是診斷潛伏感染及輔助診斷活動性結(jié)核病的金標準[26]。借助皮下注射結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株蛋白衍生物，觀察人體對其免疫應(yīng)答，從而判斷患者是否被結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群感染。早期使用的TST是牛型分枝桿菌的蛋白衍生物，因此無法有效區(qū)分卡介苗(BCG)接種與結(jié)核分枝桿菌感染造成的陽性結(jié)果。近來，出現(xiàn)了以人型結(jié)核分枝桿菌制備的蛋白衍生物，可以有效排除BCG接種造成的假陽性結(jié)果。但是TST對于部分特殊人群，包括營養(yǎng)不良和HIV感染引起的免疫抑制人群，容易由于免疫應(yīng)答不足造成假陰性的情況[27,28]。此外，注射方式及判讀結(jié)果等都可能影響最終的檢測結(jié)果，48～72 h后的判讀方式可能會影響TST在人群中的使用范圍。

2.3IGRA IGRA是近10余年新型的一種潛伏感染人群的免疫診斷方法。通過檢測受試者外周血中是否存在結(jié)核抗原特異性的記憶淋巴細胞，此方法能夠精準鑒定其結(jié)核感染狀態(tài)[29]。相比于TST，IGRA具有更高的特異性，可能區(qū)別結(jié)核自然感染和BCG疫苗誘發(fā)的細胞免疫反應(yīng)。然而其在臨床中使用的主要問題在于無法區(qū)分潛伏感染和活動性結(jié)核，因此，IGRA陽性結(jié)果不能作為活動性結(jié)核的確診標準[30]。盡管有研究表明結(jié)核抗原特異性的γ干擾素釋放水平隨著治療過程明顯下降，但是世界衛(wèi)生組織在相關(guān)指南中不建議在結(jié)核病高負擔國家診斷活動性結(jié)核，同時反對用于預(yù)測結(jié)核病患者的治療轉(zhuǎn)歸或者疫苗接種后的保護效力評價[31]。然而，IGRA對于部分菌陰結(jié)核、兒童結(jié)核等缺乏病原學(xué)依據(jù)的活動結(jié)核病患者的臨床診斷存在一定的價值。

2.4結(jié)核宿主反應(yīng) 結(jié)核感染人體后，宿主的免疫系統(tǒng)啟動一系列應(yīng)答反應(yīng)應(yīng)對結(jié)核分枝桿菌的入侵，尋找基于宿主特異性的診斷標志物成為解決菌陰結(jié)核診斷難題的突破口。多項研究利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法探究活動性結(jié)核患者全血細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，鑒定出干擾素誘導(dǎo)的多個基因標志物可用于診斷活動性結(jié)核，這些標志物僅在活動性結(jié)核患者中高表達，可有效排除健康人群及潛伏感染者[32]。一項小范圍的病例對照研究顯示，F(xiàn)CGR1B基因僅在活動性結(jié)核患者外周血中高表達，且與CD64、LTF、GBP5和GZMA四個基因聯(lián)合應(yīng)用時，對于活動性結(jié)核和潛伏感染者的鑒別診斷靈敏度和特異度分別達到94%和97%，具有良好的應(yīng)用前景[33]。此外，Kaforou和其合作者研究了活動性結(jié)核、潛伏感染和其他疾病的外周血轉(zhuǎn)錄組后，篩選獲得44個基因組成的標志物組合，在病原學(xué)陽性的結(jié)核病患者和其他患者的鑒別診斷中，其靈敏度為100%，特異度為96%[34]。上述結(jié)果均表明，基于宿主的免疫學(xué)診斷標志物將成為結(jié)核病診斷的重要組成部分[35]。結(jié)核-宿主免疫互作機制的深度挖掘和大隊列的臨床驗證將幫助我們建立診斷活動性結(jié)核的新方法。英國Berry等[36]學(xué)者應(yīng)用轉(zhuǎn)錄芯片技術(shù)對眾多結(jié)核患者血中393種轉(zhuǎn)錄因子水平進行系統(tǒng)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有86種轉(zhuǎn)錄因子水平在活動性結(jié)核與其他炎癥或感染性患者之間有明顯區(qū)別。美國斯坦福大學(xué)Sweeney團隊分析篩選了來自11個國家的14個獨立隊列的2 572例結(jié)核患者全血中結(jié)核感染相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個基因表達水平在活動性結(jié)核與其他患者之間有顯著不同。其中GBP5和DUSP3兩個因子在活動性結(jié)核患者中表達上調(diào)，而另一個KLF3表達則下調(diào)[37]。Warsinske等[38]進一步將這3個轉(zhuǎn)錄因子的表達因子相加減創(chuàng)建了一個3-基因結(jié)核分數(shù)(3-gene TB score),可以在臨床上用于隱匿性結(jié)核感染和活動性結(jié)核的鑒別診斷以及治療效果的快速準確監(jiān)測。賽沛Xpert MTB HR產(chǎn)品將這一技術(shù)移植到GeneXpert系統(tǒng)中，該試劑盒采用0.1 ml末梢或采集靜脈血，隨到隨測，可以在30 min完成檢測。結(jié)果直接應(yīng)用3個因子的CT值加減獲得，期望在結(jié)核病的快速篩查、鑒別診斷以及治療監(jiān)測上起到一定作用[39]。

3 基因檢測與分子耐藥檢測產(chǎn)品

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，使結(jié)核分枝桿菌的檢測、鑒定和藥敏試驗技術(shù)取得了很大的進展。分子生物學(xué)技術(shù)可特異性擴增結(jié)核分枝桿菌的目標基因，直接檢測痰液、支氣管肺泡灌洗液等樣本，快速得到檢測結(jié)果，極大縮短了結(jié)核病診斷時間，提高了結(jié)核病診斷的準確性和效率。目前應(yīng)用在結(jié)核分枝桿菌基因檢測與分子耐藥檢測方面的產(chǎn)品主要有實時PCR產(chǎn)品、等溫擴增產(chǎn)品和基因測序產(chǎn)品等(見表2)[40]。

表2 世界衛(wèi)生組織支持肺結(jié)核檢測和藥物敏感性檢測的分子檢測產(chǎn)品(翻譯和修改于參考文獻[40]的表1)

3.1實時定量PCR產(chǎn)品 實時定量PCR技術(shù)是通過熒光基團標記的特異性探針或分子信標對基因擴增產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)軟件對產(chǎn)物進行分析。與傳統(tǒng)的細菌學(xué)檢查相比，實時定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、檢測快、特異性強、可重復(fù)性好、可自動化且通量高等優(yōu)點。目前實時定量PCR主要用于臨床標本是否存在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及其對藥物的耐藥性，主要有賽沛的Xpert MTB/RIF、Xpert MTB/RIF Ultra、Xpert MTB/XDR產(chǎn)品，羅氏的Cobas TaqMan MTB產(chǎn)品，雅培的RealTime MTB和MTB RIF/INF產(chǎn)品，Hain公司的Genotype MTBDRplus、Genotype MTBDRsl、FluoroType MTBDR產(chǎn)品，BD公司的MAX-MDR-TB產(chǎn)品，廈門致善公司的MeltPro-TB產(chǎn)品等。

3.1.1 賽沛Xpert MTB/RIF產(chǎn)品 這是一種基于巢式實時熒光定量PCR方法，能自動進行核酸提取擴增檢測，可直接從痰液標本中檢測結(jié)核分枝桿菌及其對利福平的耐藥性，整個過程在密閉環(huán)境中進行，手動操作時間不超過1 min，對操作者和周圍環(huán)境安全，全程約110 min即獲得結(jié)果。在結(jié)核分枝桿菌檢測方面，Xpert MTB/RIF的靈敏度約為88%，特異度約為99%[40]；對涂片陽性、培養(yǎng)陽性患者有較高的敏感性(靈敏度為98.2%)，顯著高于涂片陰性、培養(yǎng)陽性患者(靈敏度為72.5%)[41]；在HIV陰性患者中靈敏度約為88%，HIV陽性患者中靈敏度約為81%，特異度在兩種人群中約為98%[42]。在57項利福平耐藥檢測研究中，其靈敏度約為96%，特異度約為98%[42]。在15項兒童肺結(jié)核研究中，與培養(yǎng)相比，其在咳痰或誘導(dǎo)痰樣本中檢測結(jié)核分枝桿菌的合并靈敏度和特異度分別為62%和98%；在胃液中合并靈敏度和特異度分別為66%和98%。相比涂片鏡檢，其檢測結(jié)核分枝桿菌的靈敏度提高了36%～44%。其在檢測利福平耐藥方面合并靈敏度和特異度分別為86%和98%[43,44]。Xpert MTB/RIF不僅在肺結(jié)核得到廣泛應(yīng)用，而且也可用于肺外結(jié)核病及非痰標本的結(jié)核分枝桿菌檢測和耐藥檢測。但其研究結(jié)果尚不一致，部分靈敏度欠佳，但其特異度較高，總體上顯示上較好的診斷效能[40,43,45]。

3.1.2 賽沛Xpert MTB/RIF Ultra產(chǎn)品 通過改進試劑盒設(shè)計、PCR和突變檢測，提高對低細菌負荷肺疾病和肺外疾病的結(jié)核患者檢出率和改善利福平耐藥檢測，同時檢測時間縮短為80 min。在結(jié)核分枝桿菌檢測方面，Ultra比MTB/RIF更靈敏(88% vs 83%)，但特異度略差(98% vs 96%)；在利福平耐藥方面，兩者的靈敏度和特異度是相似的，分別為95%和98%。在痰標本中，Ultra的靈敏度為87.5%，而MTB/RIF為81%；在痰涂片陰性Ultra靈敏度為78.9%，MTB/RIF為66.1%，兩者的特異度均為98.7%，且兩者在利福平耐藥性檢測結(jié)果一致[42,46]。世界衛(wèi)生組織在全球結(jié)核病報告中強烈推薦了Xpert MTB/RIF和Ultra技術(shù)的臨床應(yīng)用。Xpert MTB/RIF和Ultra被強烈推薦作為有肺結(jié)核癥狀和體征的成人及兒童的初始檢測；在有肺結(jié)核體征和癥狀或胸片存在肺部異常或兩者兼有的普通成人中被推薦作為肺結(jié)核初始檢測；被推薦作為有肺結(jié)核癥狀和體征的成人和兒童的重復(fù)檢測；被推薦作為成年人和兒童懷疑MDR-TB感染或并發(fā)HIV感染的首選檢測方法，從而替代傳統(tǒng)的涂片鏡檢、培養(yǎng)和藥物試驗方法；被推薦對疑似肺外結(jié)核患者的肺外標本如腦脊液、淋巴結(jié)和其他組織進行檢測；還被推薦用于痰標本鏡檢的后續(xù)檢測，特別是對于痰涂片檢測陰性的患者[1,47]。

3.1.3 賽沛Xpert MTB/XDR產(chǎn)品 它可檢測對異煙肼(靶基因：inhA啟動子、katG、fabG1、aphC-oxyR基因間區(qū))、乙氧酰胺(inhA啟動子)、氟喹諾酮類(gyrA和gyrB)以及二線注射藥阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素(rrs和eis啟動子)的耐藥性，并被定位為MTB/RIF或Ultra檢測到利福平耐藥患者的附加檢測。在結(jié)核分枝桿菌陽性痰標本與臨床分離株中，以PDST為參考標準，異煙肼檢測耐藥性的靈敏度和特異度分別為98.3%和95%；氟喹諾酮類耐藥性的靈敏度和特異度分別為91.4%和98.5%；阿米卡星耐藥性的靈敏度和特異度分別為91%和99%；卡那霉素耐藥性的靈敏度和特異度分別為98.1%和97%；卷曲霉素耐藥性的靈敏度和特異度分別為70%和99.7%；乙氧酰胺耐藥性的靈敏度和特異度分別為65.4%和97.3%。當以測序結(jié)果為參考標準時，其靈敏度為：異煙肼99.7%，氟喹諾酮類97.5%，阿米卡星100%，卡那霉素96.5%，卷曲霉素94.1%，乙氧酰胺88.5%；除了乙氧酰胺特異度為97.3%，其他藥物的特異度均為100%[48,49]。Xpert MTB/XDR旨在作為結(jié)核分枝桿菌陽性標本的反射試驗，并作為診斷結(jié)核分枝桿菌/廣泛耐藥結(jié)核中存在的主要耐藥類型的輔助診斷。為應(yīng)對全球耐多藥結(jié)核病危機和加快診斷，世界衛(wèi)生組織確定擴大快速檢測和檢測耐藥結(jié)核病是當務(wù)之急。獲得快速、敏感和安全的基因型檢測方法，如Xpert MTB/RIF、Ultra和Xpert MTB/XDR，這些方法通過識別已知的突變來檢測大多數(shù)臨床菌株對一線和二線藥物的抗藥性，將最大限度地減少生物危害，并將樣品制備減少到幾個手動步驟，更便于在護理點使用。當與Xpert MTB/RIF或Ultra聯(lián)合使用時，Xpert MTB/XDR可將結(jié)核病檢測和耐藥性檢測擴展到醫(yī)療服務(wù)不足的人群[50]。

3.1.4 羅氏Cobas TaqMan MTB產(chǎn)品 這是一種基于實時定量PCR技術(shù)、針對16S RNA基因的高通量檢測試劑盒。由于標本需要用NALC-NaOH進行液化、去污和濃縮，容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。與培養(yǎng)方法相比，該產(chǎn)品在呼吸道標本中的靈敏度為88.4%，特異度為98.8%；非呼吸性標本中靈敏度為63.6%，特異度為94.6%[51,52]。

3.1.5 雅培RealTime MTB和MTB RIF/INF產(chǎn)品

RealTime MTB也是一種基于實時定量PCR的檢測方法，可與全自動DNA提取平臺接口，可以從痰或支氣管肺泡灌洗液中檢測結(jié)核分枝桿菌。9項研究發(fā)現(xiàn)其在檢測結(jié)核分枝桿菌的合并靈敏度為96%，特異度為97%。4項研究表明雅培MTB RIF/INF產(chǎn)品對利福平和異煙肼的合并靈敏度為88%，合并特異度為99%，同時未發(fā)現(xiàn)偏倚[53]。

3.1.6 Hain公司Genotype MTBDRplus、Genotype MTBDRsl、FluoroType MTBDR產(chǎn)品 Hain公司的Genotype MTBDRplus產(chǎn)品是基于PCR-線性探針雜交技術(shù)，檢測結(jié)核分枝桿菌及其異煙肼和利福平耐藥性的分子診斷試劑盒。多個研究表明其對利福平與異煙肼的靈敏度分別為83.4%、94.6%，特異度分別為99.6%、98.2%，而Xpert MTB/RIF對利福平的靈敏度和特異度更高，分別為96.8%和98.4%[54]。Genotype MTBDRsl產(chǎn)品是一種用于檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體中與氟喹諾酮類和二線注射藥物耐藥相關(guān)的特異突變檢測試劑盒。多項研究發(fā)現(xiàn)其在氟喹諾酮耐藥性方面性能：直接檢測，其靈敏度和特異度分別為97%和98%；涂陽標本：80%和100%。二線注射藥物方面：直接檢測，其靈敏度和特異度分別為89%和90%；涂片陽性標本：80%和100%。廣泛耐藥結(jié)核病：直接檢測，其靈敏度和特異度分別為79%和97%；涂片陽性標本：50%和100%[55]。FluoroType MTBDR產(chǎn)品在涂片陽性和涂片陰性標本中檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物的靈敏度分別為98%和92%。涂片陰性標本對利福平耐藥的靈敏度和特異度分別為100%和97%；異煙肼耐藥性的靈敏度和特異度分別為100%和98%；耐多藥結(jié)核病的靈敏度和特異度分別為100%和100%。同時能鑒定rpoB、katG和inhA啟動子突變的靈敏度分別為98%、97%和97%。該產(chǎn)品可用于利福平和異煙肼的快速藥敏試驗，此外能同時識別rpoB、katG和inhA啟動子中幾乎所有突變的能力，可能對個體化治療有用[56]。

3.1.7 BD公司MAX-MDR-TB產(chǎn)品 這是一款檢測臨床標本中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物并同時檢測異煙肼和利福平耐藥性的分子平臺。與培養(yǎng)相比，該產(chǎn)品的總體靈敏度和特異度分別為86.6%和100.0%；涂片陽性和涂片陰性標本的靈敏度分別為100%和64.5%。與PDST相比，異煙肼和利福平耐藥的靈敏度和特異度分別為58.3%、99.3%和100%、98.2%；與Genotype MTBDRplus相比，異煙肼和利福平耐藥的靈敏度和特異度分別為100%、99.4%和100%、99.4%[57,58]。

3.1.8 廈門致善公司MeltPro-TB產(chǎn)品 這是一種基于熔融曲線分析的實時PCR檢測方法，有結(jié)核分枝桿菌檢測和利福平、異煙肼、鏈霉素和氟喹諾酮等耐藥突變檢測等多種產(chǎn)品。耐藥檢測產(chǎn)品可檢測痰標本的耐多藥和廣泛耐藥，以PDST為參考標準，該產(chǎn)品檢測利福平耐藥的靈敏度為94.2%，異煙肼耐藥的靈敏度為84.9%；二線藥物耐藥氧氟沙星靈敏度為83.3%，阿米卡星耐藥的靈敏度為75.0%，卡那霉素耐藥靈敏度為63.5%?？傮w而言，MeltPro-TB法檢測耐多藥結(jié)核分枝桿菌和廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌具有良好的性能，其靈敏度分別為86.7%和71.4%[59]。鏈霉素耐藥突變檢測產(chǎn)品在臨床菌株種的檢測靈敏度和特異度分別為88.8%和95.8%[60]。在疑似脊柱結(jié)核的患者中，MeltPro-TB檢測結(jié)核分枝桿菌的靈敏度為57.68%，高于培養(yǎng)法(51.72%)和涂片法(24.45%)，但顯著低于Xpert MTB/RIF(85.27%)[61]。MeltPro-TB法業(yè)已作為我國檢測耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核病例的可選擇方法。

3.2等溫擴增產(chǎn)品 等溫擴增技術(shù)基于其獨特的擴增原理，其靈敏度高但特異度相對較低，對防污染措施要求嚴格，其自動化程度越高，檢測結(jié)果可信度越高。常見的等溫擴增技術(shù)有環(huán)介導(dǎo)核酸等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、交叉引物擴增技術(shù)(cross primer amplification,CPA)等。LAMP的特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下保溫30～60 min，即可完成核酸擴增反應(yīng)。CPA可在恒定的溫度條件下，通過特殊設(shè)計的引物和探針，高效擴增指定的目標核酸。與常規(guī)PCR相比，恒溫擴增技術(shù)不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程。LAMP和CPA是全新的核酸擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的優(yōu)點，主要用于檢測臨床標本中是否存在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。

3.2.1 TB-LAMP產(chǎn)品 日本榮研株式會社TB-LAMP產(chǎn)品是利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，快速、高效、特異性檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群新型分子診斷產(chǎn)品。在375例結(jié)核培養(yǎng)陽性痰標本中，TB-LAMP檢出率為75.6%，其中涂陽肺結(jié)核樣本檢出率為97.9%，痰涂片陰性結(jié)核樣本檢出率為46.6%。477例未接受結(jié)核病治療的培養(yǎng)陰性受試者特異度為98.7%[62]。另一項研究發(fā)現(xiàn)以培養(yǎng)作為參考標準時，TB-LAMP的總體靈敏度為99%，特異度為94%，而Xpert MTB/RIF靈敏度和特異度更高，分別為99.1%和96%，說明TB-LMAP有較高的靈敏度和特異度[63]。世界衛(wèi)生組織推薦TB-LAMP或許可替代顯微鏡檢查(有條件推薦)，以幫助診斷有結(jié)核病癥狀和體征的成人肺結(jié)核。對于有肺結(jié)核癥狀和體征的成人，特別是痰涂片陰性標本需要進一步檢測時，或許也可考慮作為顯微鏡檢查的后續(xù)檢查[13]。但TB-LAMP不能代替快速分子試驗來檢測TB和利福平耐藥，尤其是MDR-TB高危人群[13]。

3.2.2 DeFast.TB產(chǎn)品 廣州迪澳公司的DeFast.TB結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑采用恒溫擴增法。在初診肺結(jié)核患者中其檢出率為48.4%，高于涂片法；對涂陽患者的總檢出率為90.2%，對涂陰患者的檢出率為15.4%[64]。

3.2.3 EasyNAT TB-CPA產(chǎn)品 優(yōu)思達的EasyNAT TB-CPA產(chǎn)品是基于交叉引物恒溫擴增技術(shù)，檢測結(jié)核分枝桿菌DNA試劑盒，用于結(jié)核分枝桿菌感染的輔助診斷。研究發(fā)現(xiàn)與培養(yǎng)法相比，該產(chǎn)品的靈敏度為66.7%，對涂片陰性和培養(yǎng)陽性患者的靈敏度僅為10%，對培養(yǎng)陽性患者的特異度為100%[65]。在結(jié)核性淋巴結(jié)炎兒童中，以培養(yǎng)和(或)細胞學(xué)綜合參考標準，Xpert-MTB/RIF和EasyNAT的靈敏度和特異度分別為58%和93%、19%和100%[66]。

3.3基因測序分析 基因測序是通過對結(jié)合分枝桿菌的靶標基因中基因序列的測定，并與國際核酸數(shù)據(jù)庫中的標準序列進行比對，實驗對結(jié)合分枝桿菌及其耐藥性的精準檢測，目前主要用于分枝桿菌病原菌的耐藥檢測和菌種鑒定。應(yīng)用于結(jié)核檢測方面的測序分析主要有Sanger測序、焦磷酸測序、二代測序(next-generation sequencing,NGS)等。

3.3.1 Sanger測序 這是根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進行熒光標記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的聚丙烯酰胺凝膠上電泳進行檢測，從而獲得可見DNA堿基序列的一種方法。Sanger測序是最為經(jīng)典的一代測序技術(shù)，目前仍是獲取核酸序列最為常用的方法。與DST方法相比，Sanger測序在耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核中檢出率分別為84.31%和83.33%，其中利福平、異煙肼和氟喹諾酮耐藥性的靈敏度和特異度分別為96.92%和98.35%、86.89%和99.20%、77.5%和97.26%[67]。同時Sanger測序法也用于結(jié)核耐藥表型結(jié)果和基因結(jié)果不一致時確認[68]。

3.3.2 焦磷酸測序 這是利用引物鏈延伸時所釋放的焦磷酸基團激發(fā)熒光，通過峰值高低判斷與其相匹配的堿基數(shù)量。由于使用了實時熒光監(jiān)測的概念，焦磷酸測序?qū)崿F(xiàn)了對特定位點堿基負荷比例的定量，因此在SNP位點檢測、等位基因(突變)頻率測定、細菌和病毒分型檢測方面應(yīng)用廣泛。通過16S rRNA焦磷酸測序檢測肺結(jié)核患者痰液標本，發(fā)現(xiàn)其中的微生物群比健康人多，且發(fā)現(xiàn)許多外來細菌，如狹養(yǎng)單胞菌、銅綠假單胞菌、嗜熱菌、鞘氨醇單胞菌、甲基桿菌、發(fā)汗桿菌、單胞菌和運動菌等，這些細菌都是肺結(jié)核患者特有的[69]。用16S rRNA焦磷酸測序法檢測了結(jié)核病感染患者的痰菌群發(fā)現(xiàn)硬壁菌、蛋白細菌、擬桿菌、放線桿菌和梭桿菌是五大細菌門，它們共同構(gòu)成了98%以上的微生物群落。結(jié)核標本中蛋白質(zhì)細菌和類桿菌較多，對照組中硬壁菌更為突出。在所有結(jié)核病標本中均發(fā)現(xiàn)放線菌、梭桿菌、瘦肉桿菌、普雷沃特菌、鏈球菌和維管束菌，可能代表了結(jié)核痰菌群的核心屬。用高通量焦磷酸化測序技術(shù)分析了結(jié)核病患者痰中微生物群的組成和多樣性。它為研究不同微生物群在結(jié)核病發(fā)病和發(fā)展中的潛在作用奠定了框架，并最終促進了結(jié)核病治療的進展[70]。

3.3.3 NGS 其最大特征是通量高，可測定幾百萬甚至上億條DNA或者RNA序列，大大加快了宏基因組測序的速度，從而可以極大地降低單個堿基測序的成本。NGS還提供了更大的檢測能力，通過深度測序發(fā)現(xiàn)新的或罕見的變體。NGS診斷傳染病的靈敏度和特異度分別為50.7%和85.7%，優(yōu)于培養(yǎng)法，尤其對結(jié)核分枝桿菌診斷優(yōu)勢比達到4，但也存在假陽性結(jié)果，可能是定植、潛在感染等原因?qū)е耓71]。同時NGS更多應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性測定，為指導(dǎo)耐藥結(jié)核病合理治療提供準確的依據(jù)。通過NGS獲得的數(shù)據(jù)使得檢測結(jié)核分枝桿菌遺傳變異的能力無與倫比，通過對數(shù)據(jù)的分析有助于重建結(jié)核分枝桿菌的系統(tǒng)發(fā)育，這有助于我們更好地了解結(jié)核分枝桿菌的全球分布[72]。NGS已被用來解答有關(guān)結(jié)核病傳播的問題，并將在不久的將來成為結(jié)核分枝桿菌分型的常規(guī)方法，因為它比傳統(tǒng)的分型方法具有更高的分辨率。NGS的高分辨率能夠區(qū)分結(jié)核的復(fù)發(fā)和再感染[73]。這對于準確評估治療和預(yù)防方案至關(guān)重要。NGS已被用于了解結(jié)核高負荷環(huán)境下的傳播動力學(xué)，證明了這種方法在確定高負荷環(huán)境下結(jié)核分枝桿菌傳播動力學(xué)方面確實具有最大的影響[74,75]。NGS分析得出一線和二線藥物的易感結(jié)果，這些數(shù)據(jù)也可能是了解各國結(jié)核病流行病學(xué)的寶貴資源。NGS已成功地用于烏干達的一項耐藥性調(diào)查，該調(diào)查使用NGS分析了一小部分對異煙肼和利福平具有表型抗性的菌株，以嘗試了解耐藥性的程度。隨著技術(shù)的迅速發(fā)展，NGS的成本繼續(xù)下降。然而，這項技術(shù)仍然昂貴，而且對于高負擔、低收入的環(huán)境來說是不可能的。預(yù)計在不久的將來，結(jié)核分枝桿菌NGS將適用于低收入、高負擔的環(huán)境中，用于定期進行耐藥性監(jiān)測，以了解耐藥機制，并為設(shè)計更廉價的分子診斷提供依據(jù)[76,77]。

4 總結(jié)與展望

結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及其耐藥性檢查等表型方法技術(shù)仍然是結(jié)核病診斷中的金標準。但由于其操作復(fù)雜、周轉(zhuǎn)時間冗長、生物安全要求比較高等難以在結(jié)核病診療中發(fā)揮主導(dǎo)作用。分子生物學(xué)技術(shù)以及宿主反應(yīng)檢測具有快速敏感的特點，但特異性有待提高(見表3)[6]。在研發(fā)中的一系列結(jié)核病的新技術(shù)方法中，以定性或定量檢測感染后的結(jié)核病原體以及宿主反應(yīng)的代謝產(chǎn)物的代謝質(zhì)譜技術(shù)值得關(guān)注[78]。2014年Choi等[79]教授應(yīng)用Gas Isotope Ratio質(zhì)譜技術(shù)建立呼吸實驗快速測定異煙肼藥物的敏感性。來自南非的Mahapatra等[80]利用液相質(zhì)譜方法檢測患者尿液中特異代謝產(chǎn)物去早期判斷治療效果。來自巴西的學(xué)者[81]采用基于質(zhì)譜的代謝組學(xué)技術(shù)檢測并鑒別敏感、多重和廣泛耐藥結(jié)核菌落。這一系列結(jié)果提示組學(xué)技術(shù)檢測結(jié)核菌感染后代謝產(chǎn)物可能成為結(jié)核感染診斷以及治療效果監(jiān)測的新興重要技術(shù)。

表3 開發(fā)能夠滿足需求的創(chuàng)新結(jié)核病技術(shù)的轉(zhuǎn)化挑戰(zhàn)(翻譯和修改于參考文獻[6]的表3)